以花茎为外植体的绿藻再生及遗传保真度分析

摘要：Chlorophytum borivilianum是一种极度濒危植物，以其对糖尿病、腹泻、关节炎、不育和勃起功能障碍等的药用特性而闻名。由于种子活力低、休眠期长，需要进行体外再生以进行大规模种植。植物。在本研究中，使用花茎作为外植体优化了直接植物再生。对花梗节段进行灭菌保存，以便在不同组合下直接再生 BAP 和 KIN 补充培养基。在每个节段含有 BAP (2 mg/L) 的培养基上产生的芽数最高，为 15.27 ± 1.14。从花梗再生的多个芽丛被小心地分离并保持在生根培养基上。在含有 0.5 mg/L NAA 的 MS 培养基中观察到每株植物最多有 16.87 ± 1.53 个根。将生根的小苗移入装有土壤的花盆中进行硬化和驯化。硬化植物的遗传稳定性通过起始密码子靶向和简单序列重复分子标记来确认。所有 18 株随机选择的植株都表现出与母株相似的遗传同质性。这是第一份关于体外研究的报道 C. borivilianum花梗再生苗的再生及遗传保真度分析。由于再生和大规模繁殖的标准化方法非常有效且遗传稳定，该协议将有助于C. borivilianum的大规模生产以满足市场需求。

关键词

.绿藻,体外再生, SCoT , ISSR ,遗传 保真;

分享和引用：

Kaushal, N., Alok, A., Kajal, M. 和 Singh, K. (2021) 以花茎为外植体来源的Chlorophytum borivilianum 的再生和遗传保真度分析。生物科学与生物技术进展，12，95-107。doi: 10.4236/abb.2021.124007。

一、简介

Chlorophytum borivilianum是百合科最有价值的药用植物之一。在药学上，它是一种非常重要的植物，因为它的块根含有甾体皂苷、生物碱、类固醇、黄酮类、三萜类、单宁和酚酸 [ 1 ] [ 2 ]。这种植物的药用特性是众所周知的治疗弱点、身体疾病、糖尿病、腹泻、排尿困难、关节炎、不育和勃起功能障碍 [ 2 ] [ 3 ]。干根因其壮阳和天然滋补特性而最常用于传统医学 [ 4]。传统上，它使用种子和块茎种植。然而，通过传统方法的无性繁殖不足以进行大规模种植[ 5 ]。C. borivilianum种子休眠期长、种子发芽差、种子活力低（11% - 24%）限制了其自然再生方法[ 6 ]。由于这些限制，需要基于体外 培养的方法，并已成功用于不同种类吊兰的微繁殖 [ 7 ] [ 8 ]。组织培养，包括愈伤组织诱导、微繁殖和体外 培养在不同种类的吊兰中已经报道了块茎化，例如C. comosum [ 9 ]、C. borivilianum [ 10 ]、C. amanienese [ 11 ] 和C. arundianceum [ 8 ]。体外 微繁殖取决于培养基中使用的外植体和生长调节剂的类型。C. borivilianum的克隆繁殖已经报道了使用 6-苄氨基嘌呤 (BAP)、激动素 (KIN) 和噻二唑脲从发芽幼苗的愈伤组织和下胚轴通过多个芽诱导。根据之前的报告，BAP 和 KIN（0.5 至 15 mg/L）单独和与生长素（2,4-D、IAA 和 IBA）组合在芽诱导、增殖和增殖方面是有效的。[ 6 ] [ 7 ] [ 12 ] [ 13 ] [ 14 ] [ 15 ]。但主要关注体外 再生植物是 DNA 多态性、染色体畸变和序列变化形式的体细胞克隆变异的发生率，因为培养技术、营养培养基的组成、数量以及生长激素和生长条件的组合会导致微繁殖植物的体细胞克隆变异 [ 16 ]。

与具有分生组织的腋芽或花序等外植体相比，分化的植物器官（叶、茎和根）倾向于产生更多的变异 [ 17 ]。此外，与较老的组织相比，年轻的组织更不容易发生遗传变异 [ 18 ]。研究表明，从顶端芽和花序等外植体直接再生小植株最不容易受到遗传修饰的影响 [ 19 ]。然而，由于遗传变异确实发生在 体外培养植物的未分化细胞、分离的原生质体、愈伤组织、组织和形态特征中，因此发生体细胞克隆变异的可能性仍然很小[ 16 ] [ 20 ]] [ 21 ]。基因组指纹可以区分个体、物种和种群，并有助于检测再生植物的同质性。因此，已经开发了基于基因组的方法，包括基于序列的方法和直接多态性方法，用于药用植物的鉴定 [ 22 ]。基于 DNA 的标记，如 SCoT（起始密码子靶向）和 ISSR（简单序列重复）已成功用于研究几种植物物种的组织培养植物的遗传稳定性或变异性 [ 14 ] [ 23 ] [ 24 ] [ 25 ]。

已使用幼芽 [ 12 ] [ 26 ]、种子 [ 6 ]、茎盘 [ 27 ]、未成熟的花芽 [ 15 ]、C.comosum [ 9 ]的顶端分生组织和来自来自C. borivilianum种子 [ 28 ] 作为外植体的体外生长植物。然而，由于与土壤直接接触和种子活力差[ 10 ]，茎盘经常受到细菌污染等缺点已经出现。

本研究是根据最近对不同药用植物的 体外再生和遗传保真度分析的研究设计的 [ 29 ] [ 30 ] [ 31 ]。在我们的研究中，我们使用花茎（节段）作为植物再生和多芽诱导的外植体。然后使用 SCoT 和 ISSR 标记检查再生植物的遗传保真度。使用节段背后的主要思想是存在活跃的分生组织，这为多芽诱导和再生提供了最佳平台。此外，直接再生方法将有助于维持遗传纯合性。该研究的目的是通过在 体外选择健康的花茎来实现的节段再生以产生苗，温室驯化和使用分子标记对硬化植物进行遗传保真度分析。

2。材料和方法

2.1。表面消毒和外植体制备

C. borivilianum的植物保存在昌迪加尔旁遮普大学生物技术系的培养室。大约取2-3个花梗，每个花梗有4-5个节间，用自来水彻底清洗。用0.1%氯化汞进行表面消毒2-3分钟，然后用高压灭菌蒸馏水洗涤4-5次。然后将花梗的节段切成 3-4 厘米的小块并保存在拍摄介质上。

2.2. 培养基制备和培养条件

Murashige and Skoog's (MS) 基础培养基 [ 32 ] 含有氯化钙、维生素、蔗糖和琼脂（Himedia, India）用于体外实验。将 MS 培养基溶解在去离子水中，加入生长调节剂 [苄基氨基嘌呤 (BAP) 和激动素 (KIN)]，并将 pH 值调节至 5.8。所有培养物均保持在 25°C ± 2°C，光照 16 小时，暗光周期 8 小时，光照强度为 3000 勒克斯。

2.3. 使用花茎直接再生的培养基优化

使用从 0-4 mg/L 变化的不同细胞分裂素 (BAP/KIN) 浓度（表 1）优化了从花茎节段的多个芽的直接再生。每个具有不同激素组合的培养皿接种 5-6 个灭菌的淋巴结外植体。如上所述将培养物保持在光照下，每14-15天使用新鲜培养基进行外植体的继代培养。在开始培养 6-8 周后计算再生枝条的数量。

2.4. 根媒体优化

将来源于体细胞胚的多个芽丛和节段分开生根。将单个芽保存在不同的介质上。使用添加了不同浓度 NAA（0.25、0.5 和 1 mg/L）和 IAA（0.25、0.5 和 1mg/L）的生根培养基 (RIM) 的 MS 培养基进行生根诱导。MS 全浓度和 MS 半浓度培养基用作对照，以检查不含生长调节剂的培养基对根诱导的影响。在开始培养 6-8 周后观察根数和长度（表 2）。

2.5. 硬化和驯化

从瓶子或试管中取出每个生根良好的小苗，并用自来水仔细清洗以从根部除去琼脂。将植物转移到含有土壤的花盆中，并用多孔聚乙烯袋覆盖。这些塑料袋覆盖的花盆在受控条件下转移到 Percival 生长室 (Percival, USA) 中 2 周。2 周后取出塑料袋并再次在生长室中保存一周。最后，在植物暴露于外部环境一周后。

2.6. 基因组 DNA 分离和聚合酶链式反应 (PCR)

使用 DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN, Germany) 从 40-45 株硬化植物和母株中分离总基因组 DNA。在 0.8% 琼脂糖凝胶上检查 DNA 的纯度。使用分光光度计（Bio-Rad，USA）对 DNA 进行定量。用无菌蒸馏水稀释每个 DNA 样品，使浓度达到 100 ng/μl。从之前的遗传保真度研究中总共选择了 8 个 SCoT 和 4 个 ISSR 引物（表 3）[ 32 ]。使用 Dream Taq 聚合酶进行 PCR酶（Thermo Fisher，美国）和 100 ng DNA 作为模板。每个 PCR 反应包含 2.5 μl 10X 缓冲液、1 μl 10 mM dNTP、10 pmol 引物 1 U Dream taq 酶和无核酸酶水，总体积高达 25 μl。PCR反应在热循环仪（Bio-Rad，USA）中进行。扩增循环条件如下：初始变性：94°C 3分钟；35 次变性循环：94˚C 45 秒；退火：42˚C - 45˚C 1分钟；在 72°C 延伸 90 秒，最后在 72°C 延伸 10 分钟，共 35 个循环。然后在 Tris 乙酸 EDTA (TAE) 缓冲液中使用 Good view 染色染料 (Br Biochem, India) 将 PCR 产物分离到 1% 琼脂糖凝胶上。使用凝胶记录系统（Bio-Rad，USA）使条带可视化。分析条带模式的多态性。

媒体

BAP (毫克/升)

激动素 (mg/L)

每个节外植体的枝条数

控制 (MS)

-

-

0.87 ± 0.12克

SIM1

1

-

7.40 ± 1.04EF

SIM2

2

-

15.27 ± 1.14一个

SIM3

3

-

11.13±0.64℃

SIM4

4

-

9.13 ± 1.21天

SIM5

-

0.5

6.20 ± 1.00英尺

SIM6

-

1

12.60 ± 1.20b

SIM7

-

2

9.13 ± 0.31天

SIM8

-

3

8.60 ± 0.72德

表 1。细胞分裂素（BAP 和 KIN）对使用C. borivilianum花茎的枝条再生的影响。

N = 3，每个重复由每个处理 5 个外植体组成。列中的值代表平均值±标准偏差。同列字母的平均值差异不显着（P≤0.05）。*N = 3（再生研究的每个重复至少包含 5 个培养物）。

媒体

NAA（毫克/升）

IAA（毫克/升）

根数（平均值±SD）

根长（平均值±标准差）

控制 1

-

-

4.8 ± 0.60e

4.28 ± 0.39e

控制 2

-

-

6.8 ± 1.0e

5.29 ± 0.22天

RIM1

0.25

-

11.47±0.95cd

5.57±0.08cd

RIM2

0.5

-

16.87 ± 1.53交流

6.55±0.20

RIM3

1.0

-

11.20 ± 1.11b

5.87 ± 0.29公元前

RIM4

-

0.25

12.13 ± 1.01bcd

5.53±0.28cd

RIM5

-

0.5

14.27 ± 0.76b

6.23 ± 0.08ab

RIM6

-

1.0

10.60 ± 0.60天

5.31 ± 0.06天

表 2。培养基和生长素 (NAA/IAA) 对C. borivilianum再生枝根诱导和增殖的影响。

对照 1（全强度 MS 培养基）和对照 2（半强度 MS 培养基）。N = 3，每次处理最少 5 个外植体。列中的值代表平均值±标准偏差。同列字母的平均值差异不显着（P≤0.05）。

S. 没有。

引物编号

引物序列

温度 (°C)

扩增条带数

扩大产品范围 (KB)

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

SCOT_1

SCOT_2

SCOT_3

SCOT_4

SCOT_5

SCOT_6

SCOT_7

SCOT_8

ISSR_1

ISSR_2

ISSR_3

ISSR_4

CAACAATGGCTACCACCA

CAACAATGGCTACCACCC

CAACAATGGCTACCACCG

CAACAATGGCTACCACCT

ACGACATGGCGACCGCGA

ACCATGGCTACCACCGCC

CATGGCTACCACCGGCCC

GCAACAATGGCTACCACC

TCTCTCTCTCTCTCTCRT

TCTCTCTCTCTCTCTCRG

TGTGTGTGTGTGTGTGRA

卡卡卡卡卡卡卡卡

42

42

42

42

45

45

45

45

45

45

45

50

3

4

4

6

6

3

5

2

4

5

3

4

0.9 - 1.5

0.8 - 2.0

1.0 - 2.5

1.0 - 2.5

0.6 - 2.2

0.9 - 2.0

0.6 - 2.4

1.1 - 1.3

0.9 - 2.0

0.4 - 2.4

1.0 - 1.6

0.4 - 2.0

表 3。使用的引物列表和再生苗的遗传同质性分析：

2.7. 统计分析

提供的所有数据都是至少 3 次独立实验的平均值，每个实验重复 3 次。在 SPSS 版本 17（SPSS Inc.，Chicago，USA）中 P ≤ 0.05 的方差分析（单因素方差分析），然后使用 SPSS 软件进行 Duncan 事后检验以计算平均显着性差异。

3. 结果

3.1。花梗节段直接再生

将包含6-8个节区的花梗（图1（a））切成小块并用作外植体。没有节点区域的外植体对拍摄媒体没有反应（图 1（b））。很少有外植体在没有任何生长调节剂的 MS 培养基中生长，4 周后产生一个芽（图 1（c））。接种在 SIM2 和 SIM6 培养基上的外植体在培养 13-15 天后在节区显示出小的绿色愈伤组织状结构，进一步变成多个芽团块（图 1 (d)）。在继代培养周期中，这些多个枝条从花梗段上剪下并分成 4-5 个部分，以便枝条的适当生长和繁殖（图 1(e) 和图 1 (f))。在连续继代培养下，这些枝条在枝条诱导培养基上生长 8-10 周（图 1 (g)）。6周后计算不同培养基上每个外植体的枝条数并列于表1中。SIM2 培养基显示每个外植体的最佳芽再生率为 15.27 ± 1.14，而 SIM6 培养基的再生率为 12.60 ± 1.20。其余的射击培养基随着细胞分裂素浓度的增加或减少而显示出芽数的减少。

3.2. 体外 生根和驯化

从多个芽丛中分离出的单个芽被仔细分离并保持在生根培养基上（图2（a））。6周后，对不同培养基上接种的单个分离芽形成的根进行计数，并显示在表2中。MS 全强度培养基显示每个枝条有 4.8 ± 0.60 个根，根长为 4.28 ± 0.39，而很少有分离的植物对培养基没有反应。然而，半 MS 表现出更好的响应，每个外植体有 6.8 ± 1.0 个根，根长为 5.29 ± 0.22。在 MS 培养基中添加 IAA 和 NAA 等生长素增强了根的形成。发现 RIM2 和 RIM5 在诱导根方面更有效，分别产生 16.87 ± 1.53 和 12.13 ± 1.51，根长分别为 6.55 ± 0.20 和 5.53 ± 0.28（表 2）。从管中取出生根植物并用水洗涤以去除多余的琼脂而不损坏根部（图2（b））。然后将小植物转移到具有土壤的盆中并用透明的塑料袋覆盖，以适应 2 周（图 2 (c)）。所有驯化的植物都没有表现出任何形态变化，并且块茎在 4-5 个月内形成（图 2 (d) 和图 2 (e)）。

图 1。(a) C. borivilianum的花梗（外植体） ；(b) 灭菌后在 SIM2 培养基上接种；(c) 在无激素培养基上的芽增殖（仅限 MS）；(d) 在 SIM2 媒体上；(e) 在 SIM2 培养基上将增殖的分生组织区域切除成更小的片段后的芽再生；(f) SIM2 培养基上分生组织区域的一段（切除后）的芽生长；(g) SIM2 培养基上的多芽生长。

图 2。(a) 在根诱导培养基上接种单独分离的枝条；(b) 在生根培养基上接种 6 周后，完全生长的植株显示出健康的枝条和根部；(c) 驯化的植株在硬化 3 周后没有形态变化；(d) 在土质土上 4 个月后硬化的植物；(e) 5 个月后完全生长的健康植物。

3.3. SCoT 和 ISSR 分析

使用 SCoT 和 ISSR 引物对 18 个随机选择的植株进行遗传同质性分析。每个 SCoT 和 ISSR 引物均显示出 0.4 至 2.5 KB 范围内的扩增条带（表 3）。8 个 SCoT 引物产生总共 33 个可重复的 PCR 条带，每个引物平均有 4.08 个条带。在 ISSR 的情况下，使用 4 个引物扩增了总共 16 个条带，每个引物平均 4 个条带。所有体外培养的小植株都显示出与母株相同的条带图案（图 3）。

图 3。显示了母株和 18 个组织培养的C. borivilianum小植株的 DNA 图谱；SCoT_3 (3a)、SCoT_5 (3b)、ISSR_1 (3c)。泳道 1：1 KB DNA 梯；泳道2：母株DNA条带图；L3 - L120 显示直接再生植物的 DNA 条带模式。

4。讨论

外植体易于获得、污染频率较低和再生体的遗传稳定性是外植体选择过程中考虑的最重要因素。在以前的报告中，大多数芽芽和茎盘已被用作初始外植体 [ 26 ] [ 27 ]。这些外植体的主要限制是牺牲整株植物和更高的污染概率。在其他一些研究中，使用了未成熟的花序，但与花茎相比，它的可用性有限，花茎即使在花序枯萎后仍留在植物中 [ 8 ] [ 15 ]。此外，在 体外，与未成熟的花序和腋芽相比，花梗不太精致且易于处理培养。植物激素及其最佳浓度在决定植物组织的命运以及维持遗传保真度方面起着关键作用。在早期的直接芽再生研究中，幼芽 [ 26 ]、茎盘 [ 27 ]、未成熟的花序和花芽 [ 8 ] [ 15 ] 被用作C.borivilianum微繁的外植体。新芽再生，嫩芽 [ 26] 接种到添加了 BAP 和 KIN 的 MS 培养基上。在另一项研究中，将附着有花序轴的未成熟花芽用作外植体进行直接再生。补充有 2 mg/l 激动素和 0.1 mg/l 2, 4-D 的 MS 培养基显示出对多芽诱导的最佳响应 [ 15 ]。

在早期的研究中，Samantray等人。(2009) 使用位于未成熟花序顶端正后方的中段进行枝条再生，其中 BAP (3 mg/L) 与 AdSO 4和 NAA 相结合，每个外植体产生 7.4 个枝条，使用 KIN 补充培养基 [ 8 ] 未观察到反应。在我们的研究中，使用单个节点段最大没有。在 SIM2 和 SIM6 补充培养基上分别再生了 15.27 ± 1.14 和 12.60 ± 1.20 个芽。没有。与之前的报道相比，两种媒体的芽数都相当高 [ 8 ]。Sharma 和 Mohan (2006) 使用未成熟花蕾建立的方案大约需要 50 周才能进行 体外田间转移与我们既定的协议相比，种植植物的时间相当长，在该协议中需要 24-25 周来生产硬化植物。与其他生长调节剂相比，具有 0.5 - 1 mg/L IAA/NAA/IBA 的 MS 培养基显示出更好的生根频率，这与C. borivilianum [ 15 ] [ 26 ]之前的报道一致。在我们的研究中，NAA (0.5 mg/L) 的生根反应优于 IAA。随着浓度的增加，根数开始减少。

为了检查组织培养植物的遗传保真度，可以使用各种分子标记。如今，SCoT 和 ISSR 标记因其比其他标记更好的可解析性而受到广泛关注 [ 14 ] [ 33 ] [ 34 ]。此外，使用一种以上的标记，即ISSR 和 SCoT 有利于更明显地证明结果的合理性。SCoT 标记在其序列中具有起始密码子 (ATG) [ 35 ]，而 ISSR 标记基于 DNA 的非编码区 [ 33 ]。在最近的研究中， SCoT和 ISSR 标记已经常用于评估几种药用植物的遗传稳定性，例如桑树 、Pittosporum eriocarpum、Cleome gynandra和Albizia julibrissin [ 14 ] [ 23 ] [ 33 ] [ 35 ] 与其他标记相比，结果非常有希望。先前的一项研究表明，与其他标记相比，SCoT 的多态信息内容 (PIC) 信息量更大，区分能力更强。SCoT 和 ISSR 标记树状图也显示出竹基因型的密切关系 [ 36]。在另一项研究中，将 SCoT、ISSR 和直接扩增的小卫星 DNA (DAMD) 标记一起用于鹰嘴豆基因型指纹识别的研究表明，与用于遗传评估的其他标记相比，SCoT 和 ISSR 标记提供的信息量很大 [ 37 ]。在C. borivilianum的情况下，关于体外生长植物的遗传评估的报道很少。阿罗拉等人。(2006) 报道，使用 RAPD 标记物， C. borivilianum的长期胚胎培养显示出变异 [ 28 ]。在C. borivilianum直接再生的早期研究中使用茎盘作为外植体，Samantray 和 Maity，（2010 年）使用 RAPD 标记显示与母株的单态性 [ 38 ] 。在我们使用 SCoT 和 ISSR 标记的研究中，其中 18株使用花茎节间随机选择的体外培养的植物显示出与母株相似，因此保持了遗传同质性（表 3）。

与其他再生方法相比，使用花茎节间开发的协议显着降低了体细胞克隆变异的风险。这是第一份使用 SCoT 和 ISSR 标记在C. borivilianum中评估再生植株遗传稳定性的报告。因此，该方法可用于微繁殖，因为其有效的大量繁殖和利用花茎的保存来维持C. borivilianum的遗传稳定性。

5. 结论

C. borivilianum是濒临灭绝的药用植物，其大规模繁殖在农业和商业目的上都有需求。我们已经优化了使用植物花茎直接再生的培养基。首次通过使用节段直接再生的 体外繁殖及其遗传保真度分析成功完成。使用的标记及其扩增的条带模式可能有助于筛选大量种群以检测C. borivilianum的遗传变异。

致谢

NK 感谢新德里大学资助委员会 (UGC) 在 BSR 计划下提供奖学金。作者感谢生物技术系为进行实验提供了必要的设施。

利益冲突

作者声明与本文的发表没有利益冲突。

参考

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