动物产生的抗菌肽和化学物质对烟曲霉的影响

摘要：除了限制在食品中使用抗生素作为促生长物质外，细菌、真菌和酵母菌等多重耐药病原体的问题已引起人们的注意，以寻找替代来源，而不是具有抗菌活性的天然产品等常规抗生素。许多兴趣和研究都集中在使用从动物分泌物和一些昆虫毒液中提取的天然抗菌肽和化学物质，因为如果它们与它们的混合物结合使用，它们对病原体具有较低的抗性和较高的协同效应，具有抗菌活性。在本文中，展示了从长颈鹿中提取的一些抗菌化学物质以及它们对曲霉的活性 fumigatus物种使用光密度分析技术，然后将确定它们的最小抑制浓度 (MIC) 以及 IC 50 以测量使用 Gene5 等程序抑制生物功能的效力，图形垫棱镜以及测试一些化学物质的抗菌活性在动物分泌物中提供。

关键词

抗菌素,烟曲霉,抗菌肽

一、简介

1.1。抗菌肽和蛋白质

值得注意的是，抗菌肽尤其是阳离子肽在动物防御局部和一般微生物以及生命物种的自然免疫中发挥着重要作用。这些抗菌肽可能由细菌、真菌或酵母诱发或表达，大多数肽对广泛的微生物菌株以及抗甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA) 和耐万古霉素金黄色葡萄球菌 (VRSA) 等抗菌菌株都很敏感。

其中一些与标准抗生素具有协同作用，因为它们需要许多微生物分泌物（如脂多糖 (LPS) 和脂磷壁酸）的有效活性，这些分泌物可被许多细菌菌株释放并导致致命的感染。与抗生素不同，肽有一个优点，即它们可以阻止组织培养和人类血液中的细菌对蛋白质的诱导，因为肽通过阻断 LPS 与宿主血清大分子的相互作用来做到这一点。离子抗菌肽由脂多糖诱发，可抑制动物宿主细胞对脂多糖的脓毒性反应 [ 1 ]。

动物每天通过摄入、吸入和呼叫接触大量病原体，它们的自然免疫在它们抵抗感染的过程中发挥着重要作用。抗菌肽的作用已被明显放大[ 2 ]，从几十年的报道中发现了一个有希望的证据，即它们的抗菌作用是必要的，因为宿主蛋白、免疫细胞和吞噬细胞。

微生物脂多糖通过常规途径引起的微生物感染，就像哺乳动物免疫系统采用的途径一样 [ 3 ]。

物种分泌抗菌肽的例子

大多数物种产生抗菌肽以及由细菌、真菌、水螅产生的抗菌肽，蜜蜂等昆虫产生乳杆菌素、蜂毒肽、poneratoxin、moricin、ceropin等。[ 4 ]，青蛙产生 dermaseptin 和 magainin [ 5 ]，颅骨产生防御素和 cathelicidin [ 6 ]，甚至哺乳动物也产生联合防御素、cathelicidin 和 protegrin。离子酰胺是指人类血小板原子序数为 20 [ 7 ] 的 C 末端结构域，今天，最广泛使用的抗菌酰胺是乳酸链球菌肽，它是迄今为止唯一经食品和药物管理局批准的抗菌肽，它被用作合成防腐剂[ 8 ]。

1.2. 抗菌化学品

动物总是使用依赖细菌产生的代谢物来防御微生物，如细菌、寄生虫和替代病原体。一些动物（如长颈鹿和鹿）的汗液和油性腺体的分泌物以及鸟类羽毛腺体的分泌物用于此目的，尽管这些化学物质显然是由鸟类使用的。

物种的例子变成了抗菌化学品

大多数动物，如哺乳动物、鱼类、爬行动物和鸟类，都会将抗菌化学物质作为针对微生物的精神分析过程，例如，鸡蛋具有防御机制，为了保护人类和动物的健康，它可能具有多种受害潜力。

鸡蛋是金属元素和金属等营养物质的有效供应。卵子的化学、物理和防御机制保证了保护胚胎免受入侵感染和存在的繁殖。从物理上讲，蛋壳和因此蛋的壳膜阻止微生物渗透到蛋壁。从化学上讲，pH 范围和一致性可以防止微生物增殖和繁殖。在生物学上，蛋白含有多种具有抗菌活性的蛋白质，如微生物细胞溶解、营养结合和金属结合，它们是卵子本身的自然和先天精神分析过程的形式。蛋组合物的不同生物学功能以及免疫调节活性，9 ]。

另一个例子是 hoopoe preen，它分泌抗菌化学物质，经测试建议注射抗生素以检查依赖细菌是否存在于油腺内，因为这种鸟会产生 2 种化学成分不同的化学分泌物。其中一种含有挥发性物质的混合物，而另一种不含这些挥发性物质。检测到所有挥发性化学物质都具有强大的杀菌性能，并且这些化学物质在完全不同浓度下的混合物抑制了一些已通过不同方法检测的细菌菌株的扩张。

据推测，这些化学物质在抗菌活性中发挥作用，即这种动物尿臀腺中存在的依赖细菌与其抗菌活性密切相关，可用于局部用药。从图 3中所示的气相色谱/质谱分析中获得的记录显示了在短萃取时间但 21 分钟时的峰与挥发性物质一致 [ 10 ]（图 1）。

另一个例子，长颈鹿的腺体和毛发含有几种不同的杀菌化学物质，如吲哚、烷基吲哚或粪臭素和苯酚。由于苯酚被广泛用于保存内分泌（图2），因此混合物和组合产生了协同作用，非常受害，可用于防御。

长颈鹿产生这些可能通过完全不同的方式检测到的化学物质，雄性和雌性长颈鹿毛发样本的二氯甲烷或 DMSO 通过气相色谱/质谱分析产生 2 种化学物质，即吲哚和 3-甲基吲哚，这两种化学物质具有很强的责任感除了长颈鹿的强烈气味，替代的化学提取物是对甲酚、庚醛、辛醛、壬醛、苯甲醛、辛烷、十六碳烯酸和十四烷酸（图 3）。

吲哚溶于20℃热水0.19g/100ml，甲基吲哚或粪臭素溶于20℃热水21g/100ml，最后对甲酚溶于40℃水2.4g/100ml摄氏度和 100 摄氏度时为 5.3 克/100 毫升。它还溶于甲醇和乙醚，并在两者中完全混溶。这三种化合物很容易用 DMSO 萃取。

图 1。记录戴胜的分泌物。(a) 代表非繁殖成虫的白色羽毛分泌物。(b) 和 (d) 表示在 (b) 单独操作而不是注射，(c) 注入油腺叶内的盐水和 (d) 注射阿莫西林 6 天后，持续育雏的三个嵌套戴胜的黑色分泌物在泌尿系腺叶内。峰的编号与描述性分析中的化合物列表一致。

图 2。长颈鹿皮肤的解剖结构显示深层和浅表真皮，有汗水、皮脂腺和毛发。

图 3。长颈鹿毛发的主要化学物质吲哚、粪臭素和对甲酚的化学结构。

这些化合物将击败微生物和体外寄生虫节肢动物，这些化合物中的大多数是抑菌和生物过程，这意味着它们抑制细菌和真菌的繁殖，以便它们可能与消毒剂标准抗生素（如抗生素和头孢菌素）一起作用，因为它们显示出对类皮肤的治疗效果病原体和替代微生物，长颈鹿体内对甲酚的含量足以击退任何生物 [ 11 ]，这就是为什么猎人和博物学家将这些化学物质联系起来，因此长颈鹿的强烈气味 [ 12 ] 因此可以检测到长颈鹿而站在距离猎人和狮子和老虎等危险动物 250 米的地方 [ 13] 有些人发现这种气味令人愉悦且引人入胜，但另一方面，一些研究人员认为它并不令人愉悦 [ 14 ] [ 15 ]。已指示长颈鹿气味排斥狮子和其他捕食者，但没有任何测试或任何功能可报告。

据报道，对长颈鹿毛发和替代真皮材料的分析表明存在多种化学挥发性化合物，吲哚和粪臭素对人类具有极强的气味，据报道，它们需要生物过程和抑菌活性来对抗广泛选择的微生物可能存在于皮肤上，以便它们可用于可能被皮肤吸收的抗菌外用制剂和抗菌贴剂。

表 1显示了一些化学品的完整粒子流。

相反的两种生物碱，吲哚和3-甲基吲哚或粪臭素是长颈鹿危险气味的主要原因，因为它们就像天然气味一样。吲哚天然存在于茉莉花、长春花属和橙花中，烷基吲哚和吲哚在高浓度时有一种肮脏的气味，但稀释后用于香水制造是可以接受的 [ 16 ] 但这些化学物质均未检测到在长颈鹿。

吲哚、甲基吲哚和对甲酚的含量存在性别差异，男性在这些化学物质中的含量分别比女性多54%、69%和46%。

这些化合物具有抗菌活性，可能是在动物皮肤和脚癣上发现的可导致人类皮肤感染的嗜动物菌群的毛癣菌可能被吲哚 [ 17 ]、壬醛 [ 18 ]、characid 饱和脂肪酸和十六碳烯酸抑制 [ 19 ]。

许多长颈鹿衍生的化合物可以避免皮肤细菌的扩张。例如，金黄色葡萄球菌被吲哚、苯甲醛 [ 20 ]、辛醛 [ 21 ]、对甲酚、characid 饱和脂肪酸 [ 22 ]、十六碳烯酸和壬醛 [ 23 ] 抑制，这些化合物可用于对抗耐青霉素的金黄色葡萄球菌(MRSA)。

大多数情况下，这些化合物的活性是中等的，但协同作用会使它们的活性更加坚不可摧，因为吲哚与一些化学物质具有协同作用，可以抑制由真细菌引起的龋齿的生长，因为它添加到石竹烯中可以降低最低限制浓度（ MIC）从 1600 µg/ml 到 6.25 µg/ml。

化合物

男性 (%TIC)

女性 (%TIC)

辛烷值

5.6

6.9

苯甲醛

3.7

5.7

庚醛

5.3

2.3

八进制

2.9

3.6

壬醛

22.5

28.9

对甲酚

5.5

3.0

吲哚

6.5

3.0

3-甲基吲哚

14.0

4.7

十四烷酸

8.1

11.4

十六烷酸

11.9

11.3

3,5-Androstadien-17-一

8.1

6.9

小化合物a

6.0

12.5

表 1。从长颈鹿皮肤中检测到的主要挥发性化合物，数值以全粒子电流 (%TIC) 的百分比来表示，(a) 表示具有份额但 2% 的 TIC 未知的次要化合物。

烟曲霉是一种引起侵袭性真菌感染、慢性肺部感染和过敏性支气管肺曲霉病的真菌，它也影响患有艾滋病的免疫缺陷患者和服用免疫抑制剂的患者以及器官移植的肿瘤疾病。它主要被唑类化学物质如吲哚和甲基吲哚杀死，它生长在 SABS [ 24 ] 上。

动物分泌物的治疗应用：

动物肽和化学品是广谱抗菌剂，对革兰氏阳性、革兰氏阴性、原生动物和真菌具有消毒和静电活性。

由于它们的特性、广谱、简单的化学合成和低可能性的微生物抗性，它们被开发为人类的治疗剂 [ 25 ]。动物正在与微生物作斗争，这就是为什么动物的构造是为了自然地击败微生物，因此动物自然地使用肽来击败微生物。

抗生素用于生理和病理上完全不同的环境，动物的体细胞细胞内的颗粒内含有抗生素肽，为非氧化性细胞提供天然的消毒能力[ 26 ]。某些脊椎动物和昆虫的上皮细胞具有特定的几种抗菌肽，可保护动物组织表面免受微生物渗透，因此它是一种天然的机械和生物屏障 [ 27 ] - [ 33 ]。

在一些动物中，例如节肢动物，血细胞可能是血小板类中对血液凝固负责的当前细胞，聚集在伤口宣泄抗菌剂的位置，它们以巨大的一半表示的生理系统代表宿主的分裂动物武器系统简称自然免疫。

这些抗菌动物分泌物的研究涉及完全不同的动物物种以及青蛙、哺乳动物甚至鲨鱼。这些类别的抗微生物剂及其生物系统的每项基础研究除了将它们应用于人类治疗应用外，还涉及用于糖尿病患者腿部溃疡的喷雾剂、贴剂、袜子。动物源性抗菌肽和化学品可用于植物驱除和杀死害虫和昆虫。

2。材料和方法

2.1。化学品

MIC测试概述

为了总结最小抑制浓度测试，纯微生物的培养物已在适当的肉汤中生长。使用公认的标准微生物技术对培养物进行标准化，以获得接近 100 万个细胞/ml 的浓度。微生物培养越标准化，获得的测试结果就越可重复。

抗菌物质经常被稀释，通常使用适当的稀释剂以 1:1 的比例稀释。抗菌剂稀释后，标准体积的体积等于每个稀释容器中添加的稀释抗菌剂的体积，直到微生物浓度接近 500,000 个细胞/ml。

将系列稀释的抗菌物质根据微生物的类型在适当的温度下孵育 18 至 24 小时之间的正确时间，孵育时间越长，获得的结果越可重复。

培养后观察连续稀释的容器以筛选微生物生长，可通过容器底部的混浊或颗粒形成来检测微生物生长，最后一个没有表现出生长、混浊或颗粒形成的稀释容器决定了抗菌剂的最低抑菌浓度.

MIC的优势：

· 易于制备且简单明了，可重现性。

· 可以在非常小的规模上进行，而无需使用大量的抗微生物剂，这对于实验使用的抗微生物剂非常重要，例如生物合成的抗微生物肽。

MIC的缺点：

· MIC测试参数的变化会影响MIC的表观结果。例如，长时间孵育会显示出更高的 MIC，而较低的接种物浓度会导致明显更低的 MIC。

· 在抑菌抗菌剂中，一些微生物会停止生长但没有被杀死，仍然可以有相同数量的细胞等待抗菌剂被中和。

2.2. 微生物培养准备

它主要取决于在适当的培养基中培养烟 曲霉并在适当的温度下孵育。您需要 sabouraud 培养基和蒸馏水以及空瓶、秤和抹刀。

每 500 毫升水的准备量和准备 将这瓶沙氏培养基在 121 摄氏度的高压釜中孵育过夜。

包括烟曲霉在内 的真菌在沙氏培养基中生长。

为该培养基准备 10 个试管，然后在每个试管中加入 10 ml 培养物，并带上含有每种微生物的培养皿。

通过以下方法准备真菌培养基：

用培养基的名称和预期的微生物 ( Asp. fumigatus ) 标记每个瓶子。

取一个线环，将线环放在本生灯的火焰中，直到沿其长度发出红色发光以进行消毒，然后让环冷却。

拿起培养皿并打开盖子，打开盖子形成一条条纹，然后打开试管的盖子，放上适当的培养基，并将环浸入瓶中。

对每支试管重复这些步骤，然后在合适的温度下将每支试管孵育过夜。

通过调整细菌培养物和肉汤之间的比例来稀释培养物（表 2）。

2.3. 光密度分析

在一个干净的试管中，仅加入溶剂只是为了对设备进行去皮，然后从 10 ml 试管中无菌地通过插入 50 μl 培养物对抗 950 μl TE 缓冲液（tris 和 EDTA）将 1/20 培养物制备成溶剂，并且它们具有在 600 nm 波长下测量，然后将培养物稀释至 0.5，吸光度为 0.063，例如，如果 6.3 O. D 500 µl 49.5 ml = 1/100。结果值乘以 20 以获得最终的光密度。

如果光密度如此之高，则可以制备 1/40 的比例，即 25 µl 培养物与 975 µl TE 混合

2.4. 化学品制备

使用 DMSO 作为溶剂提取物吲哚、甲基吲哚（粪臭素）和对甲酚，已为每种微生物制备了 24 个孔板中的 4 个，并将其划分如下（表 3、表 4）。

名称

比率

培养物（毫升）

肉汤（毫升）

ASP。烟熏

1:1

10

表 2。微生物的稀释培养显示培养基和肉汤的比例和量（以毫升计）。

1

2

3

4

5

6

一个

1

2

3

4

5

6

乙

1

2

3

4

5

6

C

7

8

9 (+)

10 (-)

空的

空的

D

7

8

9 (+)

10 (-)

空的

空的

表 3。方案显示 24 孔板的含量，根据其含量和肉汤、细胞和化学物质的浓度 1 指 20 mM，2 指 10 mM，3 指 5 mM，4 指 1 mM，5 指 500 µM , 6 表示 250 µM, 7 表示 25 µM, 8 表示 12.5 µM, 9 表示阳性对照含有不含化学物质的细胞，10 表示阴性对照不含任何细胞或化学物质，仅含有培养基。

代码

井号

比率

浓度

1

A1 和 B1

1

20毫米

2

A2 和 B2

1/2

10毫米

3

A3 和 B3

1/2

5毫米

4

A4 和 B4

1/5

1毫米

5

A5 和 B5

1/2

500微米

6

A6 和 B6

1/2

250微米

7

C1 和 D1

1/10

25微米

8

C2 和 D2

1/2

12.5 µM

9

C3 和 D3

阳性对照

只是细胞

10

C4 和 D4

阴性对照

没有细胞

空的

C5 和 D5

空的

空的

空的

C6 和 D6

空的

空的

表 4。在添加化学品之前，根据图 3，每个孔中所需的培养基和细胞的比例和浓度。

在第一个板中，将 20 µM 吲哚加入到所有孔中的 500 µM 细胞和培养基中，除了最后 8 个孔外，在两个孔中仅放入不含化学物质的细胞作为阳性对照，在另外两个孔中仅放入培养基作为阴性对照。

在第二个板中，将 20 µM 粪臭素加入到所有孔中的 500 µM 细胞和培养基中，除了最后八个孔，在两个孔中仅放置不含化学物质的细胞作为阳性对照，在另外两个孔中仅放置培养基作为阴性对照。

在第三个板中，将 20 μM 的对甲酚加入 500 μM 的细胞和培养基中，除了最后八个孔之外的所有孔中，仅将不含化学物质的细胞放入两个孔中作为阳性对照，在另外两个孔中仅放入培养基作为阴性对照。

在第四个板中，将 20 µM 吲哚、甲酚和粪臭素的混合物加入到所有孔中的 500 µM 细胞和培养基中，除了最后 8 个孔外，将不含化学物质的细胞放入两个孔中作为阳性对照，并放入另外两个孔中把媒体只当成负面的。

对每个板重复此过程，使用不同的微生物，为每个微生物制作四个板，每个板包含吲哚、甲基吲哚（粪臭素）、对甲酚和混合物，然后根据细胞类型、培养基、使用的化学物质对照标记每个板根据表 3，然后将它们孵育过夜（图 4，表 5）。

图 4。方案根据其含量和肉汤、细胞和化学品的浓度显示 24 孔板的含量。

代码

井号

稀释

浓度

1

A1 和 B1

1

4000 微米

2

A2 和 B2

1/2

2000 微米

3

A3 和 B3

1/2

1000 微米

4

A4 和 B4

1/5

200微米

5

A5 和 B5

1/2

100微米

6

A6 和 B6

1/2

50微米

7

C1 和 D1

1/2

25微米

8

C2 和 D2

1/2

12.5 µM

9

C3 和 D3

1/10

1.25 µM

10

C4 和 D4

阳性对照

化学品

空的

C5 和 D5

阳性对照

化学品

空的

C6 和 D6

阴性对照

只做肉汤

表 5。添加化学物质后，根据图 3，每个孔中所需的介质和细胞的化学物质的比率和浓度。

2.5. 化学品的光密度分析

使用 Gen5 软件单独输入每个板，通过每个孔的荧光测定获得显示光密度的结果，评估每种化学物质的作用和微生物对其的反应，将结果输入到 Excel 表中，显示孔的浓度、名称使用的微生物和化学品。光密度比紫外光谱法更优选，因为紫外线本身具有抗菌活性，可能会干扰化学作用对微生物的结果。通过以下等式计算效力百分比：

效力百分比 = 100 - (化学品 OD/混合物 OD) * 100

2.6. 微生物统计分析

使用GraphPad prism输入从gene 5服务器的excel表中获得的数据，然后进行非线性回归，得到显示每种微生物生长抑制的图形并计算IC50，该曲线可以通过剂量反应抑制拟合，然后绘制log µM 抑制剂与获得可变斜率的响应由四个参数组成，当您具有更高的光密度时，您将需要降低浓度，因此较低的 IC 表示较高的效力，这意味着最小剂量的化学物质是有效的。

3. 结果

3.1。光密度测量（表6）

阅读

光密度

空白的

零

零

ASP。烟熏

零

零

表 6。Asp 的光密度结果fumigatus根据读数乘以 20。

化学品的化学制备和光密度分析

这取决于微生物的种类和种类以及化学品的种类和浓度，如下图所示，有些微生物在给定浓度下受到化学品的影响，而另一些微生物对化学品的影响不够，需要更高的浓度。对于光密度，计算与每个浓度相关的结果的平均值，包括阳性和阴性对照。

ASP。 烟熏

混合

它表明它在 4 mM 到 1 mM 的浓度下杀死细胞，之后对细胞无效（图 5，表 7）。

甲酚

表明它仅在 4 mM 浓度下杀死细胞，之后对细胞无效（图 6，表 8）。

图 5。混合物对烟曲霉的 影响在 4 mM 到 1 mM 的浓度下显示出生长抑制。

图 6。甲酚对烟曲霉的影响在 4 mM 浓度下显示出生长抑制。

专注

意思是

4毫米

0.097

0.095

0.096

2毫米

0.096

0.093

0.0945

1毫米

0.092

0.089

0.0905

200微米

0.598

0.571

0.5845

100微米

0.992

2.214

1.603

50微米

1.612

1.288

1.45

25微米

0.685

1.504

1.0945

12.5 µM

0.876

1.414

1.145

1.25 µM

1.424

1.702

1.563

阳性对照

1.858

1.904

1.634

1.444

1.71

阴性对照

0.091

0.091

0.091

表 7。从 4 mM 到 1.25 μM 的浓度之间的光密度值以及与混合对Asp 的影响相关的阳性和阴性对照。烟熏_

专注

意思是

4毫米

0.487

0.582

0.5345

2毫米

1.433

1.853

1.643

1毫米

1.834

1.754

1.794

200微米

1.808

1.797

1.8025

100微米

1.622

1.882

1.752

50微米

1.7

1.68

1.69

25微米

1.832

1.706

1.769

12.5 µM

1.759

1.744

1.7515

1.25 µM

1.784

1.726

1.755

阳性对照

1.847

1.759

1.259

1.906

1.69275

阴性对照

0.097

0.093

0.095

表 8。从 4 mM 到 1.25 µM 的浓度之间的光密度值以及与甲酚对Asp 的影响相关的阳性和阴性对照。 烟熏_

吲哚

它表明它在 4 mM 到 1 mM 的浓度下杀死细胞，然后对细胞无效（图 7，表 9）。

粪臭素

显示它在 4 mM 到 200 μM 的浓度下杀死细胞，之后对细胞无效（图 8，表 10）。

3.2. 统计分析

通过在 OD 600 (nm) 和化学品的对数 (µM) 之间绘制图表来说明微生物生长抑制，从而获得抑制浓度 IC50 和 R 平方，这将导致根据前面表格的值测量效力。

烟曲霉

混合

下图显示了 OD 600 与混合物对数浓度的关系，IC50 约为 196.7 µM，R 平方为 0.7806 µM（图 9）。

甲酚

下图显示了 OD 600 与对数甲酚浓度的关系，IC50 约为 2314 µM，R 平方为 0.944 µM（图 10）。

吲哚

下图显示了 OD 600 与吲哚对数浓度的关系，IC50 平均值在 102.7 µM 至 1036 µM 之间，其中 IC50 约为 326.3 µM，R 平方为 0.9068 µM（图 11）。

粪臭素

下图显示了 OD 600 与粪臭素对数浓度的关系，IC50 平均值在 5.718 µM 至 2278 µM 之间，其中 IC50 约为 114.1 µM，R 平方为 0.5944 µM（图 12）。

专注

意思是

4毫米

0.094

0.094

0.094

2毫米

0.09

0.09

0.09

1毫米

0.09

0.092

0.091

200微米

0.772

2.079

1.4255

100微米

1.392

1.756

1.574

50微米

1.768

1.634

1.701

25微米

1.56

1.789

1.6745

12.5 µM

1.63

1.747

1.6885

1.25 µM

1.736

1.822

1.779

阳性对照

1.981

1.805

1.893

1.75

1.85725

阴性对照

0.09

0.091

0.0905

表 9。浓度从 4 mM 到 1.25 µM 之间的光密度值以及与吲哚对Asp 的影响相关的阳性和阴性对照。烟熏_

专注

意思是

4毫米

0.173

0.181

0.177

2毫米

0.094

0.092

0.093

1毫米

0.652

0.09

0.371

200微米

0.406

0.1

0.253

100微米

0.794

1.079

0.9365

50微米

1.492

1.399

1.4455

25微米

0.229

1.555

0.892

12.5 µM

0.39

1.413

0.9015

1.25 µM

1.071

1.637

1.354

阳性对照

1.741

1.837

1.648

1.848

1.7685

阴性对照

0.091

0.092

0.0915

表 10。浓度从 4 mM 到 1.25 µM 之间的光密度值以及与粪臭素对Asp 的影响相关的阳性和阴性对照。 烟熏_

图 7。吲哚对烟曲霉的 影响在 4 mM 到 1 mM 的浓度下显示出生长抑制。

图 8。粪臭素对烟曲霉的 影响在 4 mM 到 200 µM 的浓度下显示出生长抑制。

图 9。GraphPad 以纳米计显示光密度与与Asp相关的混合对数。烟熏_

图 10。GraphPad 以纳米计显示光密度与与Asp 相关的甲酚对数。 烟熏_

图 11。GraphPad 以纳米计显示与Asp 相关的吲哚对数的光密度。 烟熏_

图 12。GraphPad 以纳米计显示与Asp 相关的粪臭素对数的光密度。 烟熏_

4。讨论

尽管人们希望从动物来源中提取化学物质，因为它已经

图 13。显示Asp 的 IC50 的图表fumigatus如果存在吲哚、甲基吲哚、粪臭素和混合物。

很难负担得起，所以买了这些化学品，它们对Asp 有明显的效果。 烟熏_ 由于结块，真菌的光密度超出了规模，因此没有得到预期的结果，而且浊度也不足以证明细胞已经生长，因此可以使用活菌计数和连续稀释技术。

之前的数据显示，吲哚、粪臭素和甲酚的混合物比单独使用每种化学品具有更多的协同作用，同时，它在稀释对甲酚的毒性作用方面发挥着重要作用。在图形垫棱镜观察统计分析的情况下，尽管 IC50 在某些图形中是模棱两可的。然而，如果这种组合应用于药用，这有助于确定有效且经济的剂量。

烟曲霉：

在其与混合物的化学制备过程中，1 mM、4 mM 与甲酚、1 mM 与吲哚和 200 mM 与粪臭素的混合物显示细胞死亡至少浓度，混合物的 IC50 为 196.7 µM，甲酚的 IC50 为 2314 µM，吲哚的 IC50粪臭素为 326.3 µM，IC50 为 114.1 µM，这表明混合物和粪臭素的治疗效力（图 13）。

因此，该混合物在真菌感染中更具协同作用，而粪臭素是该组合中最有效的成分。

5。结论

基于这些结果的未来工作，可能会进一步完成His标签克隆，因为一些标签参与肽的活性丧失，并且可以测量光密度以使用N和C末端测量其抑制作用。

酵母的克隆和表达可以进一步使用其他蛋白质肽进行，如乳铁蛋白和乳铁蛋白，它们存在于许多哺乳动物物种的乳汁中并具有抗微生物活性。它可以从鲸鱼、骆驼和海豚的乳汁中提取，这取决于它们的疏水性和有助于其渗透到微生物细胞壁的β-折叠。

对于化学品，吲哚、粪臭素和甲酚的混合物可用于局部使用，以保护身体免受皮肤病的影响。这种混合物可局部用作贴剂、软膏或乳膏，尤其适用于某些皮肤病。

以及将其用于植物作为洋葱来驱除感染植物尤其是洋葱的烟曲霉。 如果将这些化学物质用作喷雾剂来驱除苍蝇和蚊子等昆虫，它们的物理特性可能是有益的。

需要进一步的研究来了解这种组合的整体特性及其对更多微生物的作用及其对肝微粒体酶的抑制作用。

致谢

非常感谢 Glen McCann 博士：他的监督，Neil Horley 博士：项目负责人 Noha Gamal 博士：修改了这份手稿和她的方向， Randolph Aroo 博士教授：他的辛勤工作和讨论这项研究的负责人，史密斯先生：波特兰实验室的实验室技术员，感谢他的合作工作。

利益冲突

作者声明与本文的发表没有利益冲突。

参考

[ 1 ] Robert, EWH 和 Monisha, GS (1988) 抗菌肽在动物防御中的作用。不列颠哥伦比亚大学微生物学和免疫学系，加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华，1-2。

[ 2 ] Hancock, REW 和 Lehrer, R. (1998) 阳离子肽：抗生素的新来源。趋势生物技术，16, 82-88。

[ 3 ] Hetru, C.、Hoffmann, D. 和 Bulet, P. (1998) In：Brey, PT 和 Hultmark, D., Eds.，昆虫免疫反应的分子机制，Chapman & Hall，伦敦，40-66。

[ 4 ] 昆虫抗菌肽 OPM (2017) 膜数据库 (OPM) 中蛋白质的方向。

[ 5 ] 两栖类抗菌肽 (2017) 膜数据库 (OPM) 中蛋白质的方向。

[ 6 ] Yang, M., Zhang, C., Zhang, X., Zhang, MZ, Rottinghaus, GE 和 Zhang, S. (2016) 鸟类 β-Defensin-6 和 β-Defensin-12 的结构-功能分析：电荷桥和二硫桥。BMC 微生物学，16，第 210 条。

[ 7 ] Niedermaier, H. (2012) 抗菌肽的合成模拟物：抗生素的新浪潮。乔治亚大学化学系。

[ 8 ] Kohn, EM, Shirley, DJ, Arotsky, L., Picciano, AM, Ridgway, Z., Urban, MW, Carone, BR 和 Caputo, GA (2018) 阳离子侧链在 C18G 抗菌活性中的作用。分子, 23, 329.

[ 9 ] Rzedzicki, J. 和 Stepień-Pysniak, D. (2009) 鸡蛋的抗菌防御机制及其用于保护人类和动物健康的可能性。波兰卢布林生命科学大学动物疾病生物基础研究所禽病科，玛丽亚居里-斯克洛多夫斯卡大学年鉴。Sectio DD, Medicina Veterinaria, 64, 1-8。

[ 10 ] Manuel, M.-V., Aránzazu, P., Juan, MP-S., Lourdes, S., Samir, A., Magdalena, R.-R. 和 Juan, JS (2009) 戴胜普林分泌物中的抗菌化学物质是由共生细菌产生的。皇家学会会刊，277, 123-130。