从发酵粥中分离的乳酸菌、芽孢杆菌和益生菌 的分子表征和技术特性

摘要：谷物粥是具有复合微生物群的发酵食品之一。这项工作的目的是表征粥的微生物群。在瓦加杜古采集粥样，并根据微生物学标准方法进行分析。获得的假定菌株通过聚合酶链式反应（PCR）表征。通过对酸性 pH 值、胆汁、抗生素和抗微生物、蛋白水解和脂肪分解活性的抗性测试来评估技术能力。所有推定的芽孢杆菌、乳酸菌和酵母菌都通过 PCR 进行了表征。4株（BC1a；BC9b； BC2a和BC1b）经PCR证实为芽孢杆菌，6株to 乳酸杆菌，仅适用于酿酒酵母。所有菌株均对两种抗生素庆大霉素和亚胺培南敏感。相反，所有菌株均对苯唑西林、阿莫西林-克拉维酸、链霉素、青霉素和替卡西林耐药。测试的菌株对胆汁有抗性，但就 pH 而言，这种抗性是相对的。潜在的益生菌菌株已被证明可有效抑制病原体。所有菌株的蛋白水解和脂解活性均为阳性。菌株的表征虽然涉及非详尽的引物列表，但如果对技术能力进行定量研究，则可以确认可能是优质益生菌的菌株。

关键词

芽孢杆菌,乳酸菌,酵母,粥,益生菌

一、简介

在西非，谷物最常用于制作许多面食、饮料、发酵粥 [ 1 ] [ 2 ]。粥非常重要，尤其是在断奶年龄儿童的饮食中，尽管许多研究证实他们无法提供能量和微量营养素的满足感 [ 3 ] [ 4 ]。已经提出了通过基于与各种成分的组合[ 5 ]和发芽或麦芽技术的配方来改善粥质量的比例，但结果并不令人满意[ 6 ][ 7 ]。

发酵是一种通过微生物方法提高营养物质的消化率和生物利用度 [ 8 ] 并因此提高营养价值的方法 [ 1 ] - [ 9 ]。然而，粥中充满了由乳酸菌、酵母菌和芽孢杆菌组成的复合微生物群，这些微生物群在发酵过程的上游介入，其特征值得了解 [ 10 ]。因此，现在的研究重点是对具有技术技能的菌株的研究，即益生菌和淀粉分解的优点。

发酵食品中益生菌的特性已成为多项研究的主题，主要旨在确定技术技能 [ 11 ] [ 12 ]。例如，2009 年在西非从淀粉和发酵食品或饮料中分离出的乳酸菌就是这种情况，因此突出了它们目前的用途 [ 10 ]。发酵乳也是如此[ 12 ]。这项工作的目的是通过分子生物学的方法来表征基于谷物的发酵粥的技术兴趣微生物群。

2。材料和方法

2.1。隔离和保护

根据文献[ 13 ]改良的粥在琼脂-MRS培养基上接种后分离得到乳酸菌。至于酵母，它们是根据[ 14 ]在沙氏培养基（SAB）上分离的。此外，对粥进行热冲击后，在平板计数琼脂 (PCA) 琼脂上分离出芽孢杆菌。假定对乳酸菌和酵母菌呈芽孢杆菌阳性的所有菌株分别在 PCA、Man、Rogosa、Sharpe (MRS)、Sabouraud 添加氯霉素琼脂上进行继代培养，并在 37°C 下孵育 24 小时。乳酸菌、酵母菌和芽孢杆菌的所有阳性培养物连续移栽后选择。纯分离物在 -20˚C 下储存在用于乳酸菌的 MSR 肉汤和用于芽孢杆菌和酵母的 20% - 30% 甘油注入的脑心浸液肉汤中。

2.2. 分子表征

DNA提取

将假定的芽孢杆菌、乳酸菌和酵母菌株传代培养到特定培养基上以提取脱氧核糖核酸 (DNA)。使用 [ 15 ] 使用的方法通过热解从菌株中提取 DNA。] 修改的。从两个或三个 24 小时培养菌落中无菌采集样品，并添加到含有 300 μl PCR 水或无菌蒸馏水的 Eppendorf 管（德国汉堡）中。用相同的移液管将整体彻底匀浆直至完全溶解。将所有试管置于 100°C 沸水浴中 10 分钟，然后冷冻保存 5 分钟。冷冻 5 分钟后，将含有细菌接种物的试管以 12,000 rpm 的速度离心 15 分钟。每管的上清液以 200 μl 的量级回收并储存在 -20°C 直至用于 PCR 反应。使用的引物、序列和预期大小如下：乳酸杆菌属（LbF-GGAATCTTCCACAATGGACG，LbR-CGCTTTACGCCCAATAAATCCGG：230 pb）[ 16 ]；克鲁塞念珠菌（CkFKSfor359-CATTGGCCGTTTCCATTGTGTTC，CkFKSrev359-CATCAACCAAGCGTGATTCTTGC；359pb）[ 17 ]；酿酒酵母（SC-5fw-AGGAGTGCGGTTCTTTCTAAAG，SC-3bw-TGAAATGCGAGATTCCCCCA；215pb）[ 18 ]；芽孢杆菌（B-K1/5F-TCACCAAGGCRACGATGCG，B-K1/5F-TCACCAAGGCRACGATGCG；1000 - 1200 pb）[ 19 ]。

反应混合物的制备

制备反应混合物，每次反应的总体积为 20 μL。它由 Mater mix (One Taq ® quick-laod ® ) (5X)、Primer F (10 μM)、Primer R (10 μM)、H 2 O PCR (无核酸酶水)、DNA (50 ng mL - 1) 体积分别为 4 μL、0.5 μL、0.5 μL、12.5 μL 和 2.5 μL。

放大

使用 Mastercycler Nexus Gradient Thermal Cycler (Eppendorf) 进行扩增。所用每对引物的 PCR 程序如表 1所示。

移民

将逗号 5 克 (1.5 g) 琼脂糖溶解在 100 ml TBE (EDTA Tri

引物

初始变性

30 次循环

最终变性

变性

杂交

伸长

操作温度和时间

CkFKSf/CkFKSr

95°C 5分钟-1

94˚C 45 秒-1

50˚C 45 秒-1

72℃ 1min-1

72℃ 10 分钟-1

SC-5fw/SC-3bw

95°C 5分钟-1

94˚C 45 秒-1

50˚C 45 秒-1

72℃ 1min-1

72℃ 10 分钟-1

磅/磅

95°C 5分钟-1

94˚C 45 秒-1

60˚C 45 秒-1

72℃ 1min-1

72℃ 10 分钟-1

LcF/LcR

95°C 5分钟-1

94˚C 45 秒-1

55℃ 45 秒-1

72℃ 1min-1

72℃ 10 分钟-1

B-K1/5F、B-K1/3R

95°C 5分钟-1

95˚C 30 秒-1

55℃ 30 秒-1

72℃ 1min-1

72℃ 7 分钟-1

表 1。所用引物的 PCR 程序。

资料来源：[ 17 ] [ 18 ] [ 19 ]。

硼酸盐）以 1X 的浓度加热至溶解。将混合物冷却至 40°C 后，加入几滴 BET（溴化乙锭），然后均质化。将如此形成的凝胶倒入装有用于产生孔的梳子的罐中。将扩增子沉积在琼脂糖凝胶上制成的孔中。迁移使用含有 1X TBE 的电泳（Midi Horizo​​ntal Electrophoresis）槽在 100 mV 电压和 100 mA 电流下进行 60 分钟。

乐队的启示和解释

迁移后，在 Transilluninator 电泳凝胶读数器上显示 DNA 谱，并与数码相机的暗室相结合。在启示之后，磁带被解释为阳性对照。

2.3. 益生菌特性

抗生素耐药性

根据欧洲抗菌素敏感性测试委员会 (EUCAST) [ 20 ] 评估和解释抗生素耐药性。将菌株接种在 Muller-Hinton 琼脂平板上。测试了 11 种不同的抗菌药物：阿莫西林 (AMX)、庆大霉素 (GEN)、亚胺培南 (IMI)、苯唑西林 (Ox)、氨苄青霉素 (AM)、红霉素 (E)、青霉素 (P)、链霉素 (STR)、卡那霉素 (K) ) 替卡西林 (TIC)、阿莫西林-克拉维酸 (CMA)。

在酸性 pH 下生长

根据[ 21 ]的方法使用甲基红作为有色指示剂进行pH存活试验。将不同试管的pH调至2.5；4.5 和 7.2。对于乳酸菌和酵母菌，培养物在 30˚C 下 24 小时孵育，芽孢杆菌在 24 小时内在 37˚C 孵育。彩色指示器的弯曲反映了增长。

胆汁盐的生长

将不同的菌株接种在一种液体培养基上，该液体培养基对分离菌株的生长具有特异性，其中含有 0.3% 的“Oxagall”胆汁，这代表了 [ 22 ] 提出的浓度。为此，将大约 3 克“Oxagall”胆汁引入 100 毫升每个菌株的生长特异性肉汤中。在每个试管中加入几滴甲基红，使内容物呈红色。将菌株接种在特定的肉汤中。通过将每种菌株播种在不添加胆汁的相同肉汤上来进行对照。培养后，通过管从红色变为黄色的变色注意到菌株的生长[ 23 ]。

抗菌活性

根据[ 24 ]使用Blanck Discs（Liofilchem srl）修复的方法证明了菌株的抗微生物活性。使用的参考致病菌株是：大肠杆菌ATCC 29522、金黄色葡萄球菌ATCC 25923、粪肠球菌ATCC 29911 和铜绿假单胞菌ATCC 27853。

酶活性

根据斑点法测试脂解和蛋白水解活性。因此，透明区域的出现会在相反的情况下翻译活动或不存在 [ 23 ]

统计分析

频率和平均值由 Microsoft Excel 2013 软件计算。照片和图形由paint.net 4.0.6 版软件处理。

3. 结果

3.1。菌株特征

宏观观察揭示了几种不同大小、形状和颜色的菌落。显微镜下观察，细胞呈芽孢杆菌状、壳状、卵形、分离状，或多或少呈链状。芽孢杆菌，所有芽孢杆菌均为 100% 克，过氧化氢酶和氧化酶阳性。选择的13种乳酸菌中，76.92%为杆菌，23.08%为壳。它们都是革兰氏阳性菌落，但完全没有过氧化氢酶和细胞色素氧化酶。酵母具有不同的大小和形状，均提供过氧化氢酶和氧化酶。因此，保留了7个芽孢杆菌5进行鉴定。对于乳酸菌，选择了 13 个中的 7 个。对于酵母，所有 13 种都已被分子鉴定。

3.2. 菌株的分子表征

分别用引物对BK1F/BK1R和LbF/LbR通过PCR鉴定芽孢杆菌和乳酸菌：图1 (a)显示了由引物对(BK1F/BK1R)扩增的芽孢杆菌菌株的概况。该图揭示了芽孢杆菌属特异性条带的存在，对于菌株 BC1a，其大小在 1000-1200 bp 之间；BC9b：BC2a 和 BC1b。乳酸杆菌特异性 LbF 和 LbR 引物对扩增的分离乳酸菌菌株概况

图 1。芽孢杆菌和乳酸菌的鉴定(a) MP：分子量标记；1：BC1a；2：BC9a；3：BC9b；4：BC2a；5：BC1b。(b) 1：BL12a；2：BL5d；3：BL12c；4：BL12g；5：BL5b；6：BL5c；7：BL21a。

属。因此，观察到 BL5d 菌株的特定 230pb 条带；BL12c; BL12g; BL5b; BL5c; BL21a 对应于乳杆菌属。而BL12a菌株的扩增是阴性的（图1（b））。

通过 PCR 鉴定酵母：对于酵母，使用两对特异于克氏念珠菌(CkFKSfor359/CkFKSrev359) 和酿酒酵母(SC-fw/SC-rw) 的引物进行分子鉴定。用克氏念珠菌引物对扩增菌株未发现该物种的特异性条带（图 2 (a)）。图 2 (a) 显示了由酿酒酵母物种特异性引物对扩增的酵母谱。请注意，只有 Lev5c 菌株存在约 215 bp 的特定条带。

3.3. 分离菌株的益生菌适应性

抗生素敏感性：测试的芽孢杆菌菌株对五种抗生素（Ox、STR、P、E 和 TIC）具有抗性，对两种抗生素（GEN 和 IMI）具有总敏感性，对两种抗生素（AMP 和 K）具有中等抗性。因此，对抗生素敏感的人取决于一种菌株对另一种菌株。BL5b 菌株对所有抗生素均敏感（表 2）。

对 pH 值和胆盐的抗应变性：表 3总结了获得的结果；

图 2。克氏假丝酵母和酿酒酵母的酵母鉴定。1：3级；2：Lev21b；3：列弗9；4：Lev2a；5：Lev28c；6：Lev21a；7：Lev21d；8：Lev5a；9：Lev21a；10：Lev28a；11：Lev21c；12：Lev5d；13：Lev5c。

菌株/代码

抗生素

牛

AMX

安培

ķ

资产管理公司

GEN

IMI

STR

磷

乙

TIC

芽孢杆菌

BC1a

R

R

小号

小号

R

小号

小号

R

R

R

R

BC1b

R

R

R

小号

R

小号

小号

R

R

R

R

BC2a

R

小号

小号

小号

小号

小号

小号

R

R

R

R

BC2b

R

R

我

我

R

小号

小号

R

R

R

R

BC9b

R

小号

小号

R

R

小号

小号

R

R

R

R

乳酸菌

BL5b

小号

小号

小号

小号

小号

小号

小号

小号

小号

小号

小号

BL5c

小号

小号

R

小号

小号

小号

小号

小号

小号

小号

R

BL12a

R

我

小号

我

小号

我

小号

R

小号

R

小号

BL12c

R

R

小号

R

R

R

R

R

R

R

小号

BL12g

R

R

R

R

小号

R

小号

R

R

R

R

表 2。芽孢杆菌菌株和乳酸菌的抗生素敏感性

AMX：阿莫西林；GEN：庆大霉素；IMI：亚胺培南；牛：苯唑西林；AMP：氨苄青霉素；E：红霉素；P：青霉素；STR：链霉素；K：卡那霉素；ICT：替卡西林；AMC：阿莫西林-克拉维酸；R：抗性；S：敏感；一：中级

菌株/代码

胆汁 (0.3%)

酸碱度

反抗

酸碱度

2.5

4.5

7.2

pHf (2.5)

酸碱度 (4.5)

芽孢杆菌

BC1a

++

7.11

-

-

++++

2.49

4.42

BC1b

++

6.69

-

-

++++

2.60

4.02

BC2a

+

6.45

-

-

++++

2.51

4.05

BC2b

++

6.99

-

-

++++

2.59

4.28

BC9b

++

6.75

-

-

++++

2.53

4.62

乳酸菌

BL5b

+

6.17

-

-

++++

2.71

2.61

BL5c

+

6.38

-

+

++++

2.51

2.76

BL12a

++

6.60

-

+

++++

2.46

2.68

BL12c

++

6.18

-

+

++++

2.48

2.58

BL12g

+++

7.14

-

-

++++

2.64

2.62

酵母菌

3级

+

6.28

-

+

++++

2.67

4.05

Lev5c

+

6.34

-

++

++++

2.47

3.96

Lev5d

++

6.62

-

++

++++

2.64

4.18

Lev21c

++

6.67

-

+++

++++

2.73

3.89

列弗28a

+

6.51

-

++

++++

2.76

4.04

表 3。应变对 pH 值和胆汁的抵抗力。

-：没有增长；+：敏感转弯，++：部分转弯；+++：总转弯；++++：管的外观；pHf：孵育后溶液的最终pH；列夫：Levure。

目测管的褪色状态并测定最终的pH值。所有菌株在胆汁 (0.3%) 和酸化培养基 (pH 降低) 的存在下存活。对于所有菌株，芽孢杆菌在 pH 2.5 和 pH 4.5 下均未观察到培养基变色。而对于所有测试的酵母菌株，在 pH 4.5 时观察到培养基变色。在 pH 4.5 的三种乳酸菌菌株（BL5c、BL12a 和 BL12c）中也观察到变色（表 3）。

抗菌活性：在芽孢杆菌中，只有BC9b菌株对直径10mm的粪肠球菌ATCC 29911和铜绿假单胞菌ATCC 27853有抑制作用。同样，两种乳酸菌菌株（BL5c 和 BL12c）抑制这两种病原体。酵母菌的抑制作用更为显着，因为只有两种菌株（Lev3和Lev21c）对大肠杆菌ATCC 29522无效。其他菌株能够抑制直径为10至21毫米的病原体（图3（a））。

图 3。测试菌株的病原体抑制直径。(a)大肠杆菌ATCC 29522；金黄色葡萄球菌ATCC 25923；粪肠球菌ATCC 29911；铜绿假单胞菌ATCC 27853。(b1)：酵母菌对粪肠球菌ATCC 29911 的抑制区；(b2)：在大肠杆菌ATCC 29522存在下不抑制芽孢杆菌的侵袭；(b3)：乳酸菌对铜绿假单胞菌ATCC 27853 的作用；1：BC1a；2：BC1b；3：BC2a；4：BC2b；5：BC9b；6：BL5b；7：BL5c；8：BL12a；9：BL12c；10：BL12g；11：3级；12：Lev5c；13：Lev5d；14：Lev21c；15：列弗28a。

图 3 (b) 显示了分离菌株对致病菌株的抑制区域。所有酵母菌都对粪肠球菌 ATCC 29911 有抑制作用（图 3 (b1)）。在不抑制大肠杆菌菌株 ATCC 29522的情况下观察到芽孢杆菌菌落入侵（图 3 (b2)），但在乳酸菌中，仅对菌株 7 (BL5c) 和 9 (BL12c) 可见抑制作用（图 3 (b)）。

酶活性：除芽孢杆菌中的BC9b菌株外，所有受试菌株均通过菌落斑点周围出现透明区域表现出酶活性。图 4 (a) 显示了芽孢杆菌菌株对红棕榈油的脂解活性，图 4 (b) 对乳酸菌和图 4 (c) 对酵母的脂解活性。图 4 (d)、图 4 (e) 和图 4 (f) 显示了分离菌株水解乳蛋白的能力。在斑点中沉积的所有菌落周围出现透明区域。芽孢杆菌中的活性（图 4（d））比乳酸菌（图 4 (e)) 和酵母菌 (图 4 (f))。

图 4。分离菌株的酶活性。(a)芽孢杆菌菌株的脂肪分解活性；(b) 乳酸菌的脂肪分解活性；(c) 酵母的脂肪分解活性；(d)芽孢杆菌菌株的蛋白水解活性；(e) 乳酸菌的蛋白水解活性；(f) 酵母的蛋白水解活性。

4。讨论

本研究中表征的菌株主要来自Benkida。与Benkoonré和米粥 [ 25 ]等其他粥不同，这种粥是人们生产和最受欢迎的粥。在这些菌株中，芽孢杆菌在这些粥的菌群中占优势，因为它们能够形成孢子。但我们也注意到这些粥中存在乳酸菌和酵母菌。因此，这些微生物的鉴定已通过使用特异性引物的 PCR 得到证实。

在选择用于鉴定的五种推定芽孢杆菌菌株中，通过 PCR 进行分子表征后，四种（BC1a、BC9b：BC2a 和 BC1b）被确认为芽孢杆菌。大约 1000 bp 的芽孢杆菌特异性条带的存在证实了它们的身份（图 1 (a)）。这些结果与 [ 26 ] [ 27 ] 和 [ 28 ]报告的结果相似，他们使用相同的引物对分别从布基纳法索、乍得和加蓬的发酵食品中分离出芽孢杆菌。

至于乳酸菌的鉴定，扩增显示存在大小接近230bp的乳酸杆菌特异性条带（图1（b））。因此，六 (6) 个菌株被确认为乳酸杆菌（BL5d、BL12c、BL12g、BL5b、BL5c 和 B21a）。在鉴定从木薯发酵食品Attiéké中分离出的乳酸菌时，[ 29 ] 和 [ 30 ]报告了同样的结果。

对于通过使用克氏念珠菌特异性引物鉴定酵母，未发现特异性条带（图 2 (a)）。使用酿酒酵母特异性引物证实了 Lev5c 菌株的身份，因为揭示了属于该菌株的特定条带（图 2（b），215 bp）。[ 29 ] 和[ 30 ]也报道了类似的结果。没有给出特定条带的其他菌株可能属于其他属，例如隐球菌属、地霉属、酒香酵母属、白孢子菌属和克鲁维酵母属. 只有对这些属特异的引物才能完全鉴定分离的菌株。

一些细菌已经发展出抗生素抗性机制。这些机制包括各种抗生素灭活酶的产生、攻击部位的修饰和抗生素渗透性 [ 31 ] [ 32 ] 报告说，芽孢杆菌具有对 β-内酰胺类的抗性能力。一种乳酸菌菌株对所有测试的抗生素都表现出敏感性。[ 33 ] 的工作报道了乳酸菌的相对敏感性和乳酸菌对氨基糖苷类的内在抗性。

在一些试管中观察到的变色反映了可能已释放代谢物的菌株的生长。后者改变了 pH 值，导致甲基红发生偏移。所有测试菌株对胆汁的抗性提供了有关满足益生菌资格标准之一的有趣信息。至于耐受特别是酵母和一些乳酸菌菌株的 pH 值的能力，这可能与 pH 值在耐受范围内的事实有关。即使在 4.5 的 pH 值下，芽孢杆菌也无法存活，但在某些情况下会出现酸化，这就是观察到 pH 值下降的原因 [ 34 ]。

单个芽孢杆菌(BC9) 菌株对两种病原体（粪肠球菌ATCC 29911 和铜绿假单胞菌ATCC 27953）显示出功效，证实了其产生细菌素的能力。这些结果是由 [ 35 ] 获得的，他们鉴定了产生这些物质的芽孢杆菌菌株，以对抗病原体，如 Micrococcus luteus。我们的研究结果表明，两种乳酸菌菌株抑制与芽孢杆菌属相同的病原体。[ 36 ] 获得乳酸杆菌菌株对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用，但这些菌株是从奶酪中分离出来的，证实菌株的抗菌活性也取决于食物基质。至于酵母菌，与芽孢杆菌和乳酸菌相比，它们对参考病原体的抑制直径更大。Hatoum 的工作证实了这些结果，他在牛奶中鉴定出能够抑制几种肠杆菌的酵母菌[ 37 ]。

所有测试的菌株都表现出蛋白水解活性。这些结果被[ 21 ]的工作所证实。与乳酸菌（中等）和酵母（较弱）相比，芽孢杆菌的蛋白水解活性更为明显。至于脂肪分解活性，在后两组微生物即乳酸菌和酵母菌中仍然很低[ 38 ]。

5. 结论

这项研究允许分离出三类菌株，即乳酸杆菌和酵母菌。分子生物学方法允许从芽孢杆菌特异性引物乳酸杆菌中鉴定菌株和属于酿酒酵母种的酵母。这些结果接近于从初步测试中获得的结果。根据文献研究，这些菌株大多是非致病性的，经过进一步的测试，即益生菌功效和淀粉分解效力，可能具有重要的技术意义。除庆大霉素和亚胺培南外，测试的菌株对多种抗生素具有抗药性。根据世界卫生组织 (WHO) 的说法，细菌对抗生素的耐药性被认为是一个公共卫生问题。一项详尽的研究对于严格选择证明是必要的非抗性菌株是必要的。对一些酶活性的测试提供了有趣的结果，证明由于它们的特性，部分微生物群可以被标准化

致谢

我们要感谢为本文的成功做出贡献的所有作者和结构。

利益冲突

作者声明与本文的发表没有利益冲突。

参考

[ 1 ] Humblot, C. (2015) Les Relations aliments-microbiotes-hôte。Thèse de PhDat d'habilitation à diriger des recherché，蒙彼利埃 2 大学，蒙彼利埃，72 页。

https://horizo​​n.documentation.ird.fr/exl-doc/pleins_textes/divers15-11/010065625.pdf

[ 2 ] Saubade, F., Hemery, YM, Rochette, I., Guyot, JP 和 Humblot, C. (2018) 发酵和其他加工步骤对传统非洲谷物发酵食品叶酸含量的影响。国际食品微生物学杂志，266，79-86。

[ 3 ] Elenga, M.、Tchimbakala, MS 和 Sahou, A. (2016) Amélioration de la qualité Nutritionnelle des bouillies d'igname et leur efficacité chez les rats de souche wistar。应用生物科学杂志，103, 9819-9828。

[ 4 ] Kadri, A.、Halilou, H. 和 Karimou, I. (2019) Culture du mil [Pennisetum glaucum (L) R. Br] et ses contraintes à la production: Une revue。国际生物和化学科学杂志，13，503-524。

[ 5 ] Tshite, FN 和 Ndianabo, MJ (2015) Mise au point d'une farine précuite à base de maïs (Zea mays) et de soja (Glycine max) par la methode traditionalnelle。国际生物和化学科学杂志，9，2608-2622。

[ 6 ] Amoin, AKKA, Agbo, EA, Dago, AG, Gbogouri, AG, Brou, DK 和 Dago, G. (2015) Comparaison des caractéristiques Nutritionnelles et rhéologiques des bouillies infantiles preparées par les 技术发芽和发酵。国际生物和化学科学杂志，9，944-953。

[ 7 ] Fogny, NF, Madode, EY, Laleye, FF, Amoussou-Lokossou, Y. 和 Kayode, A. (2017) Formulation de farine de foniorichie en ressources alimentaires locales pour l'alimentation complémentaire des jeunes enfants au Bénin。国际生物和化学科学杂志，11，2745-2755。

[ 8 ] Franz, CM, Huch, M., Mathara, JM, Abriouel, H., Benomar, N., Reid, G., Galvez, A. 和 Holzapfel, WH (2014) 非洲发酵食品和益生菌。国际食品微生物学杂志，190，84-96。

[ 9 ] Saubade, F.、Humblot, C.、Hemery, Y. 和 Guyot, JP (2017) PCR 筛选非洲发酵珍珠小米粥宏基因组以研究其微生物群的营养潜力。国际食品微生物学杂志，244, 103-110。

[ 10 ] Yao, AA, Egounlety, M., Kouame, LP 和 Thonart, P. (2009) Les bactéries lactiques dans les aliments ou boissons amylacés et infantés de l'Afrique de l'Ouest：leur 利用活动。兽医医学年鉴，153, 54-65。