抑肝散加陈皮半夏和白术内酯 III改善嗅球切除小鼠的记忆

摘要：阿尔茨海默病 (AD) 显示认知功能障碍作为核心症状和痴呆症 (BPSD) 的行为和心理症状。由于源自隔膜的乙酰胆碱神经系统在 AD 患者中塌陷，我们使用了嗅球切除 (OBX) 小鼠，其胆碱能系统在隔膜中严重受损。最近，日本传统汉方药物 抑肝散加陈皮半夏 (YKH) 已用于 BPSD，此外还可以改善 AD 患者的认知功能障碍。然而，认知和 BPSD 改善的基本组成部分及其机制在很大程度上是未知的。在本研究中，我们发现白术内酯 III (Aen-III) 是 YKH 的成分之一，可改善 OBX 小鼠的认知缺陷和抑郁症。OBX 小鼠每天口服 Aen-III（1.0 和 3.0 mg/kg）和 YKH 提取物，持续 18 天。与 YKH 提取物一样，Aen-III 治疗改善了在 OBX 小鼠中观察到的认知缺陷和抑郁样行为。重要的是，Aen-III 给药显着恢复了 Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶 II (CaMKII) 自磷酸化和 Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶 IV (CaMKIV) 和环 AMP 反应元件结合蛋白 (CREB) 磷酸化的降低。CaMKII 和 CaMKIV 信号的恢复与 BDNF 水平的升高密切相关。此外，通过 Aen-III (3.0 mg/kg) 和 YKH (1000 mg/kg) 处理挽救了 OBX 小鼠的 ATP 减少。总之，Aen-III 作为 YKH 的一个组成部分，通过恢复 CaMKII 和 CaMKIV 信号传导来改善认知功能障碍和抑郁症。重要的是，Aen-III 给药显着恢复了 Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶 II (CaMKII) 自磷酸化和 Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶 IV (CaMKIV) 和环 AMP 反应元件结合蛋白 (CREB) 磷酸化的降低。CaMKII 和 CaMKIV 信号的恢复与 BDNF 水平的升高密切相关。此外，通过 Aen-III (3.0 mg/kg) 和 YKH (1000 mg/kg) 处理挽救了 OBX 小鼠的 ATP 减少。总之，Aen-III 作为 YKH 的一个组成部分，通过恢复 CaMKII 和 CaMKIV 信号传导来改善认知功能障碍和抑郁症。重要的是，Aen-III 给药显着恢复了 Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶 II (CaMKII) 自磷酸化和 Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶 IV (CaMKIV) 和环 AMP 反应元件结合蛋白 (CREB) 磷酸化的降低。CaMKII 和 CaMKIV 信号的恢复与 BDNF 水平的升高密切相关。此外，通过 Aen-III (3.0 mg/kg) 和 YKH (1000 mg/kg) 处理挽救了 OBX 小鼠的 ATP 减少。总之，Aen-III 作为 YKH 的一个组成部分，通过恢复 CaMKII 和 CaMKIV 信号传导来改善认知功能障碍和抑郁症。Aen-III 给药显着恢复了 Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶 II (CaMKII) 自磷酸化和 Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶 IV (CaMKIV) 和环 AMP 反应元件结合蛋白 (CREB) 磷酸化的降低。CaMKII 和 CaMKIV 信号的恢复与 BDNF 水平的升高密切相关。此外，通过 Aen-III (3.0 mg/kg) 和 YKH (1000 mg/kg) 处理挽救了 OBX 小鼠的 ATP 减少。总之，Aen-III 作为 YKH 的一个组成部分，通过恢复 CaMKII 和 CaMKIV 信号传导来改善认知功能障碍和抑郁症。Aen-III 给药显着恢复了 Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶 II (CaMKII) 自磷酸化和 Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶 IV (CaMKIV) 和环 AMP 反应元件结合蛋白 (CREB) 磷酸化的降低。CaMKII 和 CaMKIV 信号的恢复与 BDNF 水平的升高密切相关。此外，通过 Aen-III (3.0 mg/kg) 和 YKH (1000 mg/kg) 处理挽救了 OBX 小鼠的 ATP 减少。总之，Aen-III 作为 YKH 的一个组成部分，通过恢复 CaMKII 和 CaMKIV 信号传导来改善认知功能障碍和抑郁症。

关键词

抑肝散加陈皮半夏,白术内酯 III ,嗅球 切除 小鼠, CaMKII , BDNF

一、简介

阿尔茨海默病 (AD) 是一种进行性神经退行性疾病，其导致认知障碍作为核心症状和抑郁症和攻击性行为作为痴呆症的行为和心理症状 (BPSD) [ 1 ]。在 AD 患者中，乙酰胆碱神经元的下调是中枢神经系统 (CNS) 的致病病理，通过乙酰胆碱酯酶抑制剂（如多奈哌齐和卡巴拉汀）治疗改善临床症状证实了这一点 [ 2 ]。据报道，AD 患者有嗅觉系统障碍 [ 3 ] - [ 6] . 嗅球由来自隔膜的乙酰胆碱神经支配，嗅球切除术 (OBX) 会导致隔膜胆碱能神经元的逆行神经损伤 [ 7 ]。因此，从隔膜到大脑皮层和海马的乙酰胆碱神经投射也受损，从而导致认知障碍 [ 8 ] [ 9 ] 和抑郁 [ 10 ]。我们用OBX小鼠作为AD模型来验证AD药物对认知和BPSD的改善作用[ 11 ][ 12 ]。

抑肝散加陈皮半夏 (YKH) 是日本传统草药（也是汉方药），传统上用于治疗神经衰弱、癔症、失眠、更年期神经症和小儿癫痫 [ 13 ]。YKH由白术、当归、柴胡、温州陈皮、蛇床子、甘草、茯苓、半夏、钩藤组成。最近，Yokukansan 在阿尔茨海默病患者 [ 14 ] 和脑血管性痴呆模型大鼠 [ 15 ] 中也具有抗 BPSD 的临床疗效。同样，YKH 改善了记忆功能障碍，这是该大鼠 AD 的核心症状 [ 16] . 最近，据报道，白术（Atractylodis rhizome）的成分白术内酯 III（Aen-III）在大鼠慢性高剂量同型半胱氨酸给药后具有改善学习和记忆功能障碍的作用 [ 17 ]。Aen-III 通过增强 PKC 的磷酸化和抑制 ROS 水平和 caspase-3 活性发挥作用，表明 Aen-III 可能对认知功能障碍具有治疗潜力。

因此，我们在这里研究了口服 Aen-III 是否可以改善 OBX 小鼠的认知障碍和抑郁症。我们还阐明了 OBX 认知改善的机制。

2。材料和方法

2.1。动物

8 周的成年雄性 DDY 小鼠购自 Nippon SLC (Hamamatsu, Japan)，并在恒温 (23˚C ± 1˚C) 和湿度 (55% ± 5%) 的条件下饲养在笼子中， 12 小时光/暗循环（光照；09:00-21:00 h），可以自由获取食物和水。所有使用动物的实验程序均经东北大学动物实验委员会批准。

2.2. 手术及药物治疗图

OBX 小鼠的制备方法如前所述 [ 7 ] [ 8 ]。在两周的恢复期后，每天给药一次，持续18天，然后对小鼠进行行为测试，随后进行解剖，如图1所示。为获得YKH粉，白术4克、当归3克、柴胡2克、温州皮3克、蛇床子3克、甘草1.5克、茯苓4克、半夏5克、钩藤3克。用热水混合萃取，然后喷雾干燥得到5g YKH

图 1。实验方案。OBX手术后两周，每天给药一次，持续18天。从第 28 天起，对小鼠进行行为测试。在第 32 天，完成行为测试，处死小鼠并解剖海马 CA1 区域进行蛋白质印迹。

粉末提取物。Aen-III（Wako，Osaka，Japan）溶解在玉米油（Wako，Osaka，Japan）中并以两种剂量（1.0 和 3.0 mg/kg，体积为 0.5 mL/100g 体重）口服给药。悬浮 YKH在 0.5% 羧甲基纤维素 (CMC) 中，以 0.5 mL/100g 体重的体积以 1000 mg/kg 口服给药。1000 mg/kg 的 YKH 给药等于 130 µg/kg Aen-III。用相同体积的悬浮液处理假手术小鼠。

2.3. Y迷宫任务

短期空间参考记忆和注意力通过 Y 迷宫中的自发交替行为进行评估，如所述 [ 18 ]。该装置由三个相同的臂（长 50 厘米，宽 16 厘米，高 32 厘米）组成，由黑色有机玻璃制成。每只老鼠被放在一只手臂的边缘，并允许在 8 分钟的时间内自由移动穿过迷宫。交替被定义为连续选择进入所有三个臂。最大交替次数定义为武器进入总数减2，交替百分比计算为实际交替/最大交替×100。此外，会议期间的手臂进入总数也被确定为运动活动的指标。

2.4. 新物体识别任务

通过新的对象识别任务评估长期和认知记忆。连续 2 天使小鼠单独习惯于露天盒子 (35 cm × 25 cm × 35 cm)。实验者评分行为对治疗不知情。新任务的评估如描述 [ 18] . 在采集阶段，将两个相同材料的物体放置在测试室中，让小鼠探索它们 10 分钟。24小时后，将其中一个物体替换为新物体，让小鼠探索5分钟。分析了探索行为。每次会议结束后，用 75% 乙醇彻底清洁物体以防止气味识别。对物体的探索被定义为抬起物体或在小于 1 厘米的距离内嗅它，用鼻子触摸它，或两者兼而有之。通过比较探索性接触与熟悉和新奇物体之间的差异以及接触总数来评估对空间新颖性的区分，这使得调整总探索性接触的差异成为可能。

2.5. 逐步被动回避任务

逐步被动回避任务是评估长期记忆的一种范式，如所述 [ 18] . 被动回避任务的训练和保留试验在一个由暗 (25 × 25 × 25 cm) 和轻 (14 × 10 × 25 cm) 隔间和不锈钢棒地板组成的盒子中进行。黑暗隔间中的地板棒连接到电子刺激器（Nihon Kohden，Tokyo，Japan）。小鼠在被动回避获得前一天习惯了该装置。在训练试验中，小鼠被放置在光照室中。进入黑暗的隔间，关上门，电击（0.3 mA，2 秒）被传送到网格地板，30 秒后将老鼠从设备中取出。在测试试验中，24 小时后，将小鼠置于光照室中并记录步进潜伏期，直到 300 秒过去以评估保留水平。

2.6. 尾悬挂任务

在悬尾任务中，根据 Steru 等人描述的方法测量不动时间的持续时间。[ 19 ]。在这个测试中，老鼠被悬挂在地板上方 50 厘米处，通过用胶带连接到尾架上。在 10 分钟内记录不动时间。只有当老鼠被动地悬挂并保持完全不动时，它们才被认为是不动的。

2.7. 蛋白质印迹分析

将动物斩首后，取出大脑并解剖背侧海马 CA1 区域的组织，在液氮中冷冻并储存在 -80˚C。对于蛋白质印迹分析，冷冻组织在含有 50 mM Tris-HCl、pH 7.4、0.5% Triton X-100、4 mM EGTA、10 mM EDTA、1 mM Na 3 VO 4的 150 μL 缓冲液中均质化, 40 mM 焦磷酸钠, 50 mM NaF, 100 nM calyculin A, 50 μg/ml leupeptin, 25 μg/ml pepstatin A, 50 μg/ml 胰蛋白酶抑制剂和 1 mM 二硫苏糖醇。通过以 20,400 g 离心 10 分钟去除不溶性物质。使用 Bradford 法测定蛋白质浓度，将样品在 Laemmli 样品缓冲液中煮沸 3 分钟，将等量的蛋白质在十二烷基硫酸钠 (SDS)-聚丙烯酰胺凝胶上电泳，然后转移到 Immobilon 聚偏二氟乙烯膜上，在 70 V 电压下放置 2 小时。在室温下用含有 5% 脱脂奶粉的 Tris 用 Tween 20 缓冲盐水 (TTBS) 溶液 (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1% Tween20) 封闭 1 小时后，将膜孵育使用以下抗体在 4˚C 过夜：抗磷酸化 CaMKII (1:5000; [ 20] )、抗 CaMKII (1:5000; [ 20] )、抗磷酸化 CaMKIV (Thr196) (1:1000; Santa Cruz Biotechnology)、抗 CaMKIV (1:1000; Santa Cruz Biotechnology)、抗磷酸化 CREB ​​(Ser133) (1:1000; Millipore)、抗 CREB（1:1000；Millipore）、抗 BDNF（1:500；Santa Cruz Biotechnology）、抗 β-微管蛋白（1:5000；Sigma-Aldrich）。由于单个总蛋白和磷酸化蛋白抗体以相同的分子量标记并通过免疫相同的动物产生，因此将相同样品和等量蛋白质进行电泳和转移的不同膜与各自的抗体一起温育。我们确认通过 β-微管蛋白的定量将相同数量的蛋白质转移到膜上。洗完后，将膜与稀释在 TTBS 溶液中的适当辣根过氧化物酶偶联二抗在室温下孵育 60 分钟。印迹使用 ECL 免疫印迹检测系统 (Amersham Biosciences) 显影并在 X 射线胶片 (Fuji Film, Tokyo, Japan) 上显现。扫描放射自显影胶片以进行光密度分析（Lasergraphics，Irvine，CA，USA）并使用 Image Gauge 版本 3.41（Fuji Film）进行定量。

2.8. ATP 检测

解剖海马区域并在液氮中快速冷冻并储存在-80°C直至使用。根据制造商的方案，使用 ATP 检测试剂盒（Toyo Ink，Tokyo，Japan）测量海马提取物中的 ATP 含量。简而言之，冷冻海马样品在匀浆缓冲液（0.25 M 蔗糖，10 mM HEPES-NaOH，pH 7.4）中匀浆，并在 4°C 下以 1000 g 离心 10 分钟。收集上清液并在室温下与提取缓冲液混合，30分钟后，将荧光素缓冲液加入每个样品中。使用光度计（Gene Light 55，Microtec，Funabashi，Japan）检测氧化荧光素。

2.9。统计评估

图中的所有值均表示为平均值±SEM。使用单向方差分析 (ANOVA) 确定组间的显着差异，然后对所有实验进行 Dunnett 检验。p < 0.05 表示有统计学意义的差异。

3. 结果

3.1。YKH 和 Aen-III 给药改善了 OBX 小鼠的认知缺陷和抑郁样行为

我们首先询问 YKH 和 Aen-III 给药是否改善了在 OBX 小鼠中观察到的记忆功能障碍和抑郁症。在 Y-mazetask 中，与假手术小鼠相比，载体治疗的 OBX 小鼠的交替百分比显着降低（假手术对照组：73.9% ± 2.0%，n = 5；OBX：48.9% ± 4.9%，n = 7） arm条目总数的变化（图2（a）和图2（b））。与载体处理的 OBX 小鼠相比，在 OBX 小鼠中口服 YKH 1000 mg/kg 和 Aen-III 1.0、3.0 mg/kg 显着提高了交替百分比（OBX YKH：69.6% ± 1.7%，n = 8；OBX Aen -III 1.0 mg/kg：66.4% ± 3.9%，n = 8；OBX Aen-III 3.0 mg/kg：75.5% ± 4.5%，n = 8)（图 2 (b)）。

我们还执行了新的对象识别任务来评估认知功能 [ 21 ]。在一次培训中，各组之间的辨别指数没有显着差异（图2（c））。在试验和测试会话之间的 24 小时保留间隔后，载体处理的 OBX 小鼠未能区分熟悉的和新的物体（图 2（d））。在相同条件下，给予Aen-III（1.0, 3.0 mg/kg）和YKH（1000 mg/kg）后，OBX小鼠降低的辨别指数显着恢复（图2（d））。

我们通过逐步被动回避任务评估上下文记忆。在载体处理的 OBX 小鼠中，相对于假手术小鼠，进入暗室的潜伏期显着降低（假手术对照组：300 ± 0 s，

图 2。YKH 和 Aen-III 的给药改善了 OBX 小鼠的认知缺陷和抑郁样行为。(a) 在 Y 形迷宫任务中，所有组的武器条目总数没有差异；(b) 在 OBX 手术后 14 天测量 Y 迷宫任务中的交替；(c) 辨别指数 (%) 是在 OBX 手术后 15 天的试用期中测量的；(d) 在 OBX 手术后 16 天、试用期后 24 小时测定测试期中的辨别指数 (%)；(e) 在 OBX 手术后 16、17 天测量逐步被动回避任务的延迟时间；(f) 在 OBX 手术后 18 天测量悬尾任务中的不动时间。每个条形代表平均值 ± SEM（ * p < 0.05， ** p < 0.01 与假手术小鼠相比，# p < 0.05，## p < 0.01 与 OBX 小鼠）。

n = 5; OBX：14.0 ± 3.9 s，n = 7)（图 2 (e)）。YKH 1000 mg/kg 和 Aen-III 1.0、3.0 mg/kg 给药显着改善了 OBX 小鼠的潜伏期缩短（OBX YKH：187.9 ± 50.1 s，n = 8；OBX Aen-III 1.0 mg/kg：162.3 ± 52.2 s , n = 8; OBX Aen-III 3.0 mg/kg: 166.9 ± 46.0 s, n = 8) (图 2 (e))。

最后，我们评估了抑郁症等 BPSD 样行为的改善情况。在悬尾任务中，载体处理的 OBX 小鼠的不动时间显着增加，并且通过 YKH（1000 mg/kg）和 Aen-III（1.0 和 3.0 mg/kg）处理显着改善（假控制：37.0 ± 15.5 s，n = 11；OBX：98.9 ± 14.1 s，n = 14；OBX YKH：52.7 ± 11.2 s，n = 16；OBX Aen-III 1.0 mg/kg：55.5 ± 9.6 s，n = 15；OBX Aen- III 3.0 mg/kg：51.6 ± 13.6 s，n = 8)（图 2 (f)）。

这些结果表明，YKH 和 Aen-III 在改善 OBXmice 中观察到的认知缺陷和抑郁样行为方面具有同等功效。

3.2. 施用 YKH 和 Aen-III 改善 CaMKII 自磷酸化和 CaMKIV/CREB ​​信号传导

由于我们之前证实，海马 CA1 区域的 CaMKII 自身磷酸化减少与 OBX 小鼠的记忆缺陷密切相关 [ 11 ]。CaMKIV 活性对于通过抗抑郁药改善抑郁样行为至关重要 [ 22 ]。因此，我们研究了 Aen-III 或 YKH 治疗是否能改善海马 CA1 区的 CaMKII 自身磷酸化和 CaMKIV/CREB ​​磷酸化。事实上，CaMKII 自身磷酸化 (Thr-286) 在载体处理的 OBX 小鼠中显着降低（假对照组：100% ± 3.5%，n = 8；OBX：61.7% ± 4.8%，n = 8）（图 3 (a) 和图 3(b))。YKH (1000 mg/kg) 和 Aen-III (1.0, 3.0 mg/kg) 的施用显着恢复了降低的 CaMKII 自磷酸化 (OBX YKH: 105.6% ± 5.7%, n = 8;OBX Aen-III 1.0 mg/kg ：96.1% ± 8.0%，n = 8；OBX Aen-III 3.0 mg/kg：100.4% ± 3.0%，n = 8)（图 3 (a) 和图 3 (b)）。

此外，我们之前记录了在 OBX 小鼠中 CaMKIV 和 CREB ​​磷酸化急剧下降 [ 11 ] [ 23 ]。我们接下来检查了 YKH 和 Aen-III 对 CaMKIV/CREB ​​信号传导的影响。我们观察到 CaMKIV 磷酸化 (Thr-196) 显着降低（假控制：100% ± 5.3%，n = 8；OBX：44.7% ± 6.7%，n = 8）、CREB ​​磷酸化（Ser-133）（假控制: 100% ± 4.3%, n = 8;OBX: 62.3% ± 3.7%, n = 8) 在载体处理的 OBX 小鼠的海马 CA1 区域 (图 3 (a) 和图 3(b))。CaMKIV 降低（OBX YKH：89.4% ± 6.6%，n = 8；OBX Aen-III 1.0 mg/kg：90.1% ± 12.2%，n = 8；OBX Aen-III 3.0 mg/kg：96.2% ± 9.7% , n = 8) 和 CREB ​​(OBX YKH: 95.2% ± 3.8%, n = 8;OBX Aen-III 1.0 mg/kg: 94.6% ± 4.3%, n = 8;OBX Aen-III 3.0 mg/kg: 81.4 % ± 4.0%, n = 8) YKH 1000 mg/kg 和 Aen-III 1.0, 3.0 mg/kg 给药显着改善磷酸化（图 3 (a) 和图 3 (b)）。

由于 CaMKIV/CREB ​​信号对于 OBX 大鼠的 BDNF 水平升高至关重要 [ 24 ] [ 25 ]，我们评估了 CA1 区域的 BDNF 水平。载体处理的 OBX 小鼠的 BDNF 水平显着降低（假控制：100% ± 2.8%，n = 8；OBX：49.8% ± 5.2%，n = 8）。YKH 和 Aen-III 给药挽救了降低的 BDNF 水平（OBX YKH：97.3% ± 15.2%，n = 8；OBX Aen-III 1.0 mg/kg：108.3% ± 8.1%，n = 8；OBX Aen-III 3.0 mg/kg：89.4% ± 6.9%，n = 8)（图 3 (a) 和图 3 (b)）。综上所述，YKH 和 Aen-III 对 OBX 小鼠行为缺陷的改善作用是通过上述信号的恢复而发挥的。

3.3. Aen-III 和 YKH 的施用恢复了 OBX 小鼠海马中 ATP 水平的降低

据报道，AD 模型小鼠大脑中的 ATP 水平降低 [ 26 ]，我们研究了 OBX 小鼠海马中的 ATP 水平。正如预期的那样，由 YKH 和 Aen-III (3.0 mg/kg) 治疗（假控制：100% ± 3.1%，n = 10；OBX：68.4% ± 4.1%）拯救的 OBX 小鼠的 ATP 水平显着降低，n = 14；OBX YKH：86.4% ± 2.4%，n = 10；OBX ARM：97.3% ± 2.8%，n = 10；OBX Aen-III 3.0 mg/kg：86.8% ± 4.8%，n = 10) （图 4）。

4。讨论

已在 OBX 小鼠 [ 27 ] 和淀粉样前体蛋白转基因小鼠 [ 28 ]中报道了使用 yokukansan (YKS) 改善记忆和 BPSD 样行为。然而，尚未确定 YKS 的基本组成部分及其阐明改进的机制。自Aen-III以来，Byaku-jutsu的一个组成部分

图 3。YKH 和 Aen-III 治疗挽救了 OBX 小鼠中 CaMKII 自磷酸化和 CaMKIV/CREB ​​信号传导的降低。(a) 使用针对自磷酸化 CaMKII (Thr-286)、CaMKII、磷酸化 CaMKIV (Thr-196)、CaMKIV、磷酸化 CREB ​​(Ser-133)、CREB、BDNF 和 β-抗体的海马 CA1 区蛋白质印迹的代表性图像微管蛋白；(b) 自磷酸化 CaMKII、磷酸化 CaMKIV、磷酸化 CREB ​​和 BDNF 的定量。数据显示为假手术小鼠的百分比。每个条形代表平均值 ± SEM（ * p < 0.05， ** p < 0.01 与假手术小鼠， # p < 0.05， ## p < 0.01 与 OBX 小鼠）。

图 4。海马中ATP浓度的定量分析。在 OBX 小鼠中，通过 YKH 和 Aen-III 给药恢复了降低的 ATP 水平。数据显示为假手术小鼠的百分比。每个条形代表平均值 ± SEM（ ** p < 0.01 vs. 假手术小鼠， # p < 0.05， ## p < 0.01 vs. OBX 小鼠）。

（白术），据报道在大鼠中长期服用高剂量同型半胱氨酸后具有改善学习和记忆功能障碍的作用 [ 16 ]，我们重点研究了 Aen-III 的作用，以阐明本研究中记忆改善的机制。此外，我们试图通过 YKH（另一种动物研究中的汉方药物）获得改善记忆力的概念验证，因为它现在流行用于治疗人类的 BPSD 样行为。

正如预期的那样，与 YKH 一样，Aen-III 改善了在 OBX 小鼠中观察到的记忆缺陷和抑郁行为。此外，之前的研究集中在 Aen-III 激活 PKC 以减少氧化应激和细胞凋亡 [ 16 ]。我们在这里研究了 CaMKII 和 CaMKIV/CREB ​​信号，以阐明改善记忆和抑郁行为的机制。CaMKII 自身磷酸化对于海马 CA1 区 [ 29 ] 和记忆形成 [ 30 ]的长时程增强 (LTP) 诱导至关重要。事实上，在 OBX 小鼠中，CaMKII 自身磷酸化显着降低，LTP 受损 [ 11] . 正如预期的那样，Aen-III 或 YKH 治疗显着改善了海马 CA1 区域中减少的 CaMKII 自磷酸化。此外，通过 Aen-III 或 YKH 处理，OBX 小鼠中 CaMKIV 和 CREB ​​磷酸化降低也显着恢复。此外，已知 CaMKIV/CREB ​​下游靶标 BDNF 可介导选择性 5-羟色胺再摄取抑制剂 (SSRI) [ 31 ] - [ 34 ] 的抗抑郁作用。我们之前观察到 OBX 小鼠中磷酸化 CaMKIV、CREB ​​和 BDNF 水平的降低 [ 11 ]。此外，由于缺乏 BDNF 基因的小鼠海马 LTP 受损，BDNF 与海马介导的学习和记忆密切相关 [ 35 ] [ 36 ]] . 此外，BDNF 敲除小鼠海马切片的 BDNF 治疗可挽救 LTP 和突触传递的缺陷 [ 37 ]。在 AD 患者中，海马和皮质中 BDNF 的表达严重下降 [ 38 ] [ 39 ]。总之，BDNF被认为在AD的发病机制中很重要。在这种情况下，观察到用 YKH 和 Aen-III 改善 CaMKIV-CREB-BDNF 信号传导对于改善记忆力和挽救 AD 患者的抑郁行为至关重要。此外，YKH 和 Aen-III 恢复了 OBX 小鼠海马中的 ATP 水平。ATP 是大脑中能量产生的关键调节剂。YKH 和 Aen-III 可能具有增强脑代谢的效力。

5. 结论

总之，这项研究首次证明了 Aen-III 在认知缺陷作为 AD 的核心症状和抑郁作为 AD 模型小鼠的 BPSD 方面的改善作用。Aen-III 通过恢复减少的 CaMKII 自磷酸化和 CaMKIV-CREB-BDNF 信号传导来改善行为功能障碍。此外，Aen-III 具有提高 ATP 水平的能力。因此，我们的研究显示了 Aen-III 用于 AD 治疗的潜力。

致谢

这项工作部分得到了日本教育、文化、体育、科学和技术部 (KAKENHI 25293124, KF) 和吸烟研究基金会 (KF) 的资助。

利益冲突

作者声明我们没有要披露的利益冲突。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

参考

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