蒲桃种子提取物对阿尔茨海默病模型大鼠记忆力减退的影响

摘要：阿尔茨海默病 (AD) 是最突出的痴呆相关疾病，其特征是在受影响的人的脑神经元中或周围存在不溶性淀粉样蛋白 β 肽 (Aβ) 纤维。因此，能够抑制脑淀粉样蛋白沉积的药剂可能会延迟 AD 和相关神经行为症状的发生或延缓其进展。在这里，我们报告了长期口服蒲桃（当地称为果酱）种子提取物是否对注入 A β 1-40的 AD 模型大鼠的进行性认知衰退发挥保护作用。用S. cumini喂养 12 周后种子提取物（300 mg/kg BW），我们通过8臂径向迷宫任务评估大鼠的学习相关记忆，我们确定了两种类型的记忆错误，即参考记忆错误（RME）和工作记忆错误（ WME）。完成记忆测试后，处死大鼠并检测脂质过氧化物 (LPO)、A β 1-40 -负荷、A β 1-40 -寡聚体、促炎性 TNF α、脑源性神经营养因子 (BDNF)、酪氨酸的水平。在大脑的皮质海马组织中测定了激酶 B (TrkB)、突触后密度蛋白 95 (PSD-95) 和突触相关蛋白 (SNAP-25)。此外，小茴香的体外抗氧化作用对种子提取物进行了评价。小茴香提取物的口服给药显着提高了 AD 模型大鼠的记忆相关学习能力，同时降低了皮质海马 A β 1-40 -负荷和 A β 1-40 -寡聚体的水平。此外，该提取物还抑制了 AD 大鼠皮质海马组织和血浆中 TNFα 和 LPO 的水平，表明小茴香提取物在 AD 模型大鼠脑中具有抗氧化和抗炎活性。. S. cumini提取物还增加了大脑认知和记忆相关蛋白的水平，包括 BDNF、TrKB、PSD-95 和 SNAP-25。因此，我们建议S. cumini种子提取物可用于神经行为缺陷和阿尔茨海默病的相关发病机制。

关键词

阿尔茨海默病,孜然,记忆,淀粉样肽,脂质过氧化物, BDNF , TrKB , PSD-95 和 SNAP-25

一、简介

阿尔茨海默病 (AD) 大脑的病理特征包括淀粉样神经炎斑块和神经原纤维缠结，同时伴有神经元的进行性丧失和患者的记忆相关学习能力 [ 1 ]。一旦它从膜结合的淀粉样前体蛋白 (APP) 中裂解并释放出来，β 淀粉样肽 (Aβ) 就会转化为不溶性淀粉样纤维并沉积在受影响人的大脑中 [ 2 ] [ 3 ]。在 AD 脑沉积物中发现的主要淀粉样蛋白种类是 Aβ 1-40和 Aβ 1-42。因此可以想象，输入这些 Aβ 1-40和 Aβ 1-42的短片段也可能导致学习相关的记忆障碍。肽进入大鼠的脑室 [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ]。在这项研究中，我们将 Aβ 1-40注入大鼠心室并制备 AD 模型大鼠。AD 也是一种与年龄相关的神经退行性疾病，并与记忆相关的学习能力下降有关 [ 7 ] [ 8 ]。过去几十年对 AD 进行的大量研究都集中在氧化应激及其对发病机制的影响上 [ 9 ]。自由基导致脂质 [ 10 ] [ 11 ]、蛋白质 [ 12 ] [ 13 ] 和 DNA/RNA [ 14 ] [ 15 ] 氧化] 的神经元，在 AD 中变得非常容易死亡。在这方面，因此抗氧化疗法将对 AD 患者的记忆力下降提供重要的有益效果是合理的。因此，一些研究集中在维生素 E 减轻淀粉样肽的毒性作用并改善认知能力，同时抑制脂质过氧化 [ 16 ] - [ 22 ]。

S. cumini 是孟加拉国的一种季节性水果，可作为抗氧化和清除自由基的植物成分的丰富来源[ 23 ]。这种水果的种子保留了非凡的药用特性，而这些特性在很大程度上仍未被发现。蒲桃属是桃金娘科桃金娘科的属之一。该科植物在热带和亚热带世界[ 24 ] [ 25 ]的不同民族植物学实践中具有丰富的用作食用和传统药物的历史。这些植物对消化系统疾病、利尿 [ 26 ]、肠道疾病 [ 27 ] 和腹泻 [ 28 ] 有益] . 不知何时起，蒲桃也被用作治疗多种疾病的传统药物，如咳嗽、痢疾、癣、痔疮、丘疹和补肝 [ 25 ] [ 29 ]。我们之前报道过，孜然粉具有抗糖尿病活性 [ 30 ] 并保护肝脏免受脂质过氧化，同时改善酒精大鼠的肝细胞解剖结构不完整性 [ 31 ]。与丁羟甲苯 (BHT) 等人工抗氧化剂相比，小茴香籽提取物还表现出更强的体外自由基清除活性。此外，口服小茴香籽提取物可恢复酗酒大鼠大脑皮层的氧化应激 [ 32] . 我们还报道了在缺氧再灌注损伤期间，小茴香籽提取物保护胚胎大脑免受大鼠宫内氧化毒性的影响 [ 33 ]。最近，我们还报道了小茴香籽提取物可提高老年大鼠的记忆相关学习能力[ 34 ]。在所有这些情况下 [ 23 ] - [ 34 ]，有大量证据支持这样的观点，即小茴香提取物也可能对阿尔茨海默病产生积极影响，阿尔茨海默病通常与氧化应激增加有关。因此，我们用 S. cumini 提取物预先给予大鼠并注入 Aβ 1-40进入大鼠脑室以产生AD模型大鼠。之后，我们评估了口服小茴香提取物是否会影响 AD 模型大鼠的记忆障碍。我们还确定了重要的神经元蛋白的水平，例如脑源性神经营养因子 (BDNF)、酪氨酸激酶 B (TrkB)、突触后密度蛋白 (PSD-95) 和突触相关蛋白 25 (SNAP- 25)，对于维持 AD 模型大鼠的大脑认知和学习相关的记忆能力至关重要，受到小茴香籽提取物口服给药的影响。

2。材料和方法

Syzygium cumini (Jam) 购自当地市场。将它们的种子分离、晒干并研磨成粉末。通过使用甲醇提取研磨的种子粉末（图1）。在通过旋转蒸发器蒸发后，将提取物悬浮在蒸馏水中并口服给大鼠和/或用于体外研究。

2.1。动物和饮食

购买了 20 只雄性 Wistar 大鼠（50 周大），并将其饲养在温度（23°C ± 2°C）、相对湿度（50% ± 10%）和明暗循环（光照：08: 00 至 20:00 小时：黑暗：20:00 至 08:00 小时），并提供标准颗粒饲料。然后将它们随机分为 2 组：Aβ 1-40注入阿尔茨海默病 (AD) 模型大鼠 [对照组 (n = 10)] 和

图 1。从成熟果实中收集 S. cumini (Jam) 种子并从种子粉末中提取。

S. cummini 预先给药的 AD 模型大鼠 [测试组 (n = 10)]。试验组给予溶解在0.9%盐水中的小茴香种子粉末提取物（300 mg/kg BW），对照组大鼠（AD）仅接受盐水。口服预给药8周后，对两组大鼠进行手术，制作AD模型大鼠（图2）。从手术压力中完全恢复后，他们接受了八臂径向迷宫任务（用于记忆测试）并继续提取物喂养（另外 5 周）直到行为实验结束。

手术

用戊巴比妥钠(50 mg/kg BW ip)轻轻麻醉大鼠。手术前，去除了颅骨的毛发；在无菌条件下使用手术刀片将颅骨上方的皮肤裂开。然后将大鼠置于立体定向框架中，首先识别前囟门。所使用的手术技术与 Hashimoto 等人先前描述的技术基本相同。(2002) [ 4 ]（图 2）。在暴露的颅骨上钻了两个孔（左右，相对于前囟门；后部 0.8 毫米，横向 1.4 毫米）

图 2。阿尔茨海默病 (AD) 模型大鼠的外科手术。1：手术前的大鼠。2：剃毛，在剃毛部位用消毒液处理。3：将大鼠放在立体定位框架上。4：头骨被打开并清洁。5：识别出前囟门。6：识别出左右心室。心室在 Bergsma 后方 0.8 毫米和外侧 1.2 毫米。7：用微钻钻了两个针孔。图 8：在大脑左右心室上方的头骨上看到两个洞。9：正在将AlCl 3注入右心室。10：正在向左心室输注 Aβ 1-40 。11：输注后（AlCl 3和 Aβ 1-40) 完成后，颅骨的孔被骨水泥封闭。12：缝合后，将大鼠置于37°C的电热板培养箱中。13：手术后切口已恢复（愈合）。14：手术 5 - 7 天后颅骨的状况，表明手术完全恢复。

根据 Paxinos 和 Watson (1986) [ 35 ] 使用立体定位框架 (Narishige, Tokyo, Japan)。通过使用 10-μl Hamilton 注射器，用套管将大约 8.0 nmol Aβ 1-40（在 5 μl 溶剂中）注入大脑左心室 3.5 mm 深约 5 分钟。然后，根据 Oka 等人，使用 Hamilton 注射器将 0.5 μg AlCl 3（5 μl 体积）注入所有大鼠的右心室 3.5 mm 深。(1999) [ 36 ] 稍作修改。从手术中完全恢复后，给 AD 模型大鼠喂食盐水或 S. cumini 提取物（图 3）。

2.2. 行为分析

2.2.1。大鼠的适应试验

动物习惯于实验者和径向迷宫（在记忆实验之前，每天一次，持续 7 天）。一个用于评估学习能力的八臂径向迷宫，设置在地面以上 60 厘米的高度，由一个八角形中心平台组成，周围有八个等距的径向臂（长 50 厘米，宽 11 厘米）。食物杯，深 1.5 厘米，直径 2.5 厘米，位于每只手臂的末端。然后，在五天的时间里，老鼠熟悉了这个装置，奖励颗粒分散在迷宫中。通过这种方式，大鼠习惯于探索放置在桡臂末端的食物杯中的奖励（食物颗粒）。

2.2.2。学习能力数据收集

在熟悉 8 臂迷宫后，对大鼠进行测试试验，如前所述 [ 37 ]。一项试验包括仅用奖励颗粒诱饵四只手臂，并将大鼠放在中心平台上，面对随机选择的手臂。在这里，相同的四只手臂始终被任何一种动物诱饵。测试持续了五周，涉及记忆功能的两个参数：

图 3。实验设计。

参考记忆错误（RME），进入未上钩的武器；和工作记忆错误（WME），重复进入在试验中已经访问过的武器。允许对每只大鼠进行 5 分钟收集颗粒的试验。实验者在迷宫旁保持恒定位置，观察大鼠的行为。

2.3. 脑组织制备

完成记忆评估的行为研究后，用戊巴比妥钠（65 mg/kg BW，ip）麻醉大鼠以收集血液，如前所述在冰上分离海马和大脑皮层 [ 37 ]。组织要么首先储存在 -80˚C，要么立即在含有 2 mM EDTA 和 0.2 mM 苯甲基磺酰氟的冰冷的 0.32 M 蔗糖缓冲液（pH 7.4）中使用 Polytron 均质器（PCU 2-110；Kinematica GmbH，Steinhofhale，瑞士）。匀浆也被离心以制备细胞溶质部分，将其储存在-80˚C，直到进行分析。

2.4. 过氧化脂质 (LPO) 检测

通过测定脂质过氧化物 (LPO) 的水平来评估血浆和脑组织中的氧化应激。LPO 是根据 Hashimoto 等人 (2002) [ 4 ] 的方法通过估算硫代巴比妥酸反应物质 (TBAR) 来确定] . 将样品（血浆和/或全匀浆，0.1 ml）加入到 0.1 ml 8.1% (w/v) 十二烷基硫酸钠、2 ml 0.4% 硫代巴比妥酸的 20% 乙酸溶液（pH 3.5）和 0.1 ml 蒸馏水中. 将每根试管盖紧并在 95°C 下加热一小时。冷却后，将 2 ml 正丁醇-吡啶 (15:1, v/v) 添加到试管中并剧烈振摇约 10 分钟。然后将管在室温下以 1200 × g 离心 10 分钟（数字离心机；DSC-1512SD）。在 532 nm 处测量上清液部分的吸光度。TEP（1,1,3,3-四乙氧基丙烷）用作标准。LPO的水平以nmol/mg蛋白质表示。

2.5. Aβ 1-40和 Aβ 1-40寡聚体的 ELISA

按照 Hashimoto 等人 (2005) [ 38 ]的方法测定Aβ 1-40的水平。Aβ 1-40寡聚体的水平如先前由 Hossain 等人描述的那样确定。（2009 年）[ 5 ]。Aβ 1-40的水平通过使用 β 淀粉样蛋白 1-40 兔重组寡克隆抗体 [Novex by life Technologies，目录号 710174] 通过间接 ELISA 从去污剂不溶性膜组分 (DIF) 确定。Aβ 1-40的水平通过识别肽的氨基酸序列非依赖性寡聚体的构象特异性抗体 [Invitrogen，兔多克隆抗寡聚体抗体 (A11)，Cat # AHB0052] 从细胞溶质部分确定寡聚体。简而言之，多孔板在 100 μl/孔的碳酸盐缓冲液 (pH 9.6) 中涂有去污剂不溶部分 (DIF) 或细胞溶质部分，并在 4°C 下孵育过夜。洗涤三次后，在室温下用 100 μl/孔 3% BSA 的 Tris 缓冲盐水 (TBS) 封闭孔 1 小时。用 TBS 洗涤 3 次后，将各自以 1:1000 的比例稀释的一抗添加到各自的孔中，并在 4°C 下孵育过夜。用 TBS 洗涤 3 次后，将板与 100 μl HRP 缀合的抗兔抗体（Biosource International，Inc.，Camarillo，CA，USA）在室温下孵育 1 小时。最后用 TBS 洗涤 3 次后，用四甲基联苯胺显色反应 30 分钟，用 HCl 终止反应，并在 450 nm 处记录吸光度。样品的吸光度比背景（空白）的吸光度高 4-5 倍。β通过与 Aβ 1-40标准曲线比较来确定皮质或海马中的1-40浓度，并表示为每毫克总蛋白质中 Aβ 1-40的皮克数。然而， Aβ 1-40 + S. cumini 样品中 Aβ 1-40寡聚体的相对浓度是通过考虑对照（单独的 Aβ 1-40）以及 100% 的吸光度来计算的。所有值均标准化为总蛋白质浓度。

2.6. TNFα、PSD-95、SNAP-25、BDNF 和 TrkB 检测

如前所述，使用间接 ELISA 测定 TNFα、PSD-95、SNAP-25、BDNF 和 TrkB 蛋白的水平 [ 39] . 简而言之，多孔板在 100 μl/孔的碳酸盐缓冲液 (pH 9.6) 中涂有 50 μg 胞质蛋白，并在 4°C 下孵育过夜。洗涤 3 次后，在室温下用 Tris 缓冲盐水 (TBS) 中的 1% BSA 封闭孔 1 小时。用 TBS 洗涤 3 次后，一级抗 TNFα 抗体、一级抗 PSD-95 抗体、一级抗 SNAP-25 抗体、一级抗 BDNF 抗体和一级抗 TrkB 抗体，每一种都以 1 的比例稀释1:1000，分别添加到各个孔中，并在 4°C 下孵育过夜。同样，在用 TBS 洗涤 3 次后，将板与 100 μl HRP 偶联的抗兔二抗在室温下孵育 1 小时。最后用 TBS 洗涤 3 次后，用四甲基联苯胺显色 30 分钟，用 HCl 终止反应，在 450 nm (ErbaLisascan II, Mannheim, Germany) 记录吸光度。样品的吸光度比背景（空白）高 4 - 5 倍。但是，Aβ 中 TNFα、PSD-95、SNAP-25、BDNF 和 TrkB 的相对浓度通过考虑对照（Aβ 1-40 -单独）和 100%的吸光度计算1-40 + S. cumini 样品。最后，将所有吸光度值标准化为每毫克蛋白质。

2.7. 体外抗 LPO（过氧化脂质）研究

使用 Dounce 玻璃匀浆器（美国）将来自正常老年大鼠的脑组织在磷酸盐缓冲液（50 mM，pH 7.4）中匀浆。将匀浆调整至终浓度为 100 mg 组织/ml 缓冲液。简而言之，在不存在或存在小茴香种子提取物的情况下，用芬顿试剂[H 2 O 2 (45 mM) + FeSO 4 (2.0 mM)]处理含有来自每个大脑的100 μg蛋白质的100 μl全匀浆。在相同条件下处理对照和单独提取匀浆，不添加芬顿试剂。然后将反应混合物在室温温育4小时。在孵育结束时，LPO 的水平如上文所述测定血浆 [ 4 ] 的水平。

2.8. 小茴香种子提取物的体外自由基清除活性

小茴香种子提取物的抗氧化能力也通过其 DPPH 自由基清除活性进行了分析，如前所述 [ 40 ]。简而言之，在几个浓度（0-1.0 mM GAE，没食子酸当量）下研究了提取物的抗氧化活性。将乙醇中的 DPPH 溶液（0.4 mM，100 μl）和每种提取物溶液（100 μl）或 BHT（0 - 1.0 mM，100 μl）和槲皮素（0 - 1.0 mM，100 μl）的标准溶液（0 - 1.0 mM，100 μl）混合在96 孔板的孔。然后将板密封，摇动 10 秒并在黑暗中放置 30 分钟。然后，将板在室温下进行，再次摇动10 s，然后在515 nm处取吸光度。数据报告为三个测量值的平均值。IC 50值表示为将 DPPH（0.2 mM，最终浓度）的吸光度降低 50% 所需的提取物或标准品（BHT 和槲皮素）的浓度。该值可以通过将吸光度与使用的提取物或标准浓度作图以图形方式确定。

此外，为了直接观察提取物的抗氧化活性，将等分试样的 8 μl 0.4 mM DPPH 溶液进行薄层色谱 (TLC) 板处理。风干后，将 8 μl 提取物和标准品（BHT 和槲皮素）重新涂敷到 DPPH 斑点上。孵育 30 分钟后，用 Image J 对斑点进行拍照和分析。

2.9。孜然提取物的总多酚/类黄酮含量

为了估计 S. cumini 提取物没食子酸的总多酚含量，如 Hossain 等人先前所述，使用没食子酸作为标准。（2012 年）[ 32 ]。简而言之，使用微孔板中总体积为 200 μl 的 Folin-Ciocalteu 试剂 (FCR) 反应混合物中不同浓度的没食子酸 (0 - 0.2 mM) 生成校准曲线。这些溶液在室温下孵育 40 分钟。使用 ELISA 读板器在 710 nm 处记录吸光度。总多酚含量表示为每 100 mg 干粉中的 μmol 没食子酸当量（GAE/100 mg 干粉）。根据 Chang 等人 描述的氯化铝比色测定法估计 S. cumini 提取物的总黄酮含量。(2001) [ 41] . 槲皮素用作标准。总黄酮含量表示为每 100 mg 干粉中 μmol 槲皮素当量（μmol QE/100 mg 干粉）。

2.10。统计分析

结果表示为平均值±SEM（平均值的标准误差）。行为数据通过 2 因子（组和会话）随机区组因子 ANOVA（表示为平均值 ± SD（标准差））进行分析，所有其他参数通过非配对学生 t 检验和/或单向分析进行组间差异ANOVA. 使用的统计程序是 GB-STAT© 6.5.4 (Dynamic Microsystems, Inc., Silver Spring, MD, USA) 和 STATVIEW v4.01 (MindVision Software, Abacus Concepts, Inc., Berkeley, CA, USA)。 P < 0.05 的水平被认为具有统计学意义。

3. 结果

3.1。S. cumini 给药对注入 Aβ 的 AD 模型大鼠 BW 的影响

在 12 周后测量的体重或食物摄入量在对照（Aβ 1-40 + 载体给药）和 S. cumini 种子提取物给药的 AD 模型大鼠之间没有观察到显着差异（P < 0.05）。与 Aβ 1-40 + 孜然种子提取物给药的大鼠体重增加 135.5% 相比，Aβ 1-40注入大鼠的体重增加了 139% 的程度。对照组的平均每日食物摄入量为 15.60 克/大鼠，而 S. cumini 种子提取物大鼠为 16.13 克/大鼠。

3.2. S. cumini 给药对注入 Aβ 的 AD 模型大鼠记忆的影响

图4 (A)显示了长期给予小茴香籽提取物对AD大鼠参考记忆相关学习能力的影响。该分数表示为参考记忆错误 (REM) 的平均数，其中数据是六个试验块的平均值。

基于分数进行随机区组双向 ANOVA（区组和组）。分析显示试验组（F5，41 = 5.96；P < 0.0001）和组（F1，5 = 17.3；P < 0.0002）对

图 4。口服 S. cumuni 提取物对参考记忆错误 (RME) (A) 和工作记忆错误 (B) 的影响。数据是每组六次试验的平均值±SD，显示参考记忆错误的数量，直到大鼠获得所有奖励。通过随机块双向（块和组）ANOVA分析数据。

RME 的数量。该分析还揭示了显着的块组相互作用（F5，205 = 2.403；P = 0.038）。

小茴香口服给药对AD大鼠工作记忆相关学习能力的影响见图4 (B)。该分数表示为工作记忆错误 (WME) 的平均数，数据平均超过六天。基于分数进行随机区组双向 ANOVA（区组和组）。分析显示试验组（F5，41 = 10.76；P < 0.0001）和组（F1，5 = 17.3；P < 0.0001）对 WME 数量有显着的主效应。该分析未揭示显着的块组相互作用（F5，205 = 1.02；P = 0.40）。

3.3. 孜然给药对 AD 模型大鼠血浆和脑 LPO 的影响

与单独注射Aβ 1-40的 AD 对照大鼠相比，饲喂 S. cumini (Aβ 1-40 + S. cumini) 大鼠血浆中的 LPO 水平显着降低了约 28% 。小茴香种子提取物给药 AD 模型 (Aβ 1-40 + S. cumini) 大鼠的大脑皮层 (约 26.5%) 和海马 (约 33%) 的 LPO 水平也降低了(图 5 ) ，与注入 Aβ 1-40的 AD 对照大鼠相比。

3.4. S. cumini 给药对AD 模型大鼠脑中 Aβ 1-40水平的影响

通过间接 ELISA 测定， Aβ 肽1-40的水平在 (Aβ 1-40 + S.孜然）老鼠。这表明 S. cumini 提取物通过某种方式降低了阿尔茨海默病模型大鼠大脑中的淀粉样蛋白负荷（图 6）。

图 5。口服小茴香籽提取物 (SC) 对注入 Aβ 1-40的阿尔茨海默病 (AD) 模型老鼠。结果是 7-9 只大鼠的平均值 ± SEM，每只大鼠重复测定。不同符号的条形在 P < 0.05 时存在显着差异。

图 6。口服小茴香籽提取物对皮质和海马去污剂不溶性膜组分 (DIF) 中Aβ 1-40水平的影响。DIF 的制备方法如前所述[ 38 ]。每个条形代表平均值 ± SEM (n = 7-8)。通过未配对的学生 t 检验分析数据。*P < 0.005。

3.5. S. cumini 给药对AD 模型大鼠大脑中Aβ 1-40寡聚体水平的影响

Aβ寡聚体的相对水平，Aβ 1-40 的毒性最强的种类，在枯草芽孢杆菌喂养的阿尔茨海默病 (AD) 模型 (Aβ 1-40 + S. cumini) 大鼠的皮质中也显着降低（图 7）。这表明 S. cumini 中的成分可能通过在寡聚体形成阶段进行抑制而减少了脑淀粉样蛋白 Aβ 1-40的负担。

3.6. S. cumini 对 AD 模型大鼠 TNFα、BDNF、TrKB、PSD-95、SNAP-25 的影响

S. cumini 的口服给药降低了促炎性 TNFα 的水平，并且总是增加了大脑认知/突触可塑性相关蛋白的水平（图 8）。在 S. cumini 给药的 AD 模型中，促炎 TNFα 水平下降 18%，BDNF 增加 37%，TrKB 增加 14%，PSD-95 增加 31%，SNAP-25 增加 44%大鼠，与单独注射 Aβ 1-40的 AD 大鼠相比。（图 8，上面板）。

S. cumini 给药的 AD 模型海马促炎 TNFα 水平下降 17%，BDNF 增加 27%，TrKB 增加 24%，PSD-95 增加 45%，SNAP-25 增加 28%。 Aβ 1-40 + S. cumini) 大鼠，与单独输注 Aβ 1-40的 AD 大鼠相比。（图 8，下面板）。

3.7. S. cumini 提取物对脑组织匀浆的 Fenton 试剂诱导的氧化应激的影响（体外抗 LPO 效应）

在芬顿试剂 (FR) 孵育的脑样本的匀浆中，LPO 的水平显着增加 (>70%)。这表明在 FR+ 匀浆样品中成功诱导了氧化应激 (OS)，与那些

图 7。小茴香籽提取物口服给药对AD模型大鼠皮层Aβ1-40寡聚体水平的影响。对照（Aβ 1-40单独）样品的平均吸光度值（标准化为 1 mg 蛋白质）被认为是 100%。每个条形代表平均值 ± SEM (n = 7-8)。通过未配对的学生 t 检验分析数据。*P < 0.005。

图 8。上图：口服小茴香籽提取物对 AD 皮质中 (A) TNFα、(B) BDNF、(C) TrKB、(D) PSD-95 和 (E) SNAP-25 水平的影响模型大鼠。下图：口服小茴香籽提取物对 AD 海马中 (F) TNFα、(G) BDNF、(H) TrKB、(I) PSD-95 和 (J) SNAP-25 水平的影响模型大鼠。每个条形代表平均值 ± SEM (n = 7-8)。通过未配对的学生 t 检验分析数据。*P < 0.05。

单独的对照匀浆（图9）。然而，如果在 S. cumini 存在的情况下引发氧化应激，则 LPO 的水平被显着抑制（与对照相比为 28%）。这表明 S. cumini 提取物显着抵抗了氧化应激，如 S. cumini 孵育的脑匀浆中 LPO 水平的降低所示（图 9）。S. cumini 单独也降低了 LPO 的水平。

图 9。种子提取物对大鼠脑组织中氧化应激（OS）诱导的脂质过氧化物（LPO）产生的体外影响。结果表示为平均值±SEM。在 P < 0.05（双向方差分析）时，不共享公共字母表的条形有显着差异。Con = 对照匀浆。OS = Fenton 试剂在匀浆样品中诱导氧化应激。SC = 单独与 S. cumini 提取物一起孵育的匀浆样品。OS + SC = OS 在 S. cumini 提取物预培养的样品中被诱导。

3.8. S. cumini 种子提取物的体外自由基清除作用

小茴香种子提取物与 BHT 和槲皮素的 DPPH 清除活性如图 10所示。非线性分析显示，BHT、槲皮素和小茴香种子提取物的 IC50 分别为 0.12 ± 0.03 mM、0.014 ± 0.001 mM 和 0.006 ± 0.0.001 mM GAE（图 10 (a)）。种子提取物或标准剂量依赖性 (0-0.1 mM) 使 DPPH 斑点脱色 (图 10 (b))。因此，依玛士评价，DPPH 斑点的强度随着提取物和标准品的浓度逐渐降低（图 10 (c)）。这表明 S. cumini 提取物具有抗氧化潜力。

3.9. 孜然提取物的总多酚和类黄酮含量

我们测定了小茴香种子提取物的总多酚/类黄酮含量。S. cumini 种子含有 8.11 ± 0.10 μmol GAE/100 mg 干粉。总黄酮含量为 2.3 ± 0.07 μmol QE/100 mg 干粉。

4。讨论

本研究的目的是调查长期口服小茴香籽提取物是否能改善阿尔茨海默病 (AD) 模型大鼠的记忆相关学习障碍，抑制氧化应激、促炎 TNFα 和提升重要的大脑认知相关蛋白，如 BDNF、TrKB、PSD-95 和 SNAP-25。在定量脂质过氧化测定的基础上，淀粉样肽测定（用于淀粉样蛋白

图 10。(A)：丁羟甲苯 (BHT)、槲皮素 (QCTN) 和小茴香种子提取物的 DPPH 自由基清除作用。每个符号代表三次测定的平均值±SEM。使用双曲线方程 [Y = B max *X = /(K d + X)]对数据进行非线性回归分析，其中 B max是最大抑制，K d是达到最大抑制一半所需的浓度 (IC 50）。(B)：在不存在或存在 BHT、QCTN 和 S. cumini 种子提取物的情况下，TLC 板的 DPPH 染色。清除作用是剂量依赖性的。(C)：使用 ImageJ 分析仪对图 (B) 的 DPPH 点的颜色强度进行 3-D 数字化。

Aβ 1-40负荷和大脑中的淀粉样蛋白寡聚体水平），我们的研究清楚地表明，口服小茴香籽提取物可改善 AD 模型大鼠的记忆障碍。这些改善可能与 S. cumini 给药的 AD 模型大鼠大脑中淀粉样蛋白负荷的降低有关，如 Aβ 1-40纤维和 Aβ 1-40水平的降低所示这些大鼠体内的寡聚体。与神经炎斑块和 tau 过度磷酸化的神经原纤维缠结相关的淀粉样蛋白负荷是阿尔茨海默病大脑的病理标志。Aβ 经历了不同的阶段，包括 α-螺旋向 β-折叠转化、β-折叠成核成低聚物、低聚物成珠成原纤维（原纤维化）和原纤维聚结成更大的纤维，导致成熟的淀粉样蛋白聚集体 [ 2] . 这些分子转变通常与 AD 中的神经元损失和认知缺陷有关。因此，预防 AD 的主要策略是抑制 AD 患者大脑中的淀粉样蛋白沉积。尽管淀粉样纤维沉积物的积累是 AD 的重要特征之一，但纤维斑块的病理意义仍然存在很大争议 [ 42 ] [ 43 ]。相反，淀粉样蛋白寡聚体的水平与 AD 患者的痴呆状态具有更好的相关性 [ 44 ]。克柳宾等人。(2005) [ 45] 报道寡聚体通过抑制长时程增强来降低学习和记忆力。S. cumini 提取物的口服给药降低了 AD 模型大鼠大脑中的淀粉样蛋白负荷（图 6），然而，S. cumini 降低 AD 大鼠的淀粉样蛋白负荷的机制仍有待明确。我们推测 S. cumini 提取物的成分可能抑制了淀粉样蛋白寡聚体，因此抑制了大脑中 Aβ 1-40沉积物的数量。否则，在S. cumini 喂养的 AD 大鼠的大脑中，Aβ 1-40的水平可能不会降低（图 6 ）。与对照大鼠相比，将 Aβ 注入脑室可降低 AD 模型大鼠的学习相关记忆[4 ] [ 38 ]，因此表明注入 Aβ 对 AD 模型大鼠记忆的有害影响的明确证据。因此，在本研究中，我们推断 S. cumini 通过降低 AD 大鼠大脑中的淀粉样蛋白负荷/寡聚体浓度来改善 AD 大鼠的认知缺陷。该结果也与我们之前的报道一致[ 34 ]，即 S. cumini 不仅可以改善老年大鼠的记忆障碍，还可以改善阿尔茨海默病模型大鼠的记忆障碍。

氧化应激的增加，如脂质过氧化物水平的增加所示，归因于阿尔茨海默病中神经元的神经退行性丧失和相关的认知丧失 [ 46 ] [ 47 ]。在我们的研究中，AD 大鼠的记忆缺陷也与血浆和大脑皮质海马组织中 LPO 水平的增加有关（图 5）。S. cumini 的口服给药显着降低了血浆和脑组织中 LPO 的水平（图 5）。因此，可以想象 S. cumini 诱导的氧化应激降低有助于改善 AD 模型大鼠的认知缺陷。推测与体外抗 LPO 作用、DPPH 自由基清除作用一致，同时在 S. cumini 种子的提取物中存在大量的总多酚/类黄酮。

阿尔茨海默病的神经变性也以大脑炎症为特征。因此，AD 脑的病理生理学和相关炎症可能有助于阐明潜在的治疗和预防选择 [ 48 ]。由神经胶质激活驱动的神经炎症有助于神经元的损伤 [ 49 ]。这些报告与本研究的 AD 模型大鼠中 TNFa 水平的升高非常一致。无论机制是什么，我们的结果提供了一个明确的证据，即通过在大鼠脑中心室输注 Aβ 诱导 AD 导致促炎 TNFα 水平的增加。此外，非甾体抗炎 (NSAID) 药物的处方已被证明有益于 AD 症状 [ 50 ] [51 ] 。S. cumini 诱导的 TNFα 水平降低（图 8）因此与这些报道一致，并且在本研究中促炎 TNFα 的改善可能有助于改善 AD 模型大鼠的记忆障碍。

接下来，我们评估了小茴香提取物的口服给药是否会影响大脑突触发生标志蛋白，即 PSD-95 和 SNAP-25。PSD-95 在突触后位点与 NMDA 受体 (NMDAR) 结合并共定位，用于下游信号转导。脑室内输注 Aβ 肽会导致大鼠记忆障碍，相应的突触传递和可塑性相关蛋白水平较低，如 BDNF 和 PSD-95 [ 52 ] [ 53 ] [ 54 ]。因此，我们的结果与这些报告一致。Aβ 1-40的脑源性神经营养因子 (BDNF) 和 TrkB（BDNF 受体）水平显着下降- 注入 AD 大鼠。BDNF 通过激活 TrkB 触发的各种细胞内信号通路介导神经保护活性。BDNF 及其受体 TrkB 是神经元存活、突触形成、大脑神经元可塑性的关键调节因子 [ 55 ] [ 56 ]。在死后 AD 患者中，皮质和海马中的 BDNF 水平也降低了 [ 35 ] [ 36 ]。因此，这些蛋白质水平的降低可能会损害注入 Aβ 1-40的 AD 大鼠的记忆等功能，这些大鼠在喂食 S. cumini 后表现出更好的记忆性能。

预计注入 Aβ 1-40的 AD 模型大鼠大脑中 PSD-95 水平的降低会改变突触后膜位点和相关下游信号的 PSD95-NMDAR 复合物形成，并最终扰乱大脑认知。此外，突触前蛋白 SNAP-25 是 SNARE 复合物的一个组成部分，与钙介导的胞吐作用的触发有关 [ 57 ]，并在突触前神经递质释放中发挥重要作用 [ 58 ]] . AD 模型大鼠的大脑中 SNAP-25 蛋白的水平也降低了。因此，PSD-95 和 SNAP-25 蛋白水平的降低可能会影响 AD 大鼠大脑中突触后神经元的释放和突触传递。因此，PSD95 和 SNAP-25 水平的增加与 S. cumini 提取物对神经递质包装/释放/突触连接性的积极作用一致，最终改善了 S. cumini 喂养的 AD 大鼠的记忆力。

5. 结论

小茴香籽提取物的口服给药显着改善了注入 Aβ 1-40的 AD 模型大鼠的学习相关记忆障碍。改善作用与抑制大脑中的 LPO 水平和 Aβ 1-40血浆中的水平有关+ S. cumini 大鼠。这些效果可归因于 S. cumini 种子提取物的抗氧化潜力。AD模型大鼠口服小茴香后，促炎性TNFα水平降低，脑认知/突触传递相关蛋白BDNF、TrKB、PSD-95和SNAP-25水平升高。最后，得出的结论是，小茴香可用于预防神经退行性疾病，如阿尔茨海默病。然而，小茴香提取物对 BDNF、TrKB、PSD-95 和 SNAP-25 蛋白的确切作用机制仍有待研究。因此，进一步的实验是必须的。

致谢

这项工作得到了政府教育部高级科学研究资助的部分支持。孟加拉国人民共和国（至 SH）。

披露声明

作者宣称没有利益冲突。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

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