瘤胃环境中的功能性宏基因组学综述

摘要：瘤胃微生物组在反刍动物生理、营养和病理学以及宿主免疫中起着至关重要的作用。更好地了解瘤胃微生物过程并确定哪些群体负责瘤胃微生物组内的特定功能将导致更好地管理和可持续利用可用的饲料基础，同时保持对环境的低影响。微生物学独立培养方法（如宏基因组学）的最新进展揭示了瘤胃微生物过程的潜在意义。钍有两种基本类型的宏基因组学研究：基于序列的宏基因组学和基于功能的宏基因组学。基于序列的宏基因组学涉及对环境样本中的 DNA 进行测序和分析。其目的是组装基因组，识别基因，找到完整的代谢途径，比较不同群落的生物。而功能宏基因组学是研究微生物群落的集体基因组，通过在通常是大肠杆菌（E.coli）的外 源宿主中表达它。 这是一种很有前途的方法，即使从尚未培养的瘤胃微生物群中也能挖掘出新的酶。筛选技术的进一步发展为瘤胃微生物学家和动物营养学家带来了巨大的机会。通过功能宏基因组学鉴定新型酶包括三个部分：瘤胃样本采集；DNA文库的构建和个体克隆的筛选。功能宏基因组学成功应用于鉴定不同抗生素、水解酶、抗生素抗性基因等多种功能；此外，它允许对编码具有特定活性的酶的基因进行表征，这代表了全新的序列。经过功能筛选的瘤胃产品有许多输出，例如可以分解植物细胞壁的碳水化合物活性酶 (CAZymes)。涉及宏基因组学研究商业化的公司，如先正达、Genencor International、BRAIN 等，已生产出许多具有商业价值的生物分子。本文的目的是阐明功能宏基因组学，来自瘤胃环境及其商业用途的潜力。

关键词

. DNA 分离, DNA 文库 构建,功能 筛选

一、简介

与单胃不同，反刍动物的前胃分为四个部分，即瘤胃、网状胃、胃胃和真胃或腺胃[ 1 ]。反刍动物前胃允许无数微生物 [ 2 ] 定殖，这些微生物统称为瘤胃微生物组 [ 3 ]。在这些群体中，细菌和原生动物在微生物生物量中占主导地位 [ 4 ]。瘤胃微生物组在反刍动物生理、营养和病理学以及宿主免疫中发挥着重要作用 [ 5]。瘤胃微生物能够调节养分吸收，可能是养分利用效率和解毒植物次生化合物的主要决定因素之一 [ 6 ] [ 7 ]。然而，它们也负责产生甲烷 [ 8 ]。日粮组成和干物质摄入量是改变瘤胃微生物组组成的原因 [ 9 ]。瘤胃是最未被充分利用的微生物生态系统之一，它产生一系列酶来消化和利用不同的植物成分 [ 4]，例如来自瘤胃微生物组协同关系的木质纤维素分解酶从纤维饲料中提取能量并支持宿主的消化。这会产生挥发性脂肪酸（VFA、乙酸盐、丁酸盐、丙酸盐）、甲酸、H 2、CO 2和 CH 4 [ 10 ]。

阻碍我们了解瘤胃微生物组结构和功能的主要障碍是只有大约 15% 的瘤胃细菌似乎是可培养的 [ 11 ]，这凸显了分子生物学方法绕过这一限制并研究瘤胃系统的重要性。总计 [ 12 ]。

通过基因组学和宏基因组学研究肠道微生物群落（微生物组）的最新进展正在彻底改变我们对生态系统功能及其成员与宿主动物之间相互作用的理解[ 8 ]。宏基因组学是环境生物学中一个快速发展和多样化的领域，旨在获得有关环境微生物基因组的知识，而无需事先培养，以及整个微生物群落。其他术语也用于描述这一点：环境基因组学、生态基因组学、社区基因组学和大基因组学 [ 13 ]。

两种方法通常用于探索瘤胃微生物组提供的丰富遗传资源：高通量筛选由瘤胃宏基因组 DNA 制成的克隆表达文库以寻找感兴趣的基因产物（功能宏基因组学）和基于测序的基因组和基因集合的表征存在于瘤胃微生物群落中，在 DNA（宏基因组学）和 RNA 水平（元转录组学）[ 5 ]。

广义上的“功能宏基因组学”一词旨在反映通过宏基因组学发现的微生物或群落的身份与其在环境中的各自功能之间的联系[ 13 ]。通过结合不同的方法，在功能水平（例如纤维素降解、氢代谢）而不是系统发育水平的研究是发现新蛋白质的更实用的方法 [ 8 ] [ 14 ]。这有助于更好地为微生物群落结构的差异分配功能、作用和意义。

功能筛选技术于 2005 年首次应用于瘤胃材料中挖掘新型酶 [ 15 ]。尽管积累了大量信息，但对瘤胃微生物组的功能和生态学及其从尚未培养的微生物的行为的了解仍然不完整。例如，植物多糖降解的完整机制，即典型的瘤胃功能，尚未阐明 [ 16 ]。因此，这份手稿旨在强调来自瘤胃环境的功能宏基因组学方法。

2. 参与各种瘤胃功能的微生物

瘤胃含有非常复杂的细菌、原生动物、古生菌、真菌和噬菌体聚生体，它们之间的相互作用导致更好的饲料降解[ 17 ]。根据 Woese 的分类，瘤胃生态系统中的所有微生物可分为三个领域：细菌（细菌）、古生菌（产甲烷菌）和真核菌（原生动物和真菌）[ 18 ]。表 1说明了瘤胃生态系统的物理、化学和微生物特征。

3. 方法论

3.1。瘤胃功能宏基因组学方法

瘤胃微生物组功能宏基因组学方案由三部分组成：环境（瘤胃液）样本采集；DNA 文库构建和分离或筛选单个克隆。DNA 文库由插入到称为质粒/fosmids 的环状DNA 载体中的随机DNA 片段（来自瘤胃宏基因组的基因）组成。然后将这些环状载体放入通常是大肠杆菌的微生物中，这样它们就可以在微生物的生命周期中复制。下一步是根据特定功能（例如抗生素抗性）分离或筛选单个克隆。

3.2. 瘤胃样本采集方法

瘤胃样品采集处理方法标准化

物理性质

干物质 (%)

10 - 18

渗透压

250 - 350 摩尔/公斤-1

酸碱度

5.5 - 6.9（平均 6.4）

氧化还原电位

-350 至 -400 mV

温度

38°C - 41°C

化学性质

氨基酸和寡肽

<1 mmol∙L-1在喂食后 2 - 3 小时出现

氨

2 - 12 毫摩尔∙L-1

膳食（纤维素、半纤维素、果胶）成分

始终存在

内源性（粘多糖）

始终存在

气相 (%)

一氧化碳265;CH427、N27；O20.6, H20.2

生长因子

货源充足；支链脂肪酸、长链脂肪酸、嘌呤、嘧啶、其他未知

木质素

始终存在

矿物质

高钠；总体供应良好

非挥发性酸 (mmol∙L-1)

乳酸 < 10

可溶性碳水化合物

<1 mmol∙L-1在喂食后 2 - 3 小时出现

微量元素/维生素

始终存在；B族维生素供应充足

挥发性脂肪酸 (mmol∙L-1)

醋酸盐 60 - 90，丙酸盐 15 - 30，丁酸盐 10 - 25，支链及更高 2 - 5

微生物特性

厌氧真菌

103-5g-1(6属)

细菌

1010-11g-1(>200 种)

噬菌体

107-9g-1颗粒 ml-1

纤毛虫原生动物

104-6g-1(25属)

表 1。瘤胃生态系统的物理、化学和微生物特征。

资料来源：[ 19 ]。

对于降低可能影响数据分析和解释的错误水平至关重要 [ 20 ]。表 2说明了不同的瘤胃取样和处理技术。

3.3. 瘤胃微生物组 DNA 提取方法

采样和 DNA 提取方法可以产生足够的微生物 DNA，准确地代表微生物群落是至关重要的 [ 22 ]。环境样本 DNA 片段大小在小于 10 kb 到大于 400 kb 的范围内变化，具体取决于样本和用于 DNA 提取的机械、化学或酶促协议 [ 23 ]。不同作者使用不同的瘤胃微生物组 DNA 提取方法评估了瘤胃微生物的系统发育。表 3说明了不同的 DNA 提取评估方法及其输出。

参考。

评价方法

寄主动物

输出

[21]

取样技术

（插管与胃管）和

地点

（背囊与腹囊）

关于瘤胃微生物组和发酵参数

韩宇掌舵。

瘤胃微生物组和发酵参数不受不同采样技术和采样地点的影响。

胃管可能是一种可行的替代方法来收集有代表性的瘤胃样本。

[20]

加工方法

立即冷冻的瘤胃液或作为关键微生物群的细胞颗粒储存的样品

瘘管婆罗门掌舵

无论使用何种加工方法，两者都确定了关键微生物群。

然而，立即冷冻样本可能会改变物种的丰度

表 2。瘤胃取样和处理技术。

参考。

评价方法

寄主动物

输出

[24]

细胞内 (iDNA) 和细胞外 DNA (eDNA) 的细菌谱比较

瘤胃液处理（纱布挤压，离心过滤），

储存温度 (RT, -80˚C) 和

冷冻保护剂（PBS-甘油、乙醇）

牛瘤胃

发现使用与 PBS-甘油混合并储存在 -80˚C 的粗棉布过筛的瘤胃内容物使用珠打法提取细胞内 DNA 是研究瘤胃细菌谱的最佳方法。

[22]

十五种不同的 DNA 提取方法

牛羊瘤胃

提取方法之间的微生物群落存在显着差异，例如某些细菌的相对丰度，例如拟杆菌门和厚壁菌门

涉及苯酚-氯仿提取和机械裂解步骤的 DNA 提取方法往往更具可比性。

[25]

DNA提取例如：

重复珠击（RBB），

苯酚依赖性珠击（PBB），

土壤快速旋转 DNA 试剂盒 (FDSS)，以及

PQIAmini。

从纤维瘤胃和液态瘤胃部分观察到的微生物群落

奶牛。

所有四种提取程序都产生了适用于使用定量 PCR 和相关分类标记的焦磷酸测序进一步分析细菌、古细菌和厌氧真菌群落的 DNA。

[26]

十种改进的 DNA 提取方法

牦牛

推荐使用通过珠击物理裂解的十六烷基三甲基溴化铵-溶菌酶用于瘤胃微生物群落的 DNA 分离。它还表明，珠击步骤对于有效分解所有微生物的细胞壁是必要的，尤其是革兰氏阳性细菌。

表 3。DNA提取评价方法及其输出。

4. 构建功能宏基因组库

用于不同酶发现的宏基因组学包括从瘤胃样本创建宏基因组库并筛选特定酶的库克隆 [ 27 ]。早期对瘤胃微生物的研究依赖于通过功能筛选从基因组 DNA 文库中检索基因，或者最近通过基因及其同源物的 PCR 扩增 [ 28 ]。在程序上，克隆文库构建涉及从感兴趣的混合微生物群落（例如瘤胃样本）中获取 DNA 或 RNA 提取物。然后使用 PCR 或 RT-PCR 扩增核糖体 RNA 基因。扩增子被纯化并插入载体，如含有抗生素抗性基因的质粒 [ 29 ]。然后筛选表达库与特定底物的目标反应[30 ] [ 31 ]。表达载体中的克隆随后进行基于活性的筛选，在未培养的微生物世界中释放隐藏的潜力具有无限的可能性[ 32 ]。

根据主要目标，宏基因组学有两种不同的策略。首先，构建大型插入文库（粘粒、fosmid 或细菌人工染色体 (pBAC)）用于存档和序列同源性筛选目的：捕获样本中可用的最大数量的可用遗传资源并将其存档以供进一步研究/询问. 其次，构建小型插入表达文库，尤其是在 λ 噬菌体载体中制作的那些，用于活性筛选 [ 14 ]。

在构建大插入文库（例如，fosmid、粘粒）和小插入表达文库（例如，λ 噬菌体和质粒载体中的文库）[ 14 ] 时，使用变性梯度凝胶电泳的 DNA 提取程序和大小分选是关键步骤。载体的选择很大程度上取决于插入片段的长度。质粒适用于克隆小于 10 kb 的 DNA 片段，粘粒 (25 - 35 kb)、fosmids (25 - 40 kb) 或 BAC (100 - 200 kb) 可用于克隆较大的片段 [ 33 ]。在这些载体中，质粒具有高拷贝数和强载体携带的启动子。然而，这些明显的优点并没有显着提高命中率 [ 33]。基于粘粒或 fosmid 的文库通常是首选，因为它们具有大且一致的插入大小和高克隆效率 [ 27 ]。

对于图书馆的建设，大多数研究人员使用大肠杆菌 作为替代宿主 [ 33 ]。在大多数此类情况下，克隆 DNA 的宿主一直是分子遗传学家的主力 [ 34 ]。各种类型的大肠杆菌 菌株可作为来自商业来源的高效感受态细胞。

然而，由于大肠杆菌的转录-翻译机制与从环境微生物中采集的基因的表达不兼容，大多数基于功能的宏基因组筛选方法都受到大肠杆菌 中表达偏倚和不足的阻碍。这可能导致从一轮宏基因组文库筛选中获得的阳性克隆比例非常低（在某些情况下低于 0.01%）[ 35 ]。迫切需要开发更大范围的替代宿主，这些宿主可以很好地表达宏基因组起源的外源基因 [ 36 ]。此外，文库构建中的技术挑战，例如提取的 DNA 数量和长度不足 Parks 和 Graham [ 37 ]、靶基因的低效转录以及相应酶的不当组装[ 38 ]和DNA剪切[ 39 ]。

使用微生物开发新的宿主系统，即链霉菌 属。、嗜 热栖热菌、硫化 叶菌 和 变形杆菌[ 40 ] [ 41 ] [ 42 ] [ 43 ]，拓宽了宿主和兼容酶测定系统的选择范围。大肠杆菌 由于其易于转化并且是具有最佳遗传特征的细菌，已成为宏基因组研究中异源基因表达的选择宿主 [ 32 ]。

5. 筛选策略以获得宏基因组衍生的生物催化剂

功能筛选已成为发现用于生物技术和医学应用的新型生物分子的一个越来越重要的领域 [ 5 ]。宏基因组文库的大多数活性筛选都是基于在指示板上培养宏基因组克隆，从而通过指示底物的生物催化转化分析确定的酶活性，从而导致在“阳性”菌落周围形成透明或有色光环 [ 44]。几个参数对于成功筛选宏基因组文库很重要，例如文库中基因的丰度、平均插入片段大小、宿主-载体系统、使用能够表达目标基因的适当宿主生物、检测方法，异源基因在替代宿主中的表达效率和筛选方法的通量相对较低 [ 5 ] [ 33 ] [ 45 ]。表 4说明了用于获得宏基因组衍生的生物催化剂的功能筛选策略的最新示例。

随着 HTS（高通量筛选）方法的同步进步和选择具有广泛可用宿主以进行异源基因表达的转化系统的选择，现在可以每秒筛选多达 50,000 个克隆或每天筛选超过 10 亿个克隆 [ 46 ]。功能筛选技术于 2005 年首次应用于瘤胃材料中挖掘新型酶 [ 15 ]。

筛选方法

目标基因

检测方法

诱导剂

资源

主机、矢量

琼脂平板筛选

b-糖苷酶

表型检测

AZCL-木聚糖、木葡聚糖

牛粪

大肠杆菌,噬菌体_

琼脂平板筛选

抗有毒元素的基因

表型检测

几种抗生素

奶牛粪

大肠杆菌___

琼脂平板筛选

抗有毒元素的基因

表型检测

几种抗生素

奶酪食品基质

大肠杆菌___

微量滴定板筛选

纤维素酶

吸光度测量

二硝基酚纤维二糖苷

土壤、水牛瘤胃等

大肠杆菌___

GMD，流式细胞仪

筛查抗生素

荧光

金黄色葡萄球菌

从 ARSculture 保藏中心获得的 3 株葡萄球菌

大肠杆菌,酿酒酵母,质粒

微流体（油滴中的水），FACS

水解酶

荧光

硫酸单酯

磷酸三酯

多种来源（土壤、退化的植物材料、牛瘤胃）

大肠杆菌,质粒_

表 4。用于获得宏基因组衍生的生物催化剂的功能筛选策略的最新示例。

注：AZCL，天青交联；GMD，凝胶微滴；FACS，荧光激活细胞分选；ARS，农业研究服务。GMD：微流体凝胶微滴。资料来源：[ 36 ]。

5.1。琼脂平板筛选方法

它是最古老的筛选方法，许多人将其用作最先进的水解酶筛选方法。这种功能性宏基因组学筛选方法提供了一种简单直接的方法来识别在不同条件下起作用的新型酶。新的水解酶，如脂肪酶、酯酶、纤维素酶、蛋白酶、漆酶、糖基化酶、腈水解酶和脱卤素酶，已使用该方法鉴定 [ 47 ]。琼脂平板筛选方法有助于查明对抗生素、极端盐浓度、极端 pH 值和重金属等有毒元素具有抗性的基因 [ 37]。并且该测定基于在与显色或荧光底物一起孵育的菌落中产生发色团或荧光团，每天的通量为 10 3 - 10 6 个克隆 [ 48 ] [ 49 ]。该方法已成功地从各种环境中分离出大量独特的酶 [ 37 ]。

5.2. 基于微阵列的筛选

基于 DNA 微阵列的方法背后的想法是，筛选宏基因组库中是否存在选定基因。它有效地发现了基因组目标区域 [ 50 ]。与琼脂板不同，DNA 微阵列是基于序列的宏基因组库筛选方法 [ 51 ]。该协议包括基于已测序、注释基因组中的同源性搜索来识别生物光感受器。新的 DNA 序列与已鉴定的功能性蛋白质编码基因的相似性是微阵列方法的基础 [ 52 ]。使用微阵列分析文库提供了一种快速表征许多克隆的有效方法 [ 51 ]。这种格式被称为宏基因组微阵列 (MGA) [ 14]。然而，这种方法的困难和限制与实现高杂交效率有关，并且来自已知蛋白质家族的保守区域的靶基因降低了我们获得基本新蛋白质的机会[ 35 ]。

5.3. 微量滴定板筛选

微量滴定板方法包括在微孔中孵育细菌培养物与酶底物 [ 32 ]。使用微量滴定板检测是一种传统且直接的高通量蛋白质文库筛选方法 [ 53 ]。该方法以最少的时间、金钱和工作量成本提供高通量[ 54 ]。感兴趣的蛋白质特性可以在微量滴定板中直接或间接测量，最常见的是通过分光光度法或荧光法 [ 53 ]。随着底物转化的发生，微量滴定板中会出现视觉信号，例如颜色或荧光，用于识别表达具有所需特性的酶的菌落 [ 36 ]。

5.4. 荧光激活细胞分选 (FACS) 碱基筛选

荧光激活细胞分选 (FACS) 是一种新兴技术，由于其高灵敏度和每天分析多达 10 8个突变体的能力而成为筛选酶库的强大工具 [ 55 ]。FACS 可以根据细胞大小、形状和荧光来识别单个细胞内的生物活性 [ 56 ]。FACS 有很多优点： 1) 将单个事件快速准确地存入各种容器中；2) FACS 的层流流体可防止细胞在分选过程中被破坏，并且 3) 由于每个液滴的体积很小，因此污染受到限制 [ 57]。由于其强大的细胞分选能力，例如液滴分选和基于报告基因的筛选 [ 36 ]，FACS 可以轻松地与多种不同的高通量筛选方法相结合。最近，该系统结合了具有多波长能力的激光器，每秒可筛选多达 50,000 个克隆，或每天超过 10 亿个克隆 [ 58 ]。

5.5. 基于微流体的筛选

微流控基础筛选平台配备了高通量筛选技术，由于其适用于基于细胞的分析、低分析成本和易于处理皮升体积的液体 [ 59 ]，因此比其他方法具有优势。该方法允许高通量筛选，同时快速分析数千种化学、生化、遗传或药理学测试 [ 60 ]。微滴以每秒数千滴的速度大量产生，单个滴用作反应室。细胞、酶变体、底物和产物被限制在皮升体积的液滴中，在那里发生反应 [ 61]。随后，根据产品的荧光或颜色对液滴进行分类。微流体与 FACS 的耦合导致宏基因组文库的超高通量筛选。然而，这种技术的主要瓶颈是检测方法，主要局限于荧光信号。未来，质谱、核磁共振（NMR）和比色测定等其他检测方法可能与微流控装置相结合，加速发现新型生物催化剂或其他在微生物群中具有重要功能的基因[ 36 ]。

6. 功能筛选瘤胃​​产品

瘤胃相关功能筛选微生物组产品和高活性酶在商业应用中的应用将为农业工业提供一个新的维度，并减少甲烷释放到大气中 [ 28 ] [ 62 ]。瘤胃微生物产生一系列称为碳水化合物活性酶 (CAZymes) 的酶，可以分解植物细胞壁。基于蛋白质序列、基因序列和结构相似性区分的CAZymes有四种类型：糖苷水解酶（GHs）、糖基转移酶（GTs）、多糖裂解酶（PLs）和碳水化合物酯酶（CEs）；这些 CAZymes 共同促进膳食纤维素、半纤维素和果胶解构 [ 63 ] [ 64]。使用功能宏基因组学方法获得了一些 CAZy 家族，例如来自奶牛的 GH3（β-葡萄糖苷酶）、CE6（酯酶）和来自 Buffalo 的 GH（纤维糊精酶）[ 65 ][ 66 ][ 67 ]。一些描述 CAZymes 的作者包括 Hess等人。, [ 68 ], 鉴定了 27,755 个推定的牛瘤胃碳水化合物活性基因并表达了 90 个候选蛋白质，其中 (51) 57% 对纤维素底物具有酶活性。程等人。, [ 69 ] 从牛瘤胃宏基因组学中功能筛选出耐高温和耐 pH 工业相关的新型酯酶和木聚糖酶。赵等人。, [ 70]，从乳制品瘤胃微生物群中筛选出底物特异性和热稳定性好的三种脂肪酶。教皇等人。, [ 71 ] 还通过能够降解木质素的宏基因组方法从驯鹿瘤胃中鉴定出漆酶。威奇曼等人。, [ 72 ], 从牛粪中鉴定出 80 种独特的抗生素酶以及氯霉素乙酰转移酶的新进化枝。蒂拉布尼亚农等人。, [ 73 ], 发现了一种新的枯草芽孢杆菌益生菌菌株，对肠炎沙门氏菌感染具有抑制活性。表 5给出了一些鉴定的酶以及来自各种报告的筛选方法。

功能宏基因组学的进步为工业带来了前所未有的机会，将宏基因组来源的生物分子带入商业成功。有许多公司参与了宏基因组研究的商业化，例如 Diversa Corp、BASF、DSM、Syngenta、Genencor International 和 BRAIN AG，已经将许多具有商业价值的生物分子商业化了表 6 [ 74 ]。

资源

酶/酶家族

测序方法

筛选方法

奶牛

环糊精酶

-

基于函数

霰弹枪测序

测序和功能筛选

内切葡聚糖酶

焦磷酸测序 454 GS FLX

基于函数

α-葡萄糖醛酸酶

-

基于函数

糖苷水解酶

桑格测序

基于函数

碳水化合物活性酶

焦磷酸测序

基于函数

甘露聚糖酶-木聚糖酶葡聚糖酶

桑格测序

基于函数

脂肪酶

基于函数和序列

牛

内切葡聚糖酶

桑格测序

基于函数（BAC 向量）

内切葡聚糖酶

-

基于函数（fosmid 向量）

糖苷水解酶

-

基于函数

糖苷水解酶

焦磷酸测序 454 GS FLX

基于序列

沼泽水牛

内切葡聚糖酶

-

基于函数

碳水化合物活性酶

离子激流 PGM 二代测序

基于序列

牦牛

糖苷水解酶

-

基于函数

羊

木聚糖酶

-

基于函数（fosmid 向量）

山羊

内切葡聚糖酶

霰弹枪排序

基于序列

-

阿魏酸酯酶

-

基于函数

表 5。瘤胃酶的宏基因组研究。

资料来源：[4]。

公司

目标产品

课程

产品与市场

商业利益

巴斯夫 http://www.corporate.basf.com/

酶

淀粉酶水合酶

嗜酸葡糖淀粉酶

食品工业，帮助消化淀粉

Bioresearch Italia, SpA（意大利）

抗感染药

万古霉素

达巴万星

开发人类基因靶向疗法和新型抗感染药物

脑

http://www.brain-biotech.de/

生物活性

肽和酶

药品

和农用化学品

ND

腈水合酶

纤维素酶

Degussa AG 工业过程合作伙伴

立体派药物

https://www.merck.com/

抗感染药

ND

ND

各种商业关系。

I、II、III期试验的多种产品

多样化

http://www.diversa.com/

酶

腈水解酶

糖苷酶

植酸酶

发现 100 种新型腈水解酶 生产立普妥 Pyrolasee 160 和 Pyrolasee 200；Phyzymee XP

药物，降低胆固醇水平

广谱β-甘露聚糖酶和β-葡聚糖酶添加到动物饲料中，以分解谷物和油籽中难消化的植酸盐，释放出可消化的

生物代谢物

荧光蛋白

Discovery Pointe Green-F P* 和 Cyan-FP*

潜在用于药物发现、商业筛选和学术研究的新型绿色和青色荧光蛋白

Diversa 和 Invitrogen

https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html

酶

DNA聚合酶

用于研究和诊断的 Hermal Acee 和 Replicasee DNA

研究和诊断

EMetagen

酶；

抗生素；活性小分子

聚酮化合物

eMetagen 基因和通路库 eLarge 克隆 DNA 文库

编码 5000 到 20,000 种次级代谢物的生物合成途径

食品、农业、研究和其他商业应用药物：抗菌、抗癌和其他生物活性特性

兴产科技

http://www.kosan.com/

抗生素

聚酮化合物

阿霉素、红霉素、Meva-cor、雷帕霉素、他克莫司（FK506）、四环素、雷帕霉素、

治疗药物

杰能科

http://www.genencor.com/

酶

脂肪酶、蛋白酶

洗衣粉和耐碱性蛋白酶。

清洁行业

图书馆

http://www.libragen.com/

抗生素和

生物催化

药品

ND

抗感染和抗生素发现 药物的生物催化发现（与 Synkem 合作）

药物;药物合成

原卡利亚

http://www.prokaria.is/

酶

鼠李糖苷酶

b-1,6 葡萄糖酶；

单链 DNA 连接酶

食品和农业产业

食品工业

表 6。宏基因组技术的商业化。

ND 没有可用的详细信息或产品仍在开发中。资料来源：[ 74 ]。

目前，在瘤胃宏基因组领域开展工作的主要实验室包括美国 DOE Joint Genome Institute-Genome Technology；美国农业部；法国INRA；澳大利亚CSIRO；和 AgResearch，新西兰和印度农业大学 [ 4 ]。

7. 结论

功能宏基因组筛选技术是未来研究领域的有力工具，具有挖掘环境和商业上重要的生物催化剂的潜力。瘤胃样本采集、DNA 文库构建和克隆筛选是瘤胃功能宏基因组学工作的标准程序。筛选技术范围从琼脂板等旧技术到质谱、核磁共振 (NMR) 和比色测定等高通量先进技术。四种瘤胃环境来源酶（CAZymes）对农业和制药公司有重大贡献。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

参考

[ 1 ] Agarwal, N.、Kamara, DN 和 Chaudhary, LC (2015) 驯化反刍动物的瘤胃微生物生态系统。在：Puniya, A.、Singh, R. 和 Kamra, D., Eds.，瘤胃微生物学：从进化到革命，Springer，新德里，17-30。

[ 2 ] Stevens, CE 和 Hume, ID (1998) 脊椎动物胃肠道中微生物对营养素生产和保存的贡献。生理学评论，78，393-427。

[ 3 ] Hobson, PN 和 Stewart, CS (1997) 瘤胃微生物生态系统。第 1 版，施普林格，多德雷赫特。

[ 4 ] Goel, G.、Dagar, SS、Raghav, M. 和 Bansal, S. (2015) 瘤胃：工业上重要酶的未充分利用的利基。在：Puniya, A.、Singh, R. 和 Kamra, D., Eds.，瘤胃微生物学：从进化到革命，Springer，新德里，247-263。

[ 5 ] Li, RW (2015) 瘤胃宏基因组学。在：Puniya, A.、Singh, R. 和 Kamra, D., Eds.，瘤胃微生物学：从进化到革命，Springer，新德里，223-245。

[ 6 ] John Wallace, R. (2008) 肠道微生物学——广泛的遗传多样性和特定的代谢生态位。动物，2, 661-668。

[ 7 ] Jami, E., White, BA 和 Mizrahi, I. (2014) 牛瘤胃微生物组在调节牛奶成分和饲料效率中的潜在作用。公共科学图书馆一号，9，e85423。

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