分裂蛋白体系的发展：从二元体系到三元体系

摘要：在人体细胞中发现了数以万计的蛋白质-蛋白质相互作用 (PPI)，其中许多大分子伙伴关系可以决定细胞的生长和死亡。因此，需要开发通过检测它们的相互作用、修饰和细胞位置来对这些大分子进行分类的方法。这将有助于科学家比较患病细胞状态与其正常状态之间的差异，并找到干预这种状态的潜在治疗方法。在过去的二十年中，已经开发了一种称为分裂蛋白质重组或蛋白质片段互补的技术。该技术利用一些蛋白质报告分子的适当片段化，并且可以通过它们的功能检测这些报告的重新折叠以确认感兴趣的相互作用。大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞、植物和活体动物。在这里，我介绍了二元和三元系统中基于荧光和生物发光的分裂蛋白生物传感器的发展。此外，有人通过将其与二聚化策略（CID）的化学诱导剂相结合，开发了分裂蛋白系统。这已被用于识别酶抑制剂和调节蛋白激酶和磷酸酶的活性。在来自世界各地的许多实验室的努力下，已经开发出多种蛋白质分裂系统，用于研究体外和体内的 PPI 、监测生物过程和控制感兴趣的酶的活性。

关键词

蛋白质分裂重组,蛋白质片段互补,二聚化化学诱导剂 (CID) ,蛋白质-蛋白质相互作用 (PPI)

一、简介

近年来，条件性分裂蛋白重组已成为研究各种大分子相互作用的一种方法 [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] [ 4]。为了开发可以有条件地组装和报告是否存在感兴趣的相互作用的成功的分裂蛋白质系统，必须满足某些标准。首先，为开发这些类型的传感器而被片段化的母体蛋白质或酶应该具有易于测量的输出，例如不会被细胞或细胞裂解物中的其他成分显着抑制的荧光或发光。其次，分裂的蛋白质片段本身在重新组装之前不应该有任何活性。第三，除了一些自组装系统（如GFP1-10/GFP11）[ 5]，在检测蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）的系统中，两个蛋白质片段之间的相互作用应该可以忽略不计（<100 倍）。例如，如果被检测的附着蛋白的结合常数为 10 nM，则分裂的蛋白片段的结合常数应大于 1 µM，并且理想情况下是可逆的。第一个条件性分裂蛋白重组系统由 Johnsson 和 Varshavsky 在 1994 年建立 [ 6 ]，其中泛素被分裂成两个片段，只有在融合到两个相互作用的蛋白质结构域时才恢复其折叠的天然结构。从那时起，许多不同的蛋白质，主要是酶，被设计用于开发分裂蛋白质重组系统，包括绿色荧光蛋白及其衍生物 [ 5 ] [ 7] [ 8 ]、二氢叶酸还原酶 [ 9 ]、β-内酰胺酶 [ 10 ]、萤火虫和其他萤光素酶 [ 11 ] [ 12 ] [ 13 ]、烟草蚀刻病毒蛋白酶 [ 14 ]、胸苷激酶 [ 15 ]、分支酸变位酶 [ 16 ]、Cas9 [ 17 ]、辣根过氧化物酶 [ 18 ]、RNA 聚合酶 [ 19 ] 和氨酰 tRNA 合成酶 [ 20 ]。在这些蛋白质中，GFP 及其变体、β-内酰胺酶和萤火虫萤光素酶已被用作开发各种传感器的报告蛋白。21 ] - [ 33 ]。在此，我将首先描述使用荧光和生物发光作为报告信号的分裂蛋白系统的发展，然后将重点介绍其扩展到三元系统以检测小分子和大分子以及控制感兴趣的酶的活性。 ，如蛋白激酶和磷酸酶。

2.方法

在 Scopus 中用“Split protein reassemble”和“Protein fragment compatible”检索手稿。获得约 71 篇和 13,288 篇已发表论文。对于“蛋白质片段互补”的结果，分别检索了“荧光蛋白”和“荧光素酶”的文章，得到1132篇和373篇稿件。阅读这些结果的标题和摘要，最终分别为这两个领域选择了 165 篇和 80 篇手稿。整个过程简述于图1。

3. 基于荧光蛋白的分裂蛋白系统

源自Aequorea Victoria的绿色荧光蛋白 (GFP)由具有中央α-螺旋的β-桶状结构组成。折叠成其天然结构后，GFP 中心螺旋中的三个残基 (S65-Y66-G67) 进行自催化

图 1。文献筛选和选择过程的流式聊天。

在氧化条件下产生荧光团。GFP 及其变体已附着在不同的蛋白质上，蛋白质-蛋白质相互作用通过荧光共振能量转移来测量 [ 34 ]，然而，这对于常规应用来说仍然是一项要求很高的技术 [ 35 ] [ 36 ]。第一个分裂 GFP 是通过在残基 157 和 158 处解剖 GFP 蛋白而开发的，每个片段分别融合到异二聚体亮氨酸拉链 Fos 和 Jun [ 7 ]。结果表明，这是一个有条件的重组系统，因为只有在 Fos 和 Jun 存在时，天然 GFP 蛋白才在体外和大肠杆菌中重新折叠。这项工作由 Kerppola 的小组扩展 [8 ]，这导致了分裂-YFP 系统，一种黄色荧光 GFP 衍生物，用于直接可视化哺乳动物细胞中的蛋白质相互作用。同样，Furman 将此技术扩展到许多其他Aequorea Victoria GFP 变体，包括 GFPuv、Cerulean、EGFP 和 Venus [ 33 ]。

在 Ghosh等人的发现之后。许多实验室极大地扩展了不同分裂荧光蛋白的设计和这种新型报告系统的应用，并为该技术赋予了一个独特的名称：双分子荧光互补（BiFC）。在大多数这些设计中，荧光蛋白的重组被证明在天然条件下是不可逆的，也就是说，当荧光蛋白的天然结构有条件地重组时，这种结构就可以抵抗解离。这种动力学效应可能特别有助于检测体内和体外的低丰度或低亲和力复合物[ 37 ] [ 38] 但对于 PPI 的误解和仔细控制实验而言，这是一个主要问题，需要定期进行防止结合的已知突变 [ 34 ] [ 39 ] [ 40 ]。此外，许多实验室有兴趣用肽和小分子破坏 PPI [ 10 ] [ 11 ] [ 13 ]，这在不受热力学控制的这些系统中也很难完成和解释。为了解决这个问题，两个实验室在两个特定系统上取得了一些进步。Tchekanda 等人开发了一种基于工程D. radiodurans的可逆 BiFC红外荧光蛋白 IFP1.4（使用胆绿素作为其发色团）[ 41 ]。他们已经在体外证明了该探针的可逆性，并将该系统应用于酵母和哺乳动物细胞。等人。设计了一种可逆的绿色分裂蛋白报告基因，命名为 uPPO [基于 UnaG 的蛋白质-蛋白质相互作用报告基因]，在重新折叠后 UnaG 蛋白可以将胆红素作为哺乳动物细胞中的发色团 [ 42 ]。尽管这两个系统都需要结合发色团，但它们提供了一种方法来设计可逆 BiFC 系统，该系统在研究具有低背景信号的 PPI 动力学方面具有巨大的潜在应用。

除了可逆性问题外，BiFC 系统的应用还存在一些其他限制。首先，重折叠过程中发色团形成的成熟时间过长，这导致 PPI 和信号读出之间不可避免的延迟。其次，两个片段的非特异性自重组可以增加背景信号。此外，分裂片段及其融合蛋白的溶解度也可能会干扰该技术的应用。为了解决这些问题，Cabantous等人。基于他们精心设计的超折叠 GFP 蛋白 (sfGFP)首次设计了一个 GFP1-10/GFP11 系统 [ 5 ]，与 avGFP 蛋白相比，它具有 11 个突变，并且在溶液中具有高折叠稳定性 [ 43]。该系统已用于通过这两个片段的自重组来检测感兴趣的蛋白质的溶解度 [ 44 ]。然后它被广泛用作检测蛋白酶 [ 45 ] [ 46 ] [ 47 ]、蛋白激酶和磷酸酶 [ 48 ] 以及其他穿透细胞的肽或货物 [ 49 ] [ 50 ] [ 51 ] 的活性的传感器。此外，卡班图斯等人。修改此系统以创建一个由三个片段（GFP1-9、GFP10 和 GFP11）组成的三方拆分 GFP 系统 [ 52]。与以前的 GFP 系统相比，选择融合其他蛋白质结合伙伴（GFP10 和 GFP11）的域对感兴趣的蛋白质的干扰要小得多，并且避免了聚集问题。更重要的是，该系统最大限度地减少了自组装产生的背景信号。这种新颖的分裂 GFP 系统不仅用于开发小 GTPases 和 sortase [ 53 ] [ 54 ] 的传感器，而且还发现能够促进蛋白质的结晶 [ 55 ] [ 56 ]。

4. 基于荧光素酶的分裂蛋白系统

另一方面，随着分裂 GFP 及其变体的发现，萤火虫和其他萤光素酶也被开发为使用分裂蛋白系统的报告基因 [ 11 ] [ 12 ] [ 13 ]（表 1）。萤光素酶通过催化小分子底物的氧化反应产生发光信号，不需要光输入，背景信号非常低。此外，在体外和体内通过分裂荧光素酶系统对蛋白质-蛋白质相互作用的动态研究表明，分裂荧光素酶是内源性蛋白质表达水平的逆转和敏感报告基因 [ 11 ]。

由于基于生物发光的分裂蛋白系统的卓越优势，一些实验室已经开发出用于可视化 PPI 动态过程的传感器

参考类型

参考编号

以荧光蛋白为报告基因的分裂蛋白重组

[5] [6] [7] [8] [21] [22] [33] [37] - [42] [44] - [56]

以萤光素酶为报告基因的分裂蛋白重组

[11] [12] [13] [24] - [32] [57] - [71]

用二氢叶酸还原酶重组蛋白质

[9]

用β-内酰胺酶重组蛋白质

[10] [23]

用烟草蚀刻病毒蛋白酶重新组装分裂蛋白质

[14]

用胸苷激酶重新组装分裂蛋白

[15]

分裂蛋白重组与分支酸变位酶

[16]

用 Cas9 重组蛋白质

[17]

用辣根过氧化物酶重组蛋白质

[18]

用 RNA 聚合酶重组蛋白质

[19]

用氨酰 tRNA 合成酶重组蛋白质

[20]

用激酶分裂蛋白质重组

[89]

用磷酸酶重新组装分裂蛋白质

[90]

表 1。在分裂蛋白重组技术中作为报告基因的不同蛋白质的参考列表。

在细胞信号通路中。保罗穆鲁根等人。首先将雌激素受体（ER）配体结合域插入海肾萤光素酶或萤火虫萤光素酶，用于活体小鼠中配体诱导的分子内折叠成像[ 57 ]。在这项研究之后，已经开发了几种生物传感器来检测人类 ER α [ 58 ] 突变的影响，同时检测不同配体对 ER 的作用 [ 59 ] [ 60 ]，以及两种类型 ER（ER α和 ER β）[ 61 ]。在其他领域，分裂荧光素酶系统也被用于研究 Myc 蛋白 [62 ] [ 63 ]、Notch 受体 [ 64 ] [ 65 ]、EGFP 及其突变体 [ 66 ] [ 67 ]、G 蛋白偶联受体与β - arrestins [ 68 ] [ 69 ] 和 ErbB2/HER2的相互作用/neu 通路 [ 70 ]。

除了体内检测外，大量体外无细胞表达系统也取得了长足的发展，这些系统使用分离的荧光素酶报告系统测量各种不同的大分子相互作用，显示出易于检测和灵敏度的优势[ 24 ] - [ 32 ]。在无细胞方法中，通过体外转录获得与设计的目的蛋白结合结构域融合的分裂荧光素酶的mRNA，纯化后，融合的分裂荧光素酶片段从细胞裂解物中的mRNA体外翻译. 翻译的分裂蛋白片段可以通过二元系统中的 PPI 或通过添加三元系统中两个融合蛋白结合结构域的靶标，重新组装为其天然和活性形式。

5. 三元分裂蛋白传感器：超越二元相互作用

尽管二元分裂蛋白系统已广泛用于 PPI的体外和体内研究，但在过去十年中已系统地开发了对靶标具有高灵敏度的三元分裂蛋白系统（图 2）。与利用两个相互作用的蛋白质结构域融合到分裂报告蛋白片段的二元系统相比，在三元系统中，两个相互作用有限的蛋白质结合结构域融合到分裂的GFP或分裂的荧光素酶结构域。随着目标或目标分析物的加入，蛋白质结合结构域与分析物分子之间的相互作用使报告蛋白的两个片段接近，这使得天然蛋白质能够重新折叠，从而恢复读取分析物的活性。兴趣。

5.1。核酸传感器及其修饰

Stains等人创造性地设计了一种新型报告基因，其中两个分裂的 GFP 片段融合到设计的天然 Cys2-His2 锌指 DNA 结合域 [ 21 ]。在存在目标 DNA 的情况下，两个 GFP 结构域紧密靠近，并且仅当两个锌指结构域都可用特定的相邻 DNA 位点时才显示重新折叠和发出荧光。后来，通过用其他 GFP 变体替换报告蛋白来扩展该系统，以同时检测多个目标 [ 33 ]、β-内酰胺酶 [ 23 ] 或萤火虫荧光素酶 [ 24 ]，以提高灵敏度。三元系统显示为

图 2。二元系统和三元系统中的分裂蛋白质重组/蛋白质片段互补方法。报告蛋白分为两个片段，在一定条件下重新组装后可以恢复整个蛋白质的功能。这两个片段融合到感兴趣的域（A 和 B）。在二元系统中，这两个结构域的相互作用可以使两个报告片段足够接近蛋白质重新折叠（左下）。在三元系统中，这两个结构域可以通过结合溶液中的第三个结构域（C）形成复合物，从而使报告蛋白重新组装。

是一种通过调节蛋白质结合结构域来检测 DNA 修饰的通用方法 [ 22 ] [ 23 ] [ 30 ] [ 31 ]。在这些系统中，锌指结构域被替换为靶向特定核酸修饰的结合结构域。例如，结合甲基化胞嘧啶的甲基结合结构域 (MBD) 和天然锌指结构域 Zif268 已被用于分裂蛋白系统中，用于检测 DNA 甲基化的特定位点 [ 22 ]，这是一种已知的表观遗传修饰。此外，他们还系统地研究了不同 MBD 家族成员之间的差异及其识别甲基化 DNA 的能力 [ 31 ]。

无细胞分裂荧光素酶系统也适用于设计用于紫外线或氧化依赖性 DNA 损伤的开启传感器。在该设计中，氧鸟嘌呤糖基化酶 1 (OGG1) 或受损的 DNA 结合结构域 2 (DDB2) 与萤火虫萤光素酶 (CFluc) 的 C 末端片段融合，而 MBD 与萤火虫萤光素酶 (NFluc) 的 N 末端片段融合) [ 30 ]。随着蛋白质结构域与相应的特定 DNA 修饰位点的结合，分裂萤火虫荧光素酶显示出重新组装。该传感器为快速检测暴露于不同环境损伤的 DNA 的化学修饰提供了一种简单而灵敏的方法。

与 DNA 的检测相比，由于 RNA 识别域的限制，很少有用于检测特定 RNA 序列的策略。为了克服这个困难，已经开发了三种分裂蛋白质重组策略[ 24 ][ 27 ]。最早的一种是直接利用蛋白质-靶标相互作用，其中 Pumilio (Pum) RNA 结合蛋白赋予结合特定 ssRNA 测序的特异性。

为了开发针对任何用户定义的 ssRNA 靶标的序列特异性组装的一般策略，已发现能够与短双链 RNA (dsRNA) 的 2-核苷酸、3' 突出端结合的 Argonaute (Ago) 被用于目标结合位点。为了获得与 Ago 结构域的结合，通过添加可以靶向溶液中 ssRNA 样品的互补引导寡核苷酸来制备 dsRNA。作为第三种设计，dsDNA 发夹与与 ssRNA 靶标互补的 ssRNA 引导相结合。在该方法中，序列特异性锌指结构域的高亲和力（Kd ~ 低 pM）与狭缝荧光素酶融合，并且可以通过替换目标 ssRNA 的互补 ssRNA 序列来灵活设计特异性传感器。

5.2. 天然蛋白质传感器

在复杂的异质溶液中直接和特异性检测天然蛋白质仍然是一个挑战。然后，通过结合靶向特定天然感兴趣蛋白质的单链抗体或细胞受体片段，开发了一种基于分裂荧光素酶系统的通用方法[ 28 ]。该方法用于检测血管内皮生长因子（VEGF）、gp120和人表皮生长因子受体2（HER2）。这种策略的要求是分裂荧光素酶系统的两个结合域应该能够在不同的位点同时结合目标蛋白，这些位点应该足够接近以允许报告蛋白的重新组装。更重要的是，正如对 HER2 的识别所示，被翻译的单链抗体体外系统可以将该技术扩展到具有完全基于抗体的识别系统的其他应用。

5.3. 蛋白质修饰传感器

从核糖体翻译蛋白质后，蛋白质发生各种翻译后修饰，在蛋白质折叠、定位及其功能中发挥着重要作用。蛋白质的一种翻译后修饰是用聚合物聚（ADP-核糖）或 PAR，它参与 DNA 损伤修复过程 [ 71 ]。弗曼等人。设计了一种分裂荧光素酶系统，通过将两个分裂荧光素酶片段融合到源自阿普他辛和 PNK 样因子 (APLF) [ 72 ] 的 PBZ 结构域来检测这种翻译后修饰，这已显示出对 PAR 的强结合亲和力 [ 73]。该分裂蛋白报告已应用于监测哺乳动物细胞中聚 (ADP-核糖) 化的时间变化和检测体外聚 (ADP-核糖) 糖水解酶的活性，该酶可降解细胞中的 PAR。

5.4. 基于化学诱导二聚化的分裂荧光素酶系统

自从发现雷帕霉素诱导的 FKBP12（FK506 结合蛋白）与 FRB（FKBP12 雷帕霉素结合蛋白）异二聚化 [ 74 ]，一种现在称为二聚化策略或 CID 的化学诱导剂的方法已被开发出来，其中两个非相互作用融合对配体或杂合配体具有亲和力的蛋白质在存在配体的情况下聚集在一起以执行特定功能 [ 75 ]。CID 已被证明是强大的，小配体已被用于控制细胞定位 [ 76 ] [ 77 ] [ 78 ] [ 79 ]，诱导蛋白质剪接 [ 80 ] [ 81 ] [ 82]，选择性地标记蛋白质，以它们为目标进行破坏 [ 83 ] [ 84 ] [ 85 ]，并探测各种细胞功能。

基于分裂蛋白互补和 CID 的概念，Jester等人开发了一种启用卷曲螺旋肽的分裂荧光素酶系统。用于检测蛋白激酶抑制剂（图 3）[ 26 ][ 29 ]。在该系统中，CFluc 结构域与感兴趣的蛋白激酶融合，NFluc 结构域与 Fos 肽融合。在不添加配体的情况下，体外后两个蛋白质片段之间的相互作用有限翻译。Jun-staurosporine 是一种二聚化的化学诱导剂，其设计基于 Fos/Jun 肽相互作用具有高特异性和亲和力，并且星形孢菌素是一种泛激酶抑制剂。在诱导剂 Jun-staurosporine 存在的情况下，发现两个分裂的荧光素酶结构域能够重新组装并恢复酶功能。这种形成的可逆性使得这种三元可以通过添加小分子激酶抑制剂来破坏，小分子激酶抑制剂可以在与星形孢菌素相同的结合位点结合蛋白激酶。

图 3。用于分析蛋白激酶抑制剂的螺旋线圈启用 CID 系统 [ 26 ]。分裂的萤火虫荧光素酶片段与蛋白激酶和一个卷曲螺旋肽 (Fos) 融合。随着 Jun-staurosporine 的添加，萤火虫荧光素酶可以与诱导剂重新组装，这可以通过与蛋白激酶中 ATP 结合位点上的新抑制剂结合而受到干扰。

发现由于小分子破坏导致的发光减少是剂量依赖性的，并且观察到的信号损失遵循特征 S 型曲线，可以测量抑制剂的 IC50 并发现与通过以下方法测量的相似传统的基于放射性的激酶测定。

5.5. 基于化学诱导二聚化的分裂激酶和分裂磷酸酶系统

翻译后修饰控制大多数蛋白质的时间和位置特异性活性。在这些化学修饰中，磷酸化和去磷酸化在调节多种细胞事件中起重要作用 [ 86 ]。超过 500 种人类蛋白激酶和 147 种蛋白磷酸酶是细胞内和细胞外研究的关键线索 [ 87 ] [ 88 ]。最近，CID 技术已成功实现了分裂激酶 [ 89 ] 和分裂酪氨酸磷酸酶 [ 90 ] 与 FKBP 和 FRB 的重组，其中激酶或磷酸酶的催化​​活性可以用雷帕霉素调节。此外，Camacho-Soto等人。还证实，雷帕霉素门控 FKBP/FRB 异二聚体可以被两种基于植物激素的 CID 系统取代 [ 90 ]，这为特定分裂磷酸酶或分裂激酶的小分子活化提供了途径，而不会干扰哺乳动物细胞中的细胞信号传导系统。

六、展望与结论

随着分裂蛋白质重组的发展，可以预测会有更多的生物活性和生物分子过程可以在体外或体内进行监测. 基于分裂蛋白重组的应用已经有多种应用，这种方法的长期潜力令人兴奋，并且受到越来越多的关注。人们已经实现了检测二元和三元伙伴关系的能力，以及快速询问干扰它们的小分子的能力。不断扩大的分裂蛋白质库为对数千个生物分子过程的结果进行时间控制提供了一种手段。这已经能够使用该技术明确控制一种特定信号转导途径的结果，例如蛋白激酶和磷酸酶。最后，可以设想，一般的分裂蛋白三元系统方法可以提供新的治疗和成像方法，在特定细胞中对分裂的有毒蛋白进行有条件的重组。

利益冲突

作者声明与本文的出版没有利益冲突。

参考

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[ 3 ] Shekhawat, SS 和 Ghosh, I. (2011) 蛋白质分裂系统：超越二元蛋白质-蛋白质相互作用。化学生物学的当前观点，15，789-797。

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