从巴西米纳斯吉拉斯的一些植物和土壤样品中分离的丝状真菌的脂解潜力分析

摘要：微生物具有产生多种代谢物的能力，这些代谢物广泛用于生物技术过程，包括称为酶的生物催化剂。在这些酶中，脂肪酶受到青睐，因为它们进行各种催化反应，例如水解、酯化、酯交换和酯交换。这项工作旨在从巴西米纳斯吉拉斯州迪亚曼蒂纳收集的样品中分离丝状真菌，分析其宏观形态特征，确定温度对其生长的影响，并验证哪些生物体是潜在的脂肪酶生产者。从四个采集点，从 jabuticaba ( Plinia cauliflora ) 树的叶子和土壤中分离出 9 种真菌，从 Andu豆叶 ( Cajanus cajan) 中分离出 3 种真菌。）。分析了微生物的宏观形态特征。对于嗜热分析，从实验室库中获得的 12 种分离真菌和 8 种在固体马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基中培养，温度为 30 °C 至 50°C，间隔为 5°C。计算显影 48 小时后每小时的生长速率。为了筛选产丝状脂肪酶的真菌，将 20 种真菌培养在固体 BDA 培养基中，温度为 30 ℃保温96小时，计算酶指数。结果表明，20 种微生物中，95% 的微生物在 30 ℃下发育，生长速率最高的是真菌 3.2TA、PJ8 和 PJ7。35℃时，70%的真菌发育，生长速度最快的是真菌3.2TA、MB2.2和P3。40℃时，40%的真菌发育，生长速度最快的是真菌3.2TA、PJ6和PJ8。在 45°C 时，只有 PJ6 和 PJ12 真菌生长，而在 50°C 时没有生物体生长。在脂肪酶生产的筛选中，观察到最大的生长晕圈是来自银行的 3.2TA 真菌。

关键词

酶,生物 勘探,生物 技术

一、简介

在过去的几十年中，人们在寻找化石燃料的替代品方面付出了巨大的努力，因为它是一种有限的燃料，并且由于这些燃料造成的污染[ 1 ]。在生物燃料的可能性中，我们可以提到生物柴油，它由长链脂肪酸的甲酯组成 [ 2 ]。

各种微生物酶已应用于工业的许多领域；由于微生物脂肪酶可以催化水解、酯化、酯交换和酯交换反应 [ 3 ] - [ 8 ] ，因此微生物脂肪酶已被用于洗涤剂工业、生物燃料生产和工业废水生物修复/处理。

使用微生物生产脂肪酶是有利的，因为它们中的大多数能够以高速率和相对较低的成本生产这种生物催化剂。2018 年全球工业酶市场规模达到 55 亿美元，预计到 2023 年这一价值将达到 70 亿美元，2018-2023 年期间的复合年增长率（CAGR）为 4.9%[ 9 ]。

然而，为了获得具有更大催化能力的酶，并降低酶生产成本，需要研究使用从新环境中分离出来的微生物，以及使用培养基成分中的农工业残留物来获得具有适合特定应用的特性的脂肪酶。

生物柴油的生产通常通过使用碱性、酸性或酶催化剂将动物油或植物油与甲醇进行酯交换来实现。在使用碱性催化的酯交换反应中，使用碱金属氢氧化物如氢氧化钾和氢氧化钠，观察到更好的收率和选择性。也使用碱性非离子催化剂，因为它们具有不形成肥皂和其他不良产物的优点 [ 10 ] [ 11 ] [ 12 ]。

在使用强酸如硫酸或盐酸的酸催化中，反应迅速且转化度高。然而，它有几个缺点，如副反应的发生，设备的腐蚀和催化剂难以从液体反应混合物中分离[ 13 ]。

因为碱的催化活性优于酸，而酸催化剂的腐蚀性更强，所以碱催化优于酸催化，这就是它最常用于商业的原因。尽管该反应通常使用均相催化剂进行，但多相催化剂在经济和环境方面都比均相催化剂具有优势 [ 14 ] [ 15 ]。

在酶催化方面，脂肪酶（三酰基甘油水解酶 EC 3.1.1.3）因选择性更高、产率更高而脱颖而出；游离脂肪酸在低反应温度下转化为生物柴油。反应条件较温和，酶易于与反应产物分离，反应环境可持续，可获得更高质量的生物柴油和甘油，纯化阶段的程序成本较低，酶可用于均相或均相多相催化。缺点是酶成本高，并且酶通常在甲醇/水混合物存在下被抑制，这需要添加助溶剂，从而使该过程更加昂贵[ 16 ]。

这项工作旨在分析从米纳斯吉拉斯州迪亚曼蒂纳的植物和土壤样品中分离的丝状真菌的脂肪分解潜力，分析一些分离的丝状真菌的宏观形态特征，温度对这些微生物生长的影响，并验证哪些是脂肪酶的生产者。

二、材料与方法

这项工作是在巴西米纳斯吉拉斯州迪亚曼蒂纳的杰基蒂尼翁哈和穆库里山谷联邦大学 (UFVJM) JK 校区塞拉多生物质和技术实验室完成的。

2.1。研究中的微生物

分析了 20 种丝状真菌，其中 8 种微生物鉴定为 P3；C435; EA3.3.2 和 EA1.2.1；3.2TA；MB1.1和MB2.2和M1.7.1是从实验室已经存在的几种微生物中随机选择的，是从其他研究中分离出来的结果（表1）。从作者收集的样本中分离出 12 种丝状真菌 [ 17 ] - [ 22 ]。

从巴西米纳斯吉拉斯州迪亚曼蒂纳市无菌采集的样品中分离出十二种丝状真菌。收集的材料是猪油（样品 1）、jabuticaba（Plinia cauliflora）树脚下的叶子和土壤（样品 2）、安杜豆叶（Cajanus cajan）（样品 3）和咖啡渣（样品 4）。样品储存在用疏水棉密封的玻璃瓶中，预先在 120˚C 和 1.5 个大气压下高压灭菌 30 分钟。

将材料以无菌方式运送到实验室，将每个样品置于含有 15 至 20 mL 4% (w/v) 固体无菌 Quaker® 培养基和 2% (m/v) 细菌琼脂的培养皿中，在高压灭菌镊子的帮助下，样品中存在的微生物被允许发展 [ 23 ]。将含有该材料的板置于细菌学

丝状真菌

资源

收集城市

P3

椰子壳

塞拉诺波利斯米纳斯，MG

C435

分解中的牛仔布

UFVJM, Diamantina, MG 的垃圾场

EA3.3.2

种子

UFVJM, Diamantina, MG 的垃圾场

3.2TA

甘蔗渣

北部地区，MG

MB1.1 和 MB2.2

Rio Doce 的水

摄政区，ES

EA1.2.1

分解中的叶子

UFVJM, Diamantina, MG 的垃圾场

M1.7.1

树皮

贾瑙巴，MG

表 1。从实验室中分离出丝状真菌的位置和样本。

烤箱30度烤四天。每 24 小时分析一次新微生物的生长情况，随着标本的生长，在 30°C 下在含有相同培养基的新培养板中心进行点隔离。

从菌落的颜色、外观、形貌、边缘、表面、质地、大小和有无色素沉着等方面分析了十二种分离真菌和已经分离出的丝状真菌的宏观形态特征[ 24 ]。

2.2. 丝状真菌的保养

根据 Michelin (2009) 描述的方法，将菌株储存在 Dinâmica® 硅胶上，其中用 2 mL 奶粉（200 g∙L - 1高压灭菌蒸馏水）制备孢子悬浮液。将大约 1 mL 这种悬浮液加入到含有 7 g 硅胶的试管中并搅拌。这些试管被密封并储存在 4˚C [ 25 ]。丝状真菌在 15 cm × 5 cm 试管中培养，试管含有 4% (m/v) Quaker® 固体培养基和 2% Bacteriological Agar (w/v) [ 23 ]。培养基保存在 30°C 的细菌培养箱中，生长后保存在 4°C 的冰箱中。

2.3. 温度对丝状真菌生长的影响

使用 Prodimol® Potato-Dextrose-Agar (BDA) 培养基在 30°C 至 50°C 的温度范围内每隔一段时间在固体培养基中测定真菌的生长速率，持续 48 小时5℃。测量真菌生长半径，并计算以厘米/小时 (cm∙h - 1 ) 为单位的生长速率。

2.4. 丝状真菌产生脂肪酶的筛选

使用 Hankin & Anagnostakis (1975) 描述的方法选择产生丝状脂肪酶的真菌。将所有真菌准时加标在培养皿的中心，在先前灭菌的固体培养基中加入含有马铃薯-葡萄糖-琼脂 (BDA) (20 g∙L - 1 )、蛋白胨 (10 g∙L - 1 )、钠的脂肪酶氯化物 (5 g∙L - 1 )、氯化钙 (2 g∙L - 1 ) 和吐温 80 (10 mL∙L - 1 )，并在 30˚C 的细菌培养箱中培养 4 天。

测量菌落的生长半径 (cm)，并使用 2 mL 展开液（0.1 M NaOH 和 2% 酚酞）鉴定 Tween 80 水解释放的脂肪酸。通过测量酶晕 (cm)，通过将一个参数除以另一个参数来确定真菌生长与酶产生的比率。

2.5. 重现性和统计分析

所有实验一式三份进行，并确定结果的平均值和标准偏差。使用 Statistica TM 6.0 软件 (Statsoft, Inc) 对 ANOVA 和 Tukey 检验进行统计分析。分析测定之间的相关性在 5% 显着性水平上进行（p < 0.05）。

3。结果与讨论

3.1。丝状真菌的分离及微生物宏观形态特征分析

在 12 种丝状真菌中，命名为 PJ1、PJ2、PJ3、PJ4、PJ5、PJ6、PJ7、PJ8 和 PJ12 的真菌是从 jabuticaba (Plinia cauliflora) 树的叶子和土壤中分离出来的（样品 2），而 PF9、PF10和 PF11 从安杜豆叶 ( Cajanus cajan ) (样品 3)中分离得到，如图 1所示。从猪油和咖啡渣的样品中没有分离出丝状真菌。

图 1。分离的丝状真菌的代表性图像。(a) 从 jabuticaba (Plinia cauliflora) 树的叶子和土壤中分离的真菌和 (b) 从 Andu 豆 ( Cajanus cajan ) 的叶子中分离的真菌。

分离微生物后，测定分离物的宏观形态特征。颜色方面，67% 呈现白色（PJ1、PJ2、PJ3、PJ4、PJ5、PF9、PF10 和 PF11）；其他真菌具有棕色（PJ6）、棕色和白色（PJ7）、棕色和绿色（PJ8）和黑色（PJ12）颜色（表2）。

所有分离的真菌都具有干燥的外观。关于地形，50% 的真菌具有平坦的地形（PJ1、PJ3、PF9、PF10、PF11 和 PJ12），占 25%。褶皱形貌（PJ6、PJ7 和 PJ8），17%，凸形形貌（PJ2 和 PJ4）和 8%，脐状形貌（PJ5）。在边界方面，58% 有规则边界（PJ2、PJ3、PJ4、PJ5、PJ6、PF11 和 PJ12），42% 有不规则边界（PJ1、PJ7、PJ8、PF9 和 PF10）（表 2）。

至于表面，75% 的分离真菌表面光滑（PJ1、PJ2、PJ3、PJ4、PJ5、PF9、PF10、PF11 和 PJ12），17% 的表面有裂纹（PJ2、PJ6 和 PJ8）和 8 %，粗糙表面（PJ7）。在质地方面，58% 的丝状真菌具有棉质质地（PJ1、PJ2、PJ3、PJ4、PJ5、PJ8 和 PF10），25% 具有绒面质地（R6、R8 和 R11），其他丝状真菌具有天鹅绒般的质地。 R9)、粒状 (R7) 和粉状 (R12) 质地（表 2）。在分离出的真菌中，42% 为中等大小（PJ2、PJ3、PJ4、PF9 和 PF10），33% 为大型（PJ1、PJ6、PJ7 和 PJ8），25% 为小型（PJ5、PF11 和 PJ12）。PJ2、PJ3、PJ4、PJ5 和 PF11 真菌具有粉红色和桃色色素沉着（表 2）。

在 Zipperer 和合作者的工作中，从巴西南卡罗来纳州 Videir 市种植葡萄藤的土壤中分离出了四种真菌。这些真菌在 BDA 培养基中生长，对其宏观形态特征进行了分析。观察到白色、光滑的表面和棉质质地[ 26 ]。

菌

颜色

方面

地形

边界

表面

质地

尺寸

色素沉着

PJ1

白色的

干燥

平坦的

我

光滑的

棉质的

大的

-

PJ2

白色的

干燥

凸的

R

光滑的

棉质的

中等的

+（粉红色）

PJ3

白色的

干燥

平坦的

R

光滑的

棉质的

中等的

+（桃子）

PJ4

白色的

干燥

凸的

R

光滑的

棉质的

中等的

+（粉红色）

PJ5

白色的

干燥

脐带

R

光滑的

棉质的

准时

+（桃子）

PJ6

棕色的

干燥

打褶

R

有裂缝的

绒面革

大的

-

P7

棕色和白色

干燥

打褶

我

粗糙的

粒状

大的

-

睡衣 8

棕色和绿色

干燥

打褶

我

有裂缝的

绒面革

大的

-

PF9

白色的

干燥

平坦的

我

光滑的

天鹅绒般的

中等的

-

PF10

白色的

干燥

平坦的

我

光滑的

棉质的

中等的

-

PF11

白色的

干燥

平坦的

R

光滑的

绒面革

微小的

+（粉红色）

PJ12

黑色的

干燥

平坦的

R

光滑的

粉状

微小的

-

表 2。分离丝状真菌的宏观特征。

R，规则和 I，不规则；− 无色素沉着；+ 存在色素沉着。

在 Souza 和合作者的研究中，在 Janaúba-MG 市，从树皮中分离出 21 种真菌，从果皮中分离出 6 种真菌，从腐烂的叶子中分离出 2 种真菌，在 BDA 培养基中分析了这些真菌的宏观形态特征。分离后发现菌落颜色有绿、黑、白、蓝等深浅不一，有的具有与作者分离的特征相似的色素沉着分泌物，除与作品相似外，所有微生物均具有光滑的背景由作者进行，其中大多数分离的真菌也呈现出光滑的底部 [ 27 ]。

3.2. 温度对丝状真菌生长的影响

分析丝状真菌在BDA培养基中不同温度下的生长情况，95%的真菌在30℃下发育；只有PF9真菌没有发育。该温度是已鉴定的丝状真菌如 3.2TA (0.088 cm∙h - 1 )、PJ8 和 PJ7 (0.070 cm∙h - 1 )生长速率最高的温度；PJ6 (0.068 cm∙h - 1 ); 观察到 MB2.2 (0.055 cm∙h - 1 ) 和 P3 (0.032 cm∙h - 1 )。在该温度下观察到最大生长速率的微生物是 3.2TA、PJ8 和 PJ7，平均为 0.076 cm∙h - 1（图 2）。

在 35˚C 时，70% 的真菌生长。获得最高生长速率的真菌为 3.2TA (0.128 cm∙h - 1 )、MB2.2 (0.113 cm∙h - 1 )、P3 (0.089 cm∙h - 1 ) 和 PJ6 (0.074 cm∙ h - 1 )。真菌 PJ1、PJ2、PJ3、PJ5、PF9 和 PF10 在此温度下不发育（图 2）。

根据文献，很少有丝状真菌可以在 40˚C 以上的温度下生长。在目前的研究中，40%的真菌在此温度下发育，生长速度最高的样品为3.2TA

图 2。BDA 培养基中丝状真菌的真菌生长速率（厘米/小时）。

(0.076 cm∙h - 1 ), PJ6 (0.071 cm∙h - 1 ); PJ8 (0.066 cm∙h - 1 ); PJ12 (0.024 cm∙h - 1 ); MT171 (0.015 cm∙h - 1 )、PF11 (0.013 cm∙h - 1 ) 和 P3 (0.011 cm∙h - 1 )。只有真菌 PJ6 (0.005 cm∙h - 1 ) 和 PJ12 (0.003 cm∙h - 1 ) 在 45˚C 下生长，在 50˚C 下没有生物发育（图 2）。

生物可以根据理想的生长温度进行分类，分为三类，嗜冷菌（温度低于 20°C）、嗜温菌（介于 25°C 和 40°C 之间）和嗜热菌（温度高于 40°C）。归类为嗜温菌形式的那些涉及大多数微生物。尽管它们在中等温度下表现出极好的生长，但其中一些可以在更高的温度下生长，称为耐热植物 [ 28 ]。

文献中报道了与作者类似的研究，在不同温度下的生长分析中，Souza 在 35°C 至 50°C 的 BDA 培养基中进行，每 5°C 变化一次，得出的结论是所有分离的微生物是嗜温的，因为它们都在 35˚C 下生长。13 种真​​菌在 40℃ 生长，7 种在 45℃ 生长，3 种真菌在 50℃ 生长，在作者的分析中没有出现 50℃ 没有真菌生长的情况[ 27 ]。文献[ 29 ]也报道了类似的结果。

3.3. 丝状真菌的脂解潜力分析

在分离的真菌中，鉴定为 PJ7 和 PF9 的那些在脂肪酶的固体培养基中没有生长，而在 PJ8 和 PJ6 菌株中观察到最大的真菌生长晕。然而，当使用显影溶液时，没有观察到脂解活性的光晕。观察到 PJ12 和 PJ4 真菌的生长晕圈，这些是唯一呈现脂解活性晕圈的分离真菌（分别为 0.39 厘米和 0.24 厘米）（表 3）。

在以前的研究中实验室已经分离出的真菌中，观察到最大的生长晕圈是 3.2TA 微生物。MB2.2 和 P3 真菌没有观察到脂肪酶活性晕圈，而 3.2TA 真菌获得了 0.92 cm 的活性晕圈，随后是具有 0.31 cm 晕圈的真菌 M1.7.1（表 3）。

丝状真菌是因其易于培养而脱颖而出的微生物。没有必要为了释放它们而破裂细胞，因为它们将酶直接分泌到培养基中。此外，它们产生大量的酶，它们在许多工业应用中具有很高的潜力 [ 30 ]。

微生物来源的脂肪酶具有特殊的工业重要性，代表了生物技术应用中使用最广泛的一类生物催化剂。在被认为是脂肪分解酶的良好生产者的微生物中，真菌有很大的潜力有待探索 [ 31 ] [ 32 ] [ 33 ] [ 34 ]。来自丝状真菌的脂肪酶的主要好处是它们的细胞外性质，这大大降低了这些酶的生物催化过程的总成本，从工业角度来看，它们比细菌脂肪酶更有趣 [ 32 ] [ 35 ] [ 36 ] [ 37 ]。

菌

脂肪酶晕 (cm)

PJ1

-e

PJ2

-e

PJ3

-e

PJ4

0.24 ± 0.02 天

PJ5

-e

PJ6

-e

PJ7

-e

PJ8

-e

PF9

-e

PF10

-e

PF11

-e

PJ12

0.39 ± 0.01 b

P3

-e

C435

-e

EA3.3.2

-e

3.2TA

0.92 ± 0.01 一个

MB1.1

-e

EA1.2.1

-e

M1.7.1

0.31±0.01℃

MB2.2

-e

表 3。由丝状真菌在含有吐温 80 的固体培养基中产生的脂肪酶活性光环（厘米）。

Tukey 检验以 5% 的概率水平应用。列中相同字母（小写）后跟的平均值在统计上没有差异。“-”符号代表尚未生长的微生物。

在这方面，丝状真菌被广泛认为是脂肪分解酶的最佳来源，应用在制药领域、精细化学品和化学油的合成、食品、皮革、化妆品、洗涤剂和香料工业，以及富含脂质的废水的预处理、被脂肪污染的土壤的生物修复和生物柴油的合成 [ 32 ] [ 33 ] [ 34 ]。在生物燃料领域，由于较低的能源成本和较低的环境影响，脂肪酶已被用作该过程的催化剂。因此，有必要研究丝状真菌产生的脂肪酶用于生物技术应用。

在 Miranda 和合作者的工作中，在含有大豆油、Tween 20、琼脂和罗丹明 B 染料的 Marine Broth 培养基中培养了分离的产脂肪酶微生物。在紫外光 (365 nm) 下观察板。从巴比通加湾红树林中分离出三种微生物，并通过定性测试表明脂肪酶的产生 [ 38 ]。

Paludo 和合作者分析了来自托坎廷斯联邦大学的 205 种酵母菌株，这些菌株是从 Taquaruçu 市三个溪流中收集的分解叶子中分离出来的。在含有蛋白胨、NaCl、CaCl 2、琼脂和Tween-20的培养基中测定脂肪酶的产生。在评估的 205 株菌株中，观察到至少一种酶的阳性结果，脂肪酶 83 株（40.5%）、纤维素酶 59 株（28.8%）、木聚糖酶 30 株（14.6%）和淀粉酶 35 株（17.1%） [ 39 ]。

Rodrigues 和合作者评估了 41 种真菌分离物在由蛋白胨、NaCl、CaCl 2、琼脂和吐温 80 组成的固体 MB 培养基中的细胞外脂解活性，其中 10 种真菌具有活性 [ 40 ]。

4。结论

丝状真菌的勘探是一种可行的替代方案，可以探索给定区域的生物技术潜力，因为它可以了解产生生物技术兴趣酶的微生物种类。从这4个采集点中，可以分离出9种来自jabuticaba树的叶子和土壤的真菌和3种来自安都豆叶子的真菌，并分析了它们的颜色、大小和质地等形态特征。在分析真菌的最适生长温度时，发现 95% 的真菌在 30˚C 下发育，将它们定性为中温生物。此外，验证了 3.2TA、PJ12、M1.7.1 和 PJ4 真菌的脂肪分解潜力，这是从生物技术角度来看的一个重要特征。

致谢

我们感谢 Jequitinhonha 和 Mucuri Valleys 联邦大学、Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais-FAPEMIG，以及参与研究实验室的整个师生团队。该项目已在 Sistema Nacional de Gestão do Patrimônio Genético e do Conhecimento Tradicional Associado (SisGen) 注册，编号 A64AD93。

利益冲突

作者声明与本文的发表没有利益冲突。

参考

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