分析余甘子的促智作用

摘要：氧化应激与神经退行性疾病密切相关，尤其是阿尔茨海默病 (AD)。寻找具有促智活性的药用植物以控制 AD 的发展和进展已受到广泛考虑。植物 Phyllanthus reticulatus (PR) Poir。在孟加拉语中被称为 Panjuli 属于大戟科。以前的研究表明这种植物具有抗氧化、镇痛、抗炎等活性。因此，本研究的目的是检查叶下珠乙醇提取物 (EEPR) 对铝诱导的认知障碍和氧化应激大鼠的认知功能、脑抗氧化酶和乙酰​​胆碱酯酶活性的促智作用。EEPR 水果的影响（即 100 和 200 毫克/千克体重）) 进行了 30 天的检查，并通过行为研究如被动回避 (PA) 测试、奖励交替 (RA) 测试和生化研究如超氧化物歧化酶 (SOD)、过氧化氢酶 ( CAT)、大鼠脑组织匀浆中硫代巴比妥酸反应物质 (TBARS) 和乙酰胆碱酯酶 (AChE) 活性的含量。在 PA 试验中，与疾病对照组相比，给予 EEPR 果实（即 100 和 200 mg/kg，bw）显着（P < 0.05，P < 0.01）增加了大鼠第 30 天的逐步潜伏期（STL）。与疾病对照组相比，用 EEPR 水果（即 200 mg/kg bw）处理的大鼠的记忆保留百分比（MR）显着增加（P < 0.05）。对于 RA 测试，EEPR 水果（即 200 mg/kg bw ) 显着 (P < 0.01) 增加了与疾病对照组相关的第 30 天大鼠的正确反应 (CR)。在该试验的情况下，相对于疾病对照组，用 EEPR 果实（即 100 和 200 毫克/千克体重）处理的大鼠的 MR 百分比显着增加（P < 0.05，P < 0.01）。与疾病对照组相比，施用 EEPR 水果（即 100 和 200 mg/kg bw）显着（P < 0.05，P < 0.01）增加了 SOD、CAT 的水平，并且显着地（P < 0.05）降低了 TBARS 水平。与疾病对照组相比，用 EEPR 果实（即 100 和 200 mg/kg bw）处理显着（P < 0.05，P < 0.01）降低了 AChE 活性水平。

关键词

促智药,网状叶下珠,认知功能,脑抗氧化酶, 乙酰胆碱酯酶活性,阿尔茨海默病

一、简介

阿尔茨海默病 (AD) 是一种进行性神经退行性脑部疾病，会导致记忆、思维、行为问题并最终导致死亡 [ 1 ]。它是最常见的痴呆形式（60%），这不是衰老的正常部分 [ 2 ]。AD 的特点是在大脑皮层和皮层下灰质中存在过量的含有淀粉样蛋白-β (Aβ) 和异常 tau 蛋白丝的神经炎斑块，以神经原纤维缠结 (NFT) 的形式存在 [ 3 ]。阿尔茨海默病患者的大脑中乙酰胆碱酯酶 (AChE) 水平升高，这是造成乙酰胆碱 (ACh) 分解的原因 [ 4] . ACh 是一种神经递质，对中枢胆碱能系统 (CCS) [ 5 ]的正常运作起着关键作用。AD 患者大脑中 ACh 的减少似乎是导致痴呆的首要原因 [ 6 ]。目前全世界约有 3500 万人受到 AD 的影响，它是美国的第 6大死因[ 7] . 阿尔茨海默氏症患者的症状在其他人看来相当严重后，他们的平均寿命可能为 8 年。然而，生存范围可以从 4 到 20 年不等，这取决于年龄和其他健康状况。目前的阿尔茨海默病治疗不能阻止这种神经退行性疾病的进展，但这些可以暂时减缓痴呆症状的恶化并改善阿尔茨海默病患者的生活质量 [ 8 ]。今天，科学家们一直在不懈努力，尽最大努力寻找更好的方法来治疗这种疾病，延缓其发病并防止其发展 [ 9 ]。

与抗氧化防御机制相比，当自由基及其副产物过量产生时，就会发生氧化应激 [ 10 ] - [ 12 ]。AD的发病机制导致神经元功能障碍和细胞死亡，主要是由于自由基产生和抗氧化防御之间的不平衡[ 13 ][ 14 ]。最近的研究表明，AD 患者的脑组织在疾病期间暴露于蛋白质氧化、DNA 氧化、脂质氧化、糖氧化等 [ 15 ] [ 16 ]。自由基对蛋白质的氧化在 AD 中起重要作用 [ 17] . 几项研究表明，AD 受试者的多个大脑区域中的蛋白质羰基化合物有所增加[ 18 ]。酶主要是谷氨酰胺合成酶和肌酸激酶，对氧化修饰敏感，在阿尔茨海默病患者的大脑中明显减少 [ 19 ]。AD 患者的大脑中会发生较高水平的脂质过氧化，并且在退行性变化最为明显的地方最为人所知 [ 20 ]。脑膜磷脂的多不饱和脂肪酸 (PUFA) 特别容易受到自由基的攻击，因为它们的双键可以很容易地去除氢离子 [ 21 ]。多不饱和脂肪酸的氧化，主要是花生四烯酸和二十二碳六烯酸在 AD 中传递脂质过氧化 [ 22] 通过生成醛类，最重要的是 4-羟基壬烯醛 (HNE)，这是一种高反应性细胞毒剂，能够抑制糖酵解、核酸和蛋白质合成以及降解蛋白质 [ 23 ]。DNA 的氧化可产生链断裂、姐妹染色单体交换、DNA-蛋白质交联和碱基改变 [ 24 ]。许多研究表明，AD 患者大脑中的氧化性 DNA 损伤会增加 [ 25 ]。定义的最大标记 DNA 加合物是 8-羟基-2-脱氧鸟苷 (8-OHdG) [ 26 ]。另一方面，晚期糖基化终产物是由于蛋白质的翻译后修饰而产生的，并且可能在 AD 中发挥作用，这与 Aβ 肽和 tau 的氧化修饰有关 [ 27] . 除此之外，大脑主要由容易氧化的脂质组成，耗氧率高，过渡金属代谢率高，缺乏强大的抗氧化防御能力，这就是为什么它很容易受到氧化损伤[ 28 ]。

铝是一种普遍表现出来的神经毒素，对中枢神经系统 (CNS) 具有多种作用方式 [ 29 ]。它能够提高血脑屏障 (BBB) [ 30 ] [ 31 ] 的通透性和穿过性，这对增加海马体 [ 32 ]、皮质、单束和胼胝体中的铝浓度具有重要作用[ 33 ]。各种神经病理学、生化和流行病学研究表明 AD 的发病机制与铝的神经毒性之间存在潜在联系 [ 34 ]。铝会导致不溶性 Aβ 的积累，以及含有 NFT 的超磷酸化 tau 蛋白的聚集 [ 35] 并导致对胆碱能神经传递的有害改变 [ 36 ]。此外，铝还能促进由铬 (Cr) 和铜 (Cu) 等各种过渡金属引发的氧化 [ 37 ]。在这项研究中，使用麦芽酸铝来制造认知功能障碍和氧化应激。用于治疗 AD 的药物的进步打破了氧化应激和神经变性的恶性循环，带来了新的前景。

抗氧化剂是最有利于健康的重要组成部分，能够预防或延缓某些细胞损伤[ 38 ]。一些科学研究人员建议抗氧化剂在 AD 的管理中发挥核心作用。天然存在的抗氧化剂对 AD 非常有用，可以降低与合成抗氧化剂相关的风险 [ 39 ]。天然抗氧化剂的最大来源是药用植物。天然抗氧化剂和益智药的神经保护作用，如银杏、[ 40 ] 假马齿苋 [ 41 ] 和石杉木 [ 42 ] 在 AD 的管理中获得了相当大的关注。

植物 Phyllanthus reticulatus (PR) Poir。在孟加拉语中被称为 Panjuli 属于大戟科 [ 43 ]。这种植物广泛分布于印度、中国、马来群岛的热带地区和孟加拉国的休耕地[ 44 ]。这种植物的果实是圆形的浆果，直径约 4 至 6 毫米，先是绿色，然后变成紫黑色 [ 45 ]。在传统的医学系统中，这种植物的不同部分用于治疗各种疾病。叶用作止泻、利尿、凉药，根用于治疗疟疾、哮喘，树皮用作收敛剂和利尿剂。这种植物的果实对肠道有收敛作用，可用于炎症 [ 43] . 这种植物的重要治疗用途是镇痛、抗炎、降胆固醇、细胞毒性、免疫刺激剂、抗糖尿病、抗疟原虫、抗菌、保肝活性等 [ 46 ]。这种植物的化学研究确保了以下植物成分的存在，包括单宁酸、二十八烷醇、谷甾醇、东莨菪碱、羽扇豆醇乙酸酯、teraxerone、白桦脂醇、teraxerol 乙酸酯、friedeline、豆甾醇和羽扇豆醇 [ 47 ] [ 48 ]。

先前的初步研究表明这种植物具有体外抗氧化活性[ 49 ]。因此，本研究的目的是通过被动回避（PA）测试、奖励交替（RA）等行为测试来研究 PR（EEPR）水果乙醇提取物对铝诱导的认知障碍和氧化应激大鼠的神经保护作用。通过生化试验，如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT），测定大鼠脑组织匀浆中硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）和乙酰胆碱酯酶（AChE）活性的含量，检测脑抗氧化酶的活性。

2。材料和方法

2.1。化学品和药物

麦芽糖酸铝、吩嗪甲基硫酸盐、焦磷酸钠、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADPH)、乙酰硫代胆碱碘化物 (ATCI)、5,5-二硫代二-2-硝基苯甲酸根离子 (DTNB)、三氨基甲烷盐酸盐 (Tris-HCl)、牛血清白蛋白 (BSA)、三氯乙酸 (TCA) 和硫代巴比妥酸 (TBA) 均购自美国 Sigma-Aldrich。除非另有说明并从当地采购，所有其他化学品均为分析级。盐酸多奈哌齐粉末作为礼物从孟加拉国 Incepta Pharmaceuticals Ltd. 获得。

2.2. 植物材料的收集和鉴定

PR的果实于2015年6月从孟加拉国婆罗门巴里亚的卡斯巴采集。该植物的鉴定由孟加拉国达卡米尔普尔的孟加拉国国家植物标本馆的专家完成。登录号：PR 的 DACB-41509。

2.3. 植物材料的干燥和研磨

将重约6 kg的PR果实适当清洗，去除脏物，阴干30 min。然后让果实在不规则的阳光下晒干几天。之后，为了更好地研磨，它们在烘箱中在相当低的温度下干燥 24 小时。通过使用合适的研磨机，将干果研磨成粗粉。

2.4. 植物材料的提取

将重约 450 克的粉末状植物材料（水果）装入琥珀色玻璃瓶中，并浸泡在 2 升 98% 的乙醇中。将装有内容物的瓶子密封并在室温（25°C）下偶尔摇晃和搅拌 7 天。7天后，含有提取物的乙醇通过棉花过滤，然后通过Whatman No. 1滤纸。过滤完成后，将得到的提取液滤液浓缩，并在减压下使用旋转蒸发仪在45℃温度下干燥蒸发，得到粗提取物(11.47g)。最后干燥的粗乙醇水果提取物保存在 4°C 的冰箱中，直到进一步实验。

2.5. 动物

在这个实验中，从孟加拉国达卡的 ICDDR,B 获得了 50 只健康的成年雄性瑞士白化大鼠，体重约 200 - 230 克。将大鼠饲养在每只动物 6 只聚丙烯笼子中，并置于标准环境条件下（25°C ± 2°C 温度，60% ± 5% 相对湿度），光照（光照/黑暗 12:12 小时）和充足的食物供应和水。根据美国国立卫生研究院 (NIH) [ 50 ] 的实验动物指南维护动物的使用和护理。实验方案经孟加拉国达卡东南大学药学系动物伦理委员会批准。

2.6. 药物和试验化合物的管理

使用 0.9% 盐水溶液 (pH 7.4) 制备盐酸多奈哌齐溶液，并以 1 mg/kg 体重 (bw) 对实验大鼠进行口服给药。将麦芽酸铝溶解在 0.9% 盐水溶液 (pH 7.4) 中，并以 10 mg/kg bw 的剂量对大鼠口服给药 1 个月。通过使用0.9％盐水溶液（pH 7.4）制备EEPR的悬浮液，并以100和200mg/kg的剂量对大鼠口服给药1个月。本研究的持续时间和多奈哌齐、麦芽酸铝和 EEPR 的剂量我们根据文献综述 [ 46 ] [ 51 ] [ 52 ] 重新选择。每天新鲜制备提取物、多奈哌齐和麦芽酸铝的混悬液，每天上午 10:00 给药一次。

2.7. 实验设计

本实验将大鼠分为六组，每组6只大鼠，如下：

第 1 组：给大鼠施用标准食物和水 1 个月 (Con)。

第 2 组：以 10 mg/kg bw 的剂量向大鼠 (Alu) 口服麦芽酸铝一个月。

第 3 组：给大鼠 (Don) 口服给予剂量为 1 mg/kg bw 的盐酸多奈哌齐 1 个月。

第 4 组：将 10 mg/kg bw 剂量的麦芽酸铝 + 100 mg/kg bw 剂量的植物提取物口服给予大鼠一个月（Alu + EEPR 100）。

第 5 组：将 10 mg/kg bw 剂量的麦芽酸铝 + 200 mg/kg bw 剂量的植物提取物口服给予大鼠一个月（Alu + EEPR 200）。

第 6 组：对大鼠口服给予 10 mg/kg bw 剂量的麦芽酸铝 + 1 mg/kg bw 剂量的盐酸多奈哌齐 1 个月（Alu + Don）。

2.8. 急性毒性研究

急性毒性研究是按照经济合作与发展组织 (OECD) [ 53 ] 的指导方针完成的。对于该测试，将大鼠分成 6 组，每组 6 只大鼠。果实提取物通过胃内管以 100、200、500、1000、1500 和 2000 mg/kg bw 的剂量仅对大鼠口服一次。提取物给药前大鼠禁食3至4小时，给药后禁食1至2小时。但只有水是连续供应的。在接下来的 24 小时内密切观察大鼠的任何行为、神经毒性和 14 天的可能死亡率。

2.9。行为研究

治疗前对大鼠进行1周的训练以熟悉仪器，在此期间它们不接受任何植物提取物或药物。实验是在上午 10:00 到下午 03:00 之间的光照时段在隔音室中进行的。

2.9.1。被动回避（PA）测试

PA 测试用于确定大鼠的敏感记忆取决于情境恐惧条件学习和工具学习 [ 54 ]。PA测试的仪器由明暗室组成，分别为270（深度）×370（宽度）×360（高度）mm。在该设备的两个隔间的中间部分，由一扇直径为 90 毫米的滑动门连接。该设备的底板由一个间隔为 0.9 cm 的金属网格组成，并连接到一个能够产生 0.5 mA 范围内的冲击的冲击发生器。荧光灯用于在灯箱中提供照明 [ 55] . 每个测试包括两个不同的试验，包括获取试验和保留试验。对于采集试验，每只老鼠都被放置在与滑动门相对的墙壁前面的光隔间中。滑动门打开，当老鼠进入黑暗的隔间时，在 15 秒的适应期后，提供了 3 秒的电脚电击 [ 56 ]。在秒表的帮助下，将大鼠进入暗室后的潜伏期记录为初始转移潜伏期 (ITL)。然后将老鼠放回它的笼子里。在采集试验的 24 小时后进行了保留试验，其中当大鼠进入暗室时不给予电击，并且重新进入暗室的潜伏期被认为是逐步潜伏期 (STL)，最高可达 300秒 [45 ] 。在这项研究中，ITL 和 STL 的数量分别在第 29天和第30天确定。基于 ITL 和 STL，内存保留百分比 (MR) 使用以下公式计算：

% MR = (STL - ITL)/ITL × 100

MR 百分比的增加表明记忆保留的改善 [ 57 ]。每次测试后用 70% 乙醇清洁该装置，以去除任何嗅觉线索 [ 58 ]。

2.9.2. 奖励交替 (RA) 测试

RA 测试用于测定大鼠的空间工作记忆 [ 59] . RA 测试装置由三个相同的臂组成，每个臂的尺寸为 500（长）×100（宽）×100（侧壁高度）mm。手臂由迷宫中间的中央正方形连接，形成T形。这三个臂被表示为起始臂、强制臂和新臂。在测试期间，每只大鼠进行6次试验，每次试验包括两个独立的试验，包括强制运行试验和选择运行试验。对于强制运行试验，新臂被阻挡，每只大鼠被定位在面向中心正方形的起始臂中，并由于消耗先前定位的颗粒而被迫进入力臂。之后，老鼠被送回了自己的笼子。在强制运行试验 60 秒后进行选择运行试验，其中打开新臂（即，两只手臂都可以自由选择）。在这个选择运行试验中，力臂保持为空，并且颗粒被放置在新臂中。在选择运行试验期间，如果大鼠进入新臂，则将反应测量为正确反应（CR）。如果大鼠进入力臂，则认为是错误反应（WR）[60 ] [ 61 ]。在这项研究中，CR 和 WR 的数量在第 30天确定。基于 CR 和 WR，MR（即学习任务）的百分比通过使用下面给出的公式计算：

% MR = TCR × 100/TT

其中，TCRs = 正确响应的总数，TTs = 试验总数。MR 百分比的增加被认为是改善认知的指标 [ 60 ] [ 61 ]。每次测试后用 70% 乙醇清洁该装置，以去除任何嗅觉线索 [ 58 ]。

2.10。生化研究

30日后次日治疗期，在麻醉的帮助下，将所有实验组的大鼠处死。将整个大脑从颅骨上分离，然后分离小脑，然后用冰冷的0.9% NaCl洗涤剩余的大脑部分（即没有小脑的大脑部分），最后分离每个半球。然后通过使用两个半球之一，在匀浆器中使用冰冷的 30 mM 磷酸盐缓冲液 (pH 7.6) 制备 10% 脑匀浆。将匀浆在 4°C 下以 20000 RPM 离心 30 分钟，以获得不含任何类型细胞碎片的匀浆，所得上清液用于 SOD 和 CAT 的估计。通过在冰冷的 30 mM 磷酸盐缓冲液 (pH 7. 6) 并在 4°C 下以 20000 RPM 离心 2 小时以获得盐溶 (SS) 部分。用等体积的含有 1% Triton X-100 的冰冷磷酸盐缓冲液重新提取颗粒，并在 4°C 下以 20000 RPM 离心 2 小时，得到去垢剂可溶（DS）部分[62 ] 。为了确定从两个提取过程中获得的 AChE 活性，将上清液储存在 -20˚C。借助牛血清白蛋白 (BSA) [ 63 ] 测量蛋白质浓度。

2.10.1。超氧化物歧化酶 (SOD) 测定

根据 Kakkar 等人 [ 64 ] 的方法测定 SOD 活性。该测试的反应混合物的总体积为 1.6 ml，包含 0.1 ml 186 μM 吩嗪甲基硫酸盐、1.2 ml 0.052 mM 焦磷酸钠缓冲液（pH 7.0）和 0.3 ml 离心后的上清液（1500 × g，10 分钟，然后10000 × g，15 分钟）的 10% 脑组织匀浆。为了开始酶反应，将 0.2 ml 780 μM NADH 添加到反应混合物中。孵育 1 分钟后加入 1 ml 冰醋酸终止酶反应。借助分光光度计在 560 nm 处测定反应混合物的吸光度变化，并表示为 U/mg 蛋白质。

2.10.2。过氧化氢酶 (CAT) 检测

根据Chance 和Maehly 的方法测定CAT 活性，稍作修改[ 65 ]。对于该测试，反应混合物的总体积为 3.0 ml，包含 2.5 ml 50 mM 磷酸盐缓冲液（pH 5.0）、0.4 ml 5.9 mM 过氧化氢和 0.1 ml 10% 脑组织匀浆。然后将反应混合物孵育1分钟，随后借助分光光度计在240 nm处测量反应混合物的吸光度变化。在这里，一个单位的 CAT 活性表示为 0.01 的吸光度变化，单位为 U/min。

2.10.3。脂质过氧化 (TBARS) 测定

TBARS 活性是根据 Iqbal 等人的方法测定的，[ 66] . 反应混合物的总体积为 1.0 ml，由 0.58 ml 0.1 M 磷酸盐缓冲液 (pH 7.4)、0.2 ml 100 mM 抗坏血酸、0.02 ml 100 mM 三氯化铁和 0.2 ml 10% 脑组织匀浆组成. 使反应混合物在摇动水浴中在 37°C 下孵育 1 小时。然后加入 1.0 ml 10% TCA 以终止反应。随后加入1.0 ml 0.67% TBA，将所有试管在水浴中煮沸20 min。然后在离心前将试管转移到碎冰浴中（2500 × g 10 分钟）。每个样品中形成的 TBARS 的量是通过在分光光度计对试剂空白的帮助下测定上清液在 535 nm 处的光密度来测量的，并在 37°C 下使用摩尔消光表示为 nM TBARS/min/mg 蛋白质系数 1。5 M -1 ∙cm -1。

2.10.4。乙酰胆碱酯酶 (AChE) 检测

根据 Ellman 等人 [ 67 ] 的方法测定 AChE 活性。对于该测试，将含有 0.1% BSA 的 25 μl 15 mM ATCI、75 μl 3 mM DTNB 和 75 μl 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) 添加到 96 孔板中，并在 25° 下孵育 5 分钟C。然后使用分光光度计在 405 nm 处测量吸光度。由于底物的常规水解而导致的任何吸光度增加通过在添加酶之前扣除反应速率来调节。然后加入 25 μl 脑组织匀浆（即 SS 和 DS 部分），并在 25°C 孵育 5 分钟后再次测量吸光度。AChE 活性表示为 M/min/g 蛋白质。

2.11。统计分析

结果表示为平均值±SEM，并用单因素方差分析（ANOVA）进行分析。Tukey 的事后检验用于行为研究，在生化研究的情况下，最小显着性差异 (LSD) 是使用 0.05% 和 0.01% 的概率水平的组间比较的事后检验确定的。SPSS 14.0 (Chicago, IL, USA) 和 Microsoft Excel 2010 (Roselle, IL, USA) 用于统计和图形评估。与疾病对照组相比，结果在 P < 0.05 时被认为具有统计学意义。

3. 结果

3.1。急性毒性的测定

高达 2000 mg/kg bw 的剂量水平的 EEPR 对实验大鼠的行为、运动和神经元反应没有有害影响，观察时间长达 14 天。不同剂量的 EEPR 表明皮肤、眼睛、皮毛和体重没有变化的迹象，因此提取物被认为是安全的。

3.2. 使用 PA 测试 EEPR 对大鼠学习和记忆的促智作用

在 PA 测试中，ITL 在第 29天测量，而 STL在图 1中指定的第 30 天（ ITL 24 小时后）测量。与疾病对照组相比，用EEPR果实（即100和200 mg/kg，bw）处理的大鼠在第30天显着（P < 0.05，P < 0.01）增加了大鼠的STL 。与疾病对照组相比，多奈哌齐提示性治疗（P < 0.01）增加了第30天大鼠的STL 。大鼠的 MR 百分比见图 2其中 MR 的增加表明大鼠的学习和记忆能力得到改善。与疾病对照组相比，用 EEPR 果实（即 200 mg/kg bw）处理的大鼠的 MR 百分比显着增加（P < 0.05）。

3.3. 使用 RA 测试 EEPR 对大鼠学习和记忆的促智作用

在 RA 测试中，在第30天测量 WR 和 CR 的数量，如图 3 所示。与疾病对照组相关，多奈哌齐的给药显着增加了第30天CR的数量（P <0.01） 。EEPR水果

图 1。使用 PA 测试，EEPR 对大鼠第 29 天和第 30 天 ITL 和 STL 的促智作用。值表示为平均值±SEM（n = 6/组）。* P < 0.05, ** P < 0.01 与疾病对照组差异显着。

图 2。EEPR 对使用 PA 测试的大鼠 MR 百分比的促智作用。值表示为平均值±SEM（n = 6/组）。* P < 0.05, ** P < 0.01 与疾病对照组差异显着。

图 3。使用 RA 试验，EEPR 在第 30 天对大鼠 WR 和 CR 的促智作用。值表示为平均值±SEM（n = 6/组）。* P < 0.05, ** P < 0.01 与疾病对照组差异显着。

（即 200 mg/kg bw）相对于疾病对照组显着（P < 0.01）增加了第 30 天CR的数量。图 4显示了与疾病对照组相比，经 EEPR 水果（即 100 和 200 mg/kg bw）处理的大鼠的 MR 百分比显着增加（P < 0.05，P < 0.01）。

图 4。使用 RA 测试，EEPR 对大鼠 MR 百分比的促智作用。值表示为平均值±SEM（n = 6/组）。* P < 0.05, ** P < 0.01 与疾病对照组差异显着。

3.4. EEPR 对脑氧化状态的促智作用

表 1代表大鼠脑组织匀浆中抗氧化酶活性的变化。用 EEPR 水果（即 100 和 200 mg/kg bw）处理的大鼠显着（P < 0.05，P < 0.01）增加了 SOD 和 CAT 的水平，但显着（P < 0.05）将 TBARS 的浓度降低到了疾病控制组。多奈哌齐治疗显着（P < 0.05，P < 0.01）增加了 SOD 和 CAT 的水平，并且有意义地（P < 0.05，P < 0.01）降低了疾病控制方面的 TBARS 水平。

3.5. EEPR 对脑 AChE 活性的促智作用

大鼠脑组织匀浆的SS和DS部分中AChE的活性见表2。与疾病对照组相比，多奈哌齐治疗组的脑组织匀浆的SS和DS部分的脑AChE活性显着降低（P < 0.05，P < 0.01）。与疾病对照组相比，给予 EEPR 果实（即 100 和 200 mg/kg bw）暗示性（P < 0.05，P < 0.01）可降低大鼠脑组织匀浆的 SS 和 DS 部分的 AChE 活性。

4。讨论

由于人们的偏好，天然益智药越来越受欢迎 [ 68 ]。目前，世界范围内有一种令人难以置信的冲动，即研究药用植物以改善认知功能，以减少它们的不良影响[ 69 ]。这是第一项通过各种行为和生化研究显示 EEPR 对铝诱导的认知障碍和氧化应激大鼠的神经保护活性的研究。在这项研究中，EEPR 给药 30 天通过改善大鼠的各种类型的记忆、学习、抗氧化酶和抗乙酰胆碱酯酶活性，显示出显着的神经保护作用。

PA 测试通常被称为恐惧加重测试，用于评估学习和记忆 [ 70 ]。在 PA 测试中，大鼠学会避免先前提供了厌恶刺激（即足部电击）的环境。在这个测试中，测量的参数是 ITL 和 STL。一旦大鼠进入黑暗的隔间，潜伏时间被记录为早先确定的ITL。STL 是对厌恶体验记忆的衡量[ 45 ]。用 EEPR 治疗的大鼠的平均 STL 不祥地高于其他组。在研究 Aronia melanocarpa 果汁对大鼠记忆力的影响时，Valcheva-Kuzmanova 等人也报道了类似的发现 [ 71 ]。RA测试用于评估基于改变的学习和记忆

治疗

SOD (U/mg 蛋白质)

猫 (U/min)

TBARS (nM/min/mg 蛋白质)

骗局

9.57 ± 1.62

10.25±1.13

204.58 ± 4.03

铝

6.89 ± 2.24

7.32±2.05

294.76 ± 5.64

大学教师

26.57 ± 1.30**

23.98 ± 3.58*

132.59 ± 4.37*

铝 + EEPR 100

12.67 ± 2.96*

11.04 ± 1.39*

198.62 ± 6.79*

铝 + EEPR 200

14.54 ± 3.45*

14.58 ± 1.42**

182.98 ± 6.97*

铝 + 唐

18.95 ± 1.28*

19.07 ± 2.71**

174.8 ± 5.74**

表 1。EEPR 对大鼠脑抗氧化防御系统生化参数的促智作用。

大鼠脑生化参数表示为平均值±SEM值（n = 6 /组）。* P < 0.05, ** P < 0.01 与疾病对照组差异显着。

治疗

SS AChE (M/min/g 蛋白质)

DS AChE (M/min/g 蛋白)

骗局

0.195±0.052

0.772 ± 0.016

铝

0.303 ± 0.013

1.216 ± 0.031

大学教师

0.085 ± 0.020*

0.296 ± 0.027*

铝 + EEPR 100

0.188 ± 0.042*

0.812 ± 0.067*

铝 + EEPR 200

0.153 ± 0.021**

0.595 ± 0.064*

铝 + 唐

0.106 ± 0.047*

0.406 ± 0.076**

表 2。EEPR 对大鼠脑中 AChE 活性的促智作用。

每组的 AChE 活性表示为平均值 ± SEM 值（n = 6/组）。* P < 0.05, ** P < 0.01 与疾病对照组差异显着。

武器入口[ 72 ]。在 RA 测试中，测量的参数是 WR 和 CR。CRs数目的增加表明大鼠学习记忆能力的提高。在目前的研究中，EEPR 报告了学习和记忆的改善。Sharma 等人在研究金合欢叶的神经增强潜力时，监测了大鼠更好的学习和记忆增强潜力 [ 73 ]。

氧气的代谢是产生超氧化物的重要原因，如果不加以控制，会导致许多类型的细胞损伤[ 74 ]。SOD 是一种金属酶，可在暴露于氧气的细胞中发挥保护作用。它催化超氧化物 (O 2− ·) 自由基歧化或分配成普通分子氧 (O 2 ) 或过氧化氢 (H 2 O 2 ) [ 75 ]。过氧化氢也是有害的，但并非如此，它会被包括 CAT 在内的其他酶降解。CAT 是一种基于血红素的酶，可保护细胞免受活性氧 (ROS) 的氧化损伤 [ 76 ]。它催化H 2 O 2的转化到 H 2 O 和 O 2 ，​​从而保护细胞免受 H 2 O 2 [ 77 ]的有害影响。研究表明，每分钟一个 CAT 分子可以将大约 500 万个 H 2 O 2转化为 H 2 O 和 O 2 [ 78 ]。目前已经很明显，脂质氧化或脂质过氧化是所有年龄患者的多种疾病状态发病机制中的关键步骤 [ 79 ]。脂质过氧化是脂质在各种 ROS（羟基自由基、过氧化氢等）作用下氧化降解的副产物 [ 80] . 这是自由基从细胞膜中的脂质中窃取电子并最终导致细胞损伤的过程。该过程通过自由基链式反应机制继续进行。它最常影响 PUFA 并引发自蔓延的链式反应 [ 81 ]。由于脂质过氧化是一种自我传播的链式反应，因此只有少数脂质分子的初始氧化会导致严重的组织损伤 [ 82 ]。膜脂质的破坏和此类脂质过氧化反应的最终产物对细胞甚至组织的活力尤其危险[ 83] . 目前的研究表明，给予 EEPR 显着增加了脑抗氧化酶的水平并降低了 TBARS 的水平。在 Uddin 等人研究的松散桃地上部分对脑抗氧化标志物和大鼠认知能力的促智活性研究中，也报告了相同的结果 [ 84 ]。

AChE 是体内主要的胆碱酯酶 [ 85 ]。它是羧酸酯酶家族的一种外酶，可催化乙酰胆碱和其他一些起神经递质作用的胆碱酯的分解。AChE 主要存在于神经肌肉接头和胆碱能型化学突触中 [ 86 ]。该研究的结果表明，在 EEPR 处理的大鼠中 AChE 活性显着降低。Uddin 等人在研究叶下珠果实对东莨菪碱诱导的痴呆和氧化应激动物模型的学习和记忆障碍的神经保护作用时，揭示了增加大鼠脑乙酰胆碱水平并增强认知功能 [ 87 ]。

这项研究的结果表明，给予 EEPR 30 天产生了优越的促智作用，并逆转了铝诱导的大鼠认知功能障碍和氧化应激。

5. 结论

本研究得出结论，EEPR 水果通过改善认知功能、脑抗氧化酶和抗乙酰胆碱酯酶活性，对改变大鼠脑中铝诱导的认知功能障碍和氧化应激具有潜在的促智作用。因此，这种水果提取物可以更准确地用于控制神经退行性疾病AD。尽管有这些结果，但需要进一步研究来分离和鉴定有前景的促智化合物并揭示可能的作用机制。

致谢

作者要感谢孟加拉国达卡东南大学药学系提供的研究设施。

道德批准

研究方案经孟加拉国达卡东南大学药学系伦理委员会批准。对动物的照料和使用均按照 NIH 的原则进行。

作者的贡献

这项工作是在所有作者的合作下进行的。MSU 设计了这项研究，编写了协议并管理了研究的分析。MSU、AAM 和 MAI 进行了实验室实验并准备了手稿的草稿。AI 和 MFH 制备了植物提取物并进行了文献综述。SK进行了统计分析。MR 审查了手稿的科学内容。所有作者阅读并认可的终稿。

利益争夺

作者宣称他们没有相互竞争的利益。

缩写

AD：阿尔茨海默病；

PR：叶下珠；

EEPR：Phyllanthus reticulatus 的乙醇提取物；

PA：被动回避；

RA：奖励交替；

SOD：超氧化物歧化酶；

CAT：过氧化氢酶；

TBARS：硫代巴比妥酸反应物质；

AChE：乙酰胆碱酯酶；

ITL：初始传输延迟；

STL：逐步延迟；

MR：记忆保留；

CR：正确响应；

WR：错误的反应；

ROS：活性氧；

NFT：神经原纤维缠结；

Aβ：淀粉样蛋白-β；

ACh：乙酰胆碱；

CCS：中枢胆碱能系统；

PUFA：多不饱和脂肪酸；

HNE：4-羟基壬烯醛；

8-OHdG：8-羟基-2-脱氧鸟苷；

CNS：中枢神经系统；

BBB：血脑屏障；

Cr：铬；

铜：铜；

NIH：国家卫生研究院；

NADPH：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；

ATCI：乙酰硫代胆碱碘化物；

DTNB：5,5-二硫代双-2-硝基苯甲酸根离子；

Tris-HCl：三法氨基甲烷盐酸盐；

BSA：牛血清白蛋白；

TCA：三氯乙酸；

TBA：硫代巴比妥酸；

SS：盐溶；

DS：洗涤剂可溶。

提交您的手稿： http: //papersubmission.scirp.org/

笔记

*通讯作者。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

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