EGCG-S对肺细胞氧化应激和肠病毒69感染的影响

摘要：

肠道病毒是新出现的疾病的罪魁祸首，这些疾病会引起不同的症状，并可能导致神经系统并发症。尽管肠道病毒之间的发病机制存在差异，但具有多种作用机制的抗病毒药物可以帮助预防肠道病毒介导的疾病，包括最近发现的肠道病毒 69 (EV-69)，其发病机制尚不清楚。本研究调查了表没食子儿茶素-3-没食子酸酯硬脂酸酯 (EGCG-S)，一种抗氧化剂绿茶儿茶素表没食子儿茶素-3-没食子酸酯 (EGCG) 的改良形式，在体外抑制肺成纤维细胞 EV-69 感染的功效. EGCG-S 治疗对 EV-69 介导的细胞毒性有适度的保护作用，这可以通过增加代谢活性以及维持细胞形态和线粒体功能来证明。这些影响与浓度小于 100 μM 的 EGCG-S 处理后感染细胞中过氧化氢产生减少相关，表明抑制 EV-69 介导的氧化应激的作用。本研究提供了对 EV-69 感染特征以及 EGCG-S 介导的 EV-69 感染抑制作用的深入了解。

关键词

ROS ,肠道病毒 69 ,小核糖核酸病毒,绿茶黄烷醇,抗氧化剂, 抗病毒 , MRC - 5 细胞, A549 细胞

一、简介

肠道病毒包括小核糖核酸病毒科中大量多样的无包膜 RNA 病毒属。该属的成员分为 15 个物种，所有这些物种都与多种疾病有关，因为它们的嗜性包括胃肠道、呼吸道和神经元细胞 [ 1 ]。这使得影响胃肠道或呼吸道的肠道病毒感染也会导致神经病变和脑膜炎等致命疾病 [ 2 ] [ 3 ]。

肠道病毒的快速突变率允许出现能够引起严重疾病的菌株，甚至在相同种类的肠道病毒中，发病机制也可能有很大差异。例如，人类肠道病毒 D 物种包括导致呼吸道疾病和急性弛缓性麻痹的肠道病毒 68 (EV-68)，而另一种血清型 EV-70 主要与急性​​出血性结膜炎有关 [ 4 ] [ 5 ]。这些血清型是最近分离的四种肠道病毒中的两种，还有 EV-69 和 EV-71。EV-71 会导致手足口病 [ 6 ]。EV-68 和 EV-70 以及 EV-71 都与严重的神经系统疾病有关 [ 7 ] [ 8 ] [ 9]。然而，自 1959 年在美国首次报道分离到 EV-69 以来，关于 EV-69 的发病机制的很多信息仍然未知 [ 10 ]。这种类型最初与类似于 EV-68 [ 11 ] 的呼吸系统疾病有关，但近年来已在全球范围内与急性弛缓性麻痹和脑炎 [ 12 ] - [ 18 ] 的患者分离]。虽然肠道病毒感染周期的一些共同特征可能适用于 EV-69，但对这种肠道病毒血清型的组织嗜性缺乏了解。这种和其他新出现的肠道病毒可能会继续导致暴发和疾病相关的死亡率，因此需要新型抗病毒药物来缓解感染，无论肠道病毒类型如何。因此，理想情况下，此类抗病毒药物能够同时靶向感染周期的多个阶段，以解决肠道病毒之间的差异，例如不同的宿主受体利用。

在这里，我们研究了一种来自茶树植物的化合物 （称为表没食子儿茶素-3-没食子酸酯 (EGCG)）的氧化应激调节和治疗特性。EGCG 是一种绿茶多酚，已应用于多种传染病模型，用于抑制微生物生长和病毒感染性 [ 19 ] [ 20 ] [ 21 ]。据报道，EGCG 对包膜病毒和非包膜病毒（包括肠道病毒柯萨奇 B3 和 EV-71 [ 21 ] - [ 26 ]）均具有抗病毒作用。此外，它已被证明在体内具有良好的耐受性甚至用于减轻小鼠中与神经毒性相关的病毒蛋白 [ 20 ] [ 27 ]。虽然经常提出 EGCG 介导的抗病毒作用背后的机制是由于干扰病毒对宿主细胞的附着 [ 28 ]，但一些研究发现，与抑制相关的是 EGCG 的抗氧化特性和调节细胞氧化还原的能力感染 [ 26 ] [ 29 ] [ 30 ] [ 31]。EGCG 通过各种方式抑制病毒感染的能力显示出开发抗病毒剂的希望，该抗病毒剂可适用于发病机制尚不清楚的新兴病毒。此外，已经对 EGCG 的结构进行了修改，以提高其稳定性和生物利用度 [ 23 ] [ 32 ]。这包括 EGCG (pEGCG) 的棕榈酰化，这导致比 EGCG [ 23 ] 更有效地抑制 Vero 细胞中的 HSV-1 吸附和感染。此外，将硬脂酸添加到 EGCG 以制备表没食子儿茶素-3-没食子酸酯 - 硬脂酸酯 (EGCG-S) 是另一种增强稳定性的修饰，并且在高达 75 μM 的浓度下也能抑制 A549 细胞中的 HSV-1 感染，而不会引起细胞毒性，类似于 EGCG [33 ]。在这项研究中，我们研究了 EGCG-S 对感染细胞的细胞保护作用，并评估了 EGCG-S 在抑制 EV-69 在 MRC-5 细胞和 A549 细胞中感染的功效。MRC-5 和 A549 肺成纤维细胞是适合体外研究的模型，因为 EV-69 与非典型呼吸系统疾病有关。

2。材料和方法

细胞培养维护

贴壁的人肺上皮 A549 细胞 (CCL-185) 和胎儿肺成纤维细胞 IRR-MRC-5 细胞 (ATCC 55-X) (American Type Culture Collection (ATCC) Manassas, VA) 在 37˚C 的 T25 烧瓶中保持在 5% CO 2培养箱中。A549 细胞系和 MRC-5 细胞系分别在 F12K 和 MEM 培养基（Gibco，ThermoFisher Scientific）中繁殖，这两种培养基都补充了 10% 胎牛血清和 1% 庆大霉素。

病毒传播

将细胞继代培养到 T25 烧瓶中并孵育 24 小时以达到 70% - 80% 的融合度。使用 100 μL 69 型肠道病毒 [美国典型培养物保藏中心 (ATCC® VR-1077 TM ) 马纳萨斯，弗吉尼亚州] 感染汇合细胞单层 1 小时，然后补充 5 mL 培养基。24 小时后检查 MRC-5 细胞，48-72 小时后检查 A549 细胞的细胞病变效应 (CPE)。当至少 90% 的细胞显示 CPE 时，通过去除培养基并以 1500 RPM 离心 5 分钟以消除细胞碎片，从而收获病毒。将含有病毒的上清液储存在-80°C的低温管中，用于以下实验。

EGCG-S 制备

来自粉末形式的绿茶提取物的 EGCG-硬脂酸酯 (EGCG-S)（美国专利 20120172423）获自 Camellix, LLC（乔治亚健康科学大学生命科学创新中心，乔治亚州八月）。将其溶解在 DMSO 中，最终储备浓度为 5 mM，并在 4°C 下储存。通过在 F12K 或 DMEM 中稀释以制备 25、50、75 和 100 μM 浓度，从该原液中制备处理浓度。

MTS细胞活力测定

CellTiter 96Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) 试剂盒 (Cat#G3580, Promega Corp., Madison, WI) 用于量化细胞活力。将 A549 和 MRC-5 细胞从 100% 汇合的烧瓶中接种到 96 孔板中，并在 37˚C 和 5% CO 2下孵育 24 小时，然后进行测定。然后用 100 μL 的 25、50、75 或 100 μM EGCG-S 处理 70% - 80% 汇合的细胞 1 小时。然后吸出未吸附的 EGCG-S，向细胞补充培养基并在 37˚C 和 5% CO 2下孵育 24 小时. 孵育后，每孔加入 20 μL MTS 试剂，培养板 1 小时。使用 Infinite Pro 200 酶标仪（Tecan Life Sciences）在 490 nm 处读取吸光度。通过首先使用 Microsoft Excel (Microsoft Office, New York, NY, USA) 根据以下公式根据未处理的细胞标准化吸光度值来确定每个样品的存活百分比。然后使用 Prism 9 软件 (GraphPad, San Diego, CA, USA) 计算三到五次重复的平均值和标准误差 (SEM)。

% 活力 = ((处理过的细胞 - 空白)/(仅细胞 - 空白)) × 100%。

MTS抗病毒细胞活力测定

将 MRC-5 或 A549 细胞接种在 96 孔板中，并在 37˚C 的加湿 CO 2气氛中孵育 24 小时，直至 80% - 90% 汇合。病毒在感染前用 25、50、75 和 100 μM EGCG-S 处理 1 小时。然后分别用 100 μL EGCG-S 处理和未处理的病毒感染细胞 1 小时，然后吸出未吸附的病毒并用培养基补充细胞。将板在加湿的 CO 2中在 37°C 下孵育 24 小时气氛，此时加入 20 μL MTS 试剂，与试剂孵育 1 小时后，使用 96 孔板读数器分光光度计在 490 nm 处读取吸光度。对于每个条件的每个重复吸光度值，使用下面的公式使用 Microsoft Excel 计算抑制百分比。然后使用 Prism 9 软件 (GraphPad, San Diego, CA, USA) 计算每个实验 3 到 5 次重复的平均值和平均值标准误差 (SEM)。

% 抑制 = [（用 EGCG-S 处理的病毒感染的细胞 - 未处理的感染细胞）/（未处理的未感染细胞 - 未处理的感染细胞）] × 100。

ToxGlo ATP 检测

将 MRC-5 细胞铺在 96 孔板中，并在 37˚C 的加湿 CO 2气氛中孵育 24 小时，直至 80% - 90% 汇合。对于感染测定，病毒在感染前用 25、50、75 和 100 μM EGCG-S 处理 1 小时。从孔中吸出培养基，然后用 100 μL EGCG-S 处理和未处理的病毒感染细胞 1 小时。感染后，吸出未吸附的病毒并用培养基补充细胞。Viral ToxGlo TM检测试剂盒 (Cat#G8941, Promega Corp., Madison, WI) 用于通过测量测试条件下的 ATP 水平来检测具有正常线粒体功能的活细胞。将板在加湿的 CO 2中在 37°C 下孵育 24 小时气氛，此时每孔加入10 μL ATP检测试剂，培养板1小时。然后使用 Biotek Synergy TM 2 光度计将相对发光单位 (RLU) 读取为 ATP 水平的相关性。

抗病毒 ROS-Glo H 2 O 2测定

ROS-Glo TM H 2 O 2测定试剂盒（Promega Corp.，Madison，WI）用于通过测量活性氧（ROS） H 2 O 2的水平来评估由病毒感染引起的氧化应激。将 MRC-5 细胞接种在 96 孔板中并使其达到 80% 融合，然后如之前的感染试验中所述，用 EGCG-S 处理或未处理的病毒感染 1 小时。根据制造商的说明，遵循产品 Cat#G8820 的裂解测定方案。然后将细胞在潮湿的 CO 2气氛中在 37˚C 下培养 7 小时以允许感染，之后加入 20 µL H 2 O 2将底物溶液添加到每个孔中，并将细胞再培养 5 小时，总共感染 12 小时。孵育后，向每个孔中加入 100 μL ROS-Glo TM检测溶液反应液，并将板孵育 20 分钟。在 RLU 中测量 ROS 水平并使用 Biotek Synergy TM 2 光度计读取。

用 EGCG-S 处理的病毒测定细胞中的细胞病变效应

将 MRC-5 和 A549 细胞接种在 6 孔板中并孵育 24 小时，直至 70% - 80% 融合。病毒在感染前用 25、50、75 或 100 μM EGCG-S 处理 1 小时。从每个孔中的贴壁细胞中吸出培养基，然后分别用 100 μL EGCG-S 处理和未处理的病毒感染细胞，持续 1 小时，然后吸出未吸附的病毒并用培养基补充细胞。将板在 37°C 在 5% CO 2下孵育。使用倒置显微镜在 400 倍下检查细胞的 CPE，并在感染后 48 和 72 小时 (hpi) 拍摄图像。

统计分析

使用 Prism 9 Software (GraphPad, San Diego, CA, USA) 进行绘图和统计分析。除非另有说明，否则使用带有 Dunnett 事后检验的单向 Anova 分析数据。

3. 结果

3.1。EGCG-S处理A549和MRC-5细胞的细胞毒性研究

肠道病毒能够感染包括呼吸道细胞在内的多种细胞，并且可以在呼吸道分泌物中找到 [ 34 ] [ 35 ]。为了了解 EGCG-S 治疗对呼吸道细胞中 EV-69 感染的潜在影响，我们使用了以前被证明对肠道病毒感染高度敏感的 A549 肺上皮细胞和 MRC-5 肺成纤维细胞 [ 36]。在 25 - 100 μM 的浓度范围内测定了对 EGCG-S 的细胞毒性。由于 EGCG-S 溶解在 DMSO 中，因此评估了 DMSO 单独对细胞的影响。显微镜分析表明，即使在浓度大于 0.5%（研究中使用的 DMSO 的最高最终浓度）处理时，细胞也不受 DMSO 载体对照的影响。这与之前报道的一项研究[ 37]。使用 MTS 测定法测定用 25 - 100 µM EGCG-S 处理的 A549 细胞和 MRC-5 细胞的细胞活力，该测定法使用不溶性甲臜产物作为指标，通过检测细胞呼吸来量化活细胞。该甲臜产物衍生自 MTS 底物（3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt），其转化通过活细胞中存在的线粒体脱氢酶。对于 A549 细胞，EGCG-S 处理高达 75 µM（图 1 (a)）时未发生细胞毒性，并且在使用的每种浓度（25、50、75 和 100 µM）下，MRC-5 细胞均未观察到细胞毒性（图1(b))。相对于未处理的 MRC-5 细胞对照，用这些浓度处理甚至导致细胞活力略高，这可能是由于 EGCG-S 对常规细胞的抗氧化或保护作用

图 1。EGCG-S 对高达 75 µM 的 A549 和 MRC-5 细胞无毒。A549 细胞 (n = 5) 和 MRC-5 细胞 (n = 3) 在 96 孔板中培养，24 小时后用 25、50、75 或 100 µM EGCG-S 处理 1 小时。使用 CellTiter 96Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) (Promega) 测定 % 存活率。A549 (a) 和 MRC-5 细胞 (b) 在 EGCG-S 处理下相对于未处理对照分别在高达 75 µM 或 100 µM 时保持活力。数据表示为平均值 ± SEM，**p < 0.01，ns = 不显着。

损害途径。EGCG-S对细胞的细胞毒性是剂量依赖性的。EGCG-S 安全地应用于培养的 A549 细胞 [ 33 ] 和培养的 Vero 细胞（未发表的数据），浓度高达 75 μM。结果表明EGCG-S对A549和MRC-5细胞无细胞毒性。

3.2. 用 EV-69 和 EGCG-S 处理的 EV-69 感染的 A549 和 MRC-5 细胞的增殖测定

通过测量代谢活性细胞的活力以及作为正常线粒体功能指标的 ATP 水平，进一步研究了 EGCG-S 防止 EV-69 介导的细胞毒性的能力。如方法部分所述，基于这些活力确定感染抑制百分比。观察到与未经处理的 EV-69 相比，经处理的 EV-69 的细胞活力增加（图 2 (a)）。在对 A549 细胞进行 75 µM 处理后，观察到的最高感染抑制率为 47%（图 2 (b)）。在与 A549 细胞测试的相同 EGCG-S 浓度下，MRC-5 细胞的感染抑制百分比总体较低，在 50 µM 处理后最多为 24.5%（图 2(b))。总而言之，这表明 EGCG-S 治疗在抑制 EV-69 感染方面具有一定的功效，但突出了 EGCG-S体外功效的差异，这在感染 EV-69 的呼吸道不同细胞之间可以预期。与未经处理的病毒感染细胞相比，用 EGCG-S 处理的 EV-69 感染导致 A549 和 MRC-5 细胞的细胞活力增加。由于 A549 细胞不能支持生产性 EV-69 感染，因此进一步研究了 EGCG-S 介导的针对 EV-69 感染 MRC-5 细胞的细胞毒性作用的保护程度。

图 2. 在 EGCG-S 处理后，EV-69 介导的细胞死亡和线粒体功能障碍在 A549 细胞和 MRC-5 细胞中受到中度抑制。A549 细胞（5 个重复）和 MRC-5 细胞（3 个重复）用未经处理或用 25、50、75 或 100 µM EGCG-S 处理的病毒感染 1 小时，24 小时后使用 CellTiter 96Aqueous 对细胞活力进行量化一种溶液细胞增殖试验 (MTS) (Promega)。与 24 小时后未处理的感染细胞相比，A549 细胞和 MRC-5 细胞具有更高的活力 (a)。对于两种细胞系 (b)，基于这些活力计算的抑制百分比低于 50%。数据表示为平均值±SEM。使用具有 Dunnett 事后检验的单向 Anova 对活力测定进行统计分析，将结果与未处理的 EV-69 感染对照进行比较，*p < 0.5，**p < 0.01，***p < 0。

3.3. 病毒 ToxGlo ATP 检测分析

为了深入了解 EGCG-S 介导的对感染的抑制作用不显着的 MRC-5 细胞的代谢活性，我们还检测了 ATP 水平作为线粒体功能和细胞活力的指标。如通过 ToxGlo ATP 检测测定法测量的那样，单独用 EGCG-S 处理不会对这些细胞中的 ATP 产生产生负面影响（图 3 (a)）。用 EGCG-S 处理 MRC-5 不影响 ATP 的产生，因此用 EGCG-S 处理对细胞活力没有负面影响。未经处理的 MRC-5 细胞和用 EGCG-S 处理的细胞（浓度高达 100 µM）之间没有统计学差异

图 3。EGCG-S 处理增加了受感染的 MRC-5 细胞中 ATP 的产生。用 25、50、75 或 100 μM EGCG-S 处理的病毒感染 MRC-5 细胞 1 小时，并在 24 小时后使用 Viral ToxGlo™ 检测试剂盒（Promega Corp.，Madison，WI）检测 ATP 水平。用 EGCG-S 处理 MRC-5 不影响 ATP 的产生 (A)。相对于 MRC-5 细胞中未经处理的 EV-69，经处理或未经处理的 EV-69 感染的 MRC-5 细胞导致细胞内 ATP 适度增加 (B)。数据表示为一个实验（5 次重复）的平均值 ± SD，*p < 0.5，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001，ns = 不显着。

（图 3（a））。然而，在检查受感染的 MRC-5 细胞的 ATP 水平时，进一步观察到 EGCG-S 在抑制感染方面的有限功效。EGCG-S 处理增加了这些细胞的细胞内 ATP，但仍显着低于未感染的对照（图 3（b））。这表明 EV-69 感染仍然极大地损害了 MRC-5 细胞，而 EGCG-S 治疗仅适度保护 MRC-5 细胞免受线粒体功能障碍以及 EV-69 感染诱导的代谢活性丧失。

3.4. ROS 检测分析

迄今为止，EGCG-S 治疗已被证明可以减少线粒体功能障碍和 EV-69 感染引起的整体细胞毒性。已知这些影响会因氧化应激而发生在肠道病毒感染中 [ 38 ] [ 39 ] [ 40 ]。虽然 MRC-5 细胞对 EV-69 介导的感染高度敏感，但与未处理的对照相比，EGCG-S 处理适度增加了细胞活力（图 2 (a) 和图 2 (b)）。据报道，EGCG 可调节与抑制感染相关的细胞氧化还原 [ 26 ] [ 29 ] [ 30 ] [ 31]。因此，本研究调查了 EGCG-S 在抑制 EV-69 感染中的抗氧化潜力。为了评估观察到的 EGCG-S 的保护作用是否可能是由于其抗氧化潜力，进一步检查了主要活性氧 (ROS)、过氧化氢 (H 2 O 2 ) 的细胞内总水平。与未经处理的 EV-69 感染对照相比，EGCG-S 处理在 25-75 µM 处理后导致总 H 2 O 2水平显着降低（图 4）。反之，治疗 100

图 4。用 EGCG-S 处理的 EV-69 感染的 MRC-5 细胞中 ROS 的产生减少。用未经处理或 25、50、75 或 100 μM EGCG-S 处理的病毒感染 MRC-5 细胞 1 小时，12 小时后使用 ROS-Glo TM H 2 O 2测定试剂盒测定H 2 O 2水平（ Promega Corp.，麦迪逊，威斯康星州）。MRC-5 细胞具有较低的总体 H 2 O 2与未经处理的 EV-69 对照相比，用 25 - 75 μM EGCG-S 处理的 EV-69 感染时的水平。数据表示为来自两个独立实验的平均值±SEM，分别具有两个和四个重复。使用具有 Dunnett 事后检验的单向 Anova 进行统计分析，将结果与未处理的 EV-69 感染对照进行比较，**p < 0.01，***p < 0.001。

µM 导致的 H 2 O 2水平高于未感染细胞。这可能是 EGCG-S 介导的细胞毒性以及 EV-69 感染的结果，因为 EGCG 可能在培养物中产生浓度高于 50 µM 的H 2 O 2 [ 41 ] [ 42 ] [ 43 ]。这表明 EGCG-S 的保护作用可能是由于其抗氧化活性，浓度低于 100 µM。而 H 2 O 2的差异在该感染测定中观察到水平，需要研究 EGCG-S 对总细胞内 ROS 的影响，以进一步了解 EGCG-S 的抗病毒作用是否可能是由其清除自由基的能力介导的，自由基会导致由总细胞引起的细胞损伤ROS 统称。

3.5. EV-69感染的MRC-5细胞和EGCG-S处理的感染的MRC-5细胞的显微镜观察

感染 EV-69 会导致活力下降，其特征是超过 90% 的细胞表现出圆形细胞病变效应或由于感染后 48 小时 (hpi) 的显着细胞裂解而存在细胞碎片。这些细胞病变效应 (CPE) 在用未经处理的 EV-69 或 EV-69 感染的 MRC-5 细胞中进行了研究，这些细胞在感染细胞之前用 EGCG-S（25 至 100 µM）预处理了 1 小时。作为 EV-69 的 EGCG-S 处理的结果，MRC-5 细胞比未处理的 EV-69 感染对照观察到更多的细胞增殖，特别是在 50 和 75 µM 时（图 5）。然而，对于 MRC-5 细胞，细胞毒性在 100 µM 时变得明显，与未经处理的 EV-69 感染的细胞相比，圆形和碎片增加（图 5 ）证明了这一点。）。这些形态变化可能是病毒感染和 EGCG-S 毒性的结果。

图 5。EGCG-S 在 MRC-5 细胞中防止 EV-69 诱导的 CPE。用 25、50、75 或 100 µM EGCG-S 处理的 EV-69 感染 MRC-5 细胞，然后孵育 48 小时或 72 小时，然后通过显微镜检查细胞形态。与未经处理的 EV-69 感染的 MRC-5 相比，经 50 或 75 µM EGCG-S 预处理的 EV-69 感染的 MRC-5 细胞在感染后 48 和 72 小时 (hpi) 的 CPE 降低。

因此，显微镜观察表明EGCG-S降低了EV-69诱导的细胞病变效应。总之，这支持 EGCG-S 可以防止 EV-69 介导的细胞损伤，但浓度低于 100 μM。

4。讨论

EGCG-S 治疗在临床表现差异很大的病毒感染中的益处已被广泛研究。在这项研究中，我们评估了 EGCG-S 对 EV-69 的抗病毒作用，EV-69 是一种肠道病毒，在我们的研究中观察到会导致呼吸道上皮细胞和成纤维细胞产生生产性感染。与未经处理的病毒对照相比，用 EGCG-S 处理后，MRC-5 细胞降低了 EV-69 介导的细胞毒性，尽管对感染的抑制百分比很低。相比之下，其他研究报告 EGCG-S 介导的感染抑制对于 HSV-1 感染的 Vero 细胞和 A549 细胞要高得多 [ 23 ] [ 33]。在我们的研究中观察到的 EGCG-S 功效的这种差异可能归因于所处理病毒的结构差异，因为这种修饰形式的 EGCG 被假定比未修饰的 EGCG 更有效，因为它对病毒包膜和 EV-具有更好的亲和力。 69是一种无包膜病毒[ 23]。此外，EGCG-S 对 RNA 与 DNA 病毒感染的细胞的作用方式也可能不同。此外，我们观察到浓度低于 100 µM 的经 EGCG-S 处理的病毒感染的 MRC-5 细胞中过氧化氢水平降低，表明 EV-69 介导的氧化应激受到抑制。确定本研究中观察到的中度抗病毒活性的原因需要了解 EV-69 的发病机制以及 EGCG-S 抑制病毒感染的全部机制。

EGCG 的拟议抗病毒机制在研究中有所不同。研究人员证明，这可能是由于 EGCG 与唾液酸或含有硫酸肝素的宿主细胞受体竞争病毒附着所致。这一发现得到了对脊髓灰质炎病毒的抗病毒功效降低的支持。这种减少与脊髓灰质炎病毒不依赖于唾液酸或含有硫酸肝素的受体进入有关 [ 21 ]。然而，另一项研究将 EGCG 介导的 EV-71 复制抑制归因于 EV-71 诱导的氧化应激的减少 [ 26]。我们的研究表明，EGCG-S 处理可减少过氧化氢。EV-69 在感染前用 EGCG-S 处理，这将允许 EGCG-S 附着在病毒上。因此，EV-69 感染的抑制可能是通过调节细胞氧化还原和防止病毒附着于细胞而发生的。我们实验室的后续研究发现，EGCG-S 抑制了 HSV-2 在培养的 Vero 细胞中的附着和渗透（未发表的数据）。这些报告表明，EGCG-S 可能存在多种抑制感染的机制，这取决于引起细胞毒性的不同病毒特异性因素。

虽然 EGCG-S 已被配制成治疗 HSV-1 [ 23 ] [ 44 ] 的外用乳膏，但它在治疗其他病毒性疾病方面的临床应用仍处于初步阶段。柯萨奇 B3 和甲型流感病毒感染的小鼠模型支持口服EGCG在体内的生物利用度，因为对小鼠的治疗导致存活率提高，与病毒复制减少相关 [ 25 ] [ 45 ] [ 46 ] [ 47]。我们的研究表明，EGCG-S 减少了由 EV-69 感染引起的氧化损伤，并增加了受感染细胞的活力，从而可能减少病毒复制。虽然在先前的研究中显示 EGCG 可以减少病毒复制，但据报道对与病毒感染相关的炎症反应有不同的影响。对于甲型流感感染，抗病毒作用与减少肺部炎症有关，这与报告 EGCG 的整体抗炎作用的研究一致 [ 48 ] [ 49 ] [ 50 ]。另一方面，对于柯萨奇 B3 感染，发现 EGCG 治疗可大大抑制小鼠心脏组织中的病毒复制和相关的心肌炎，但不会降低促炎细胞因子水平 [ 25]。抑制促炎细胞因子反应可能有益于因细胞因子风暴导致严重症状的病毒性疾病，例如甲型流感病毒或新出现的 SARS-COV-2 [ 51]，但在其他病毒感染中抑制炎症可能导致疾病延长或持续感染，因为清除感染所需的免疫反应欠佳。因此，EGCG-S 在抑制感染中的作用将需要更仔细地检查未经处理和处理过的感染细胞中抗病毒免疫反应，包括 I 型干扰素 (IFN) 的产生。检查细胞因子环境以及抗原呈递细胞趋化性和 EGCG-S 处理的感染细胞的靶向性将有助于阐明 EGCG-S 处理是否有助于清除肠道病毒感染或由于干扰抗病毒反应而导致持续感染。

此外，由于肠道病毒感染可能导致严重的疾病进展为神经系统并发症，因此需要评估 EGCG-S 在感染早期和晚期作为抗病毒药物的能力。未来研究在感染后 24 或 48 小时内应用 EGCG-S 有助于表征 EGCG-S 在不同阶段抑制 EV-69 感染的功效，并进一步区分 EGCG-S 在病毒附着中的作用。到目前为止，我们的数据表明，在感染早期应用 EGCG-S 可以降低 EV-69 介导的细胞毒性，值得进一步研究单独或组合策略最大化疗效。如果适用于体内肠道病毒感染, EGCG-S 有助于预防肠道病毒爆发地区的疾病进展和传播。

致谢

我们要感谢蒙特克莱尔州立大学生物系的 A. DiLorenzo 博士为我们提供了 MRC-5 细胞和用于 H 2 O 2测量的 ROS-Glo 检测试剂盒。我们还要感谢蒙特克莱尔州立大学化学与生物化学系的 J. Siekierka 博士，感谢他为我们提供了进行基于发光的实验的设施。这项研究部分由蒙特克莱尔州立大学的教师奖学金计划资助。

作者的贡献

HM、LHL 和 SDA 设计了这项研究。SDA 在实验室监督 HM。HM 和 SDA 进行了实验。HM 进行了所有的统计分析。HM、LHL 和 SDA 起草了手稿。所有作者阅读并认可的终稿。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

参考

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