哺乳期补充益生菌对断奶犊牛瘤胃微生物区系的影响

摘要：实验选取了8头具有相同饲养环境、年龄相近的新生雄性荷斯坦犊牛。他们被随机分成2组，每组4人。治疗包括喂食活性益生菌（P组）和正常喂食对照组（C组）。测量生长性能和血液指标；断奶后采集瘤胃液样品，进行16SrDNA测序和LC-MS代谢组检测。与对照组相比，Deltaproteobacteria, Desulfovibrionales, Bacteroi dales_BS11_gut_group , Desulfovibrionaceae, Bacteroidales_S24-7_group, Acet obacteraceae, Ruminococcaceae_NK4A214_group, Asaia, [ Ruminococcus ]的相对丰度P组葡萄球菌属、脱硫弧菌属、金氏菌属、硒单胞菌属、毛梭菌属差异有统计学意义（P < 0.05）。P组代谢产物2-甲基苯甲酸和肌醇明显升高（P < 0.05）。这些结果表明，与正常饲喂的犊牛相比，饲喂益生菌的犊牛的生长性能和血液指标发生了变化，但差异不显着。益生菌喂养的小牛在瘤胃液和少数代谢物方面表现出显着差异，这些代谢物主要参与碳水化合物代谢途径。证明补充活性益生菌对瘤胃菌群有影响。

关键词

小牛,益生菌,瘤胃液,血清,代谢物

一、简介

益生菌的概念可能起源于诺贝尔奖获得者俄罗斯科学家梅奇尼科夫最先提出的理论。他怀疑保加利亚农民的长寿是由于发酵乳制品[ 1 ]。益生菌一词最初是由礼来公司创造的，用于描述一种微生物分泌以促进另一种微生物生长的物质 [ 2 ]。Parker 随后提出益生菌有助于肠道微生物平衡 [ 3]。富勒将益生菌定义为通过改善微生物平衡对宿主动物产生有益影响的活微生物饲料添加剂。他还提到，益生菌是含有活细胞或稳定的局部微生物代谢物的生物制剂，可以优化动物和人类肠道菌群的定植和组成，并可能支持消化和宿主免疫。益生菌被定义为非致病性微生物，摄入后会对宿主的健康或生理产生积极影响。它们在压力或疾病期间恢复和维持理想微生物的平衡，并促进幼小动物的生长[ 4 ]。益生菌是活的微生物，当益生菌数量足够时，可以改变宿主消化道的微生物群[5 ]，从而改善健康和生产。益生菌现在广泛用作牲畜的饲料添加剂，已被定义为非病原微生物。他们的目标是通过维持健康的胃肠环境和改善肠道来提高生产力和疾病预防 [ 6 ]。益生菌增强瘤胃微生物生态系统 [ 7 ]，养分消化率 [ 8]，养分吸收和饲料转化，从而使动物有更好的生产性能。在新生犊牛中，微生物区系易受饮食和环境变化的影响。断奶是幼畜面临的挑战之一。在这个阶段，小牛经历生理、营养和环境挑战，很容易导致微生物失衡。细菌益生菌通过产生多种对革兰氏阳性和革兰氏阴性病原菌的抑制物质来拮抗病原菌的生长。潜在的抑制剂可能包括有机酸、过氧化氢和细菌素。此外，许多乳酸菌会产生抗生素代谢物（嗜酸菌素、嗜酸菌素、乳酸杆菌和乳酸菌素），可抑制沙门氏菌、志贺氏菌、葡萄球菌、变形杆菌、克雷伯氏菌、假单胞菌、芽孢杆菌和弧菌活性，抑制肠致病性大肠杆菌。益生菌通过刺激免疫系统发挥免疫调节作用 [ 9 ]。益生菌可以提高免疫球蛋白的产生 [ 10 ] 并增强巨噬细胞和自然杀伤细胞的活性 [ 11 ]。它们还调节抗炎和促炎细胞因子的产生 [ 12 ]。益生菌对营养生长因子的粘附部位和病原微生物具有拮抗作用[ 13]，这可以降低肠道感染的风险 [ 14 ]。已发现益生菌通过刺激免疫球蛋白、巨噬细胞、自然杀伤细胞和细胞因子的产生来增强宿主免疫力。然而，益生菌发挥其有益作用的确切机制尚未完全阐明。

幼年反刍动物的消化酶系统发育不完善。出生后蛋白酶系统尚未完全建立，胃蛋白酶产生较晚，消化食物等固体物质的能力较弱。枯草芽孢杆菌是非致病性的，可分泌多种抗生素和酶。研究表明，枯草芽孢杆菌可产生蛋白酶、纤维素酶、α-淀粉酶、植酸酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶、果胶酶等酶类[ 15 ]。枯草芽孢杆菌还可以产生维生素 K、猪血肽 [ 16 ]、β-甘露聚糖酶、环状二肽 [ 17 ] 和抗菌肽 [ 18]。这些活性物质对病原菌有显着的抑制作用。枯草芽孢杆菌孢子非常适合加工成微胶囊包以引入小牛，因为它们高度稳定：它们耐氧化、耐压缩、耐 60˚C 的长期温度、酸和碱。它们可以在酸性胃环境中保持活跃，抵抗唾液和胆汁的侵袭，让活菌100%到达大肠。

酵母可以促进纤维素分解菌的生长和酶活性，提高微生物蛋白质合成和纤维消化率[ 8 ]。它们的维生素和蛋白质含量很高，既可作为食物来源，也可用于药用。还可以提取细胞色素 C、核酸、谷胱甘肽、凝血酶、辅酶 A 和三磷酸腺苷。酵母代谢物和细胞壁等有益物质会导致胃肠道微生物群落平衡 [ 19 ] 并缓解压力 [ 20 ]。酵母酿酒酵母可以产生许多生长因子，如维生素B、支链脂肪酸、氨基酸和肽。添加酿酒酵母对奶牛日粮进行培养可有效稳定瘤胃发酵环境 [ 21 ]。

2。材料和方法

2.1。测试设计

实验选取了8只初生荷斯坦公牛犊，饲养环境相同，年龄相近。他们被随机分成2组，每组4人。对照组喂奶+日粮（C组）；实验组犊牛饲喂牛奶+日粮+复合益生菌（P组）。在第二周开始使用益生菌，每次喂食时补充 10 g，持续一周。益生菌由枯草芽孢杆菌和酿酒酵母组成。枯草芽孢杆菌（CFU/g）≥9.0×10 7，酿酒酵母（CFU/g）≥1.0×10 7，水分（%）≤45。

2.2. 犊牛饲养管理

出生后，将犊牛的脐带浸泡在 7% - 10% 的碘溶液中，并称重。初乳经过巴氏杀菌，并在 36°C 至 40°C 的温度下提供给小牛。小牛一小时喂入4L优质初乳（体重的8%-10%），6-8小时喂入3-4L初乳，保证12小时内摄入6-8L初乳. 喂食初乳后 8 小时喂普通牛奶，每天喂食两次（7:00 和 15:00）。无法正常喝奶的小牛用奶瓶喂养。出生第4天，喂养方式改为牛奶桶喂养。全天提供牛奶。小牛出生后第三天开始自由饮水。冬季提供温水，24小时有水。小牛每天按照标准喂食（表 1 )。所有管理和实验程序均按照中国实验动物福利和伦理指南进行。

2.3. 样品采集和处理

采食记录

在试验期间，准确记录每天的饲料量和剩余饲料量。

体重和体型测量

身体尺寸测量由同一个人进行，以确保一致性。

体高：用量尺测量的从马肩隆最高点到地面的垂直距离。

身长：从肩部到坐骨末端的距离，用卷尺测量。

胸围：用卷尺测量的肩胛后角处身体的垂直周长。

大炮周长：在前肢大炮骨三分之一处测量的周长，用胶带测量。

在测试期之前和之后测量体重。

采血器和样品制备

从颈静脉采集血液，每头小牛采集大约 20 mL 的血液。采血时间为早上 7 点，早上从 15 天和 60 天龄的小牛身上采血。采血后，置于凝血管中，室温静置30 min。待血清沉淀后，在低速离心机中以 3000 r/min 离心 15 min，用移液管吸出血清，分装至 1.5 mL 离心管中，-20℃保存。

瘤胃液收集

第 10 周后，屠宰小牛，从瘤胃食糜中挤出瘤胃液，用四层纱布过滤，放入 5 mL 冷冻管中，在 -80˚C 下储存直至测试。

2.4. 样品分析

基于16s Rdna V3+V4区域的瘤胃液微生物多样性分析

提取样品的总 DNA 后，设计引物退火

天

1 - 10

11 - 20

21 - 30

31 - 40

41 - 50

51 - 55

牛奶

4.5升

6.5 升

8升

8.5 升

4升

3升

表 1。喂给小牛的牛奶量。

到保守区域，在其 5' 末端具有测序引物同源性。提取总DNA并进行PCR扩增。PCR产物经纯化、定量和均质化形成测序文库，文库采用Illumina HiSeq 2500测序，序列聚类相似度为97%。

基于LC-MS的瘤胃液代谢组学分析

使用 Agilent 1290 UHPLC 超高液位计和 AB 5600 三重 TOF 质谱仪分析样品。数据通过使用正交投影到潜在结构-纪律分析（OPLS-DA）的统计方法进行分析。通过将学生 t 检验的 P 值与 OPLS-DA 模型的 VIP 值相结合来筛选差异代谢物。筛选标准为P值<0.05和VIP>1.5。

数据分析

使用EXCEL对原始数据进行统计处理。使用 SAS 8.2 软件中的 One-Way ANOVA 模型分析数据，并使用 Duncan 的多重检验进行比较。P < 0.01 表示差异极显着，0.01 < P < 0.05 表示差异显着，0.05 < P < 0.1 表示存在差异趋势。结果以平均值±SEM的形式表示。

3. 结果

3.1。增长绩效结果

表 2显示了补充益生菌对小牛生长和采食量的影响。从表中可以看出，两个治疗组在试验前没有差异（P>0.05）。补充后

团体

p

C

磷

治疗前

重量，公斤

40.38 ± 1.16

38.13 ± 2.70

0.47

身高，厘米

77.93 ± 2.23

76.65 ± 2.31

0.71

长度，厘米

68.00 ± 1.91

69.23 ± 1.92

0.67

胸围，厘米

79.00 ± 0.91

77.50 ± 1.66

0.46

治疗后

重量，公斤

95.25 ± 3.33

98.88 ± 5.31

0.58

日增重，公斤

0.89 ± 0.07

0.98 ± 0.05

0.31

身高，厘米

93.43 ± 2.63

93.51 ± 2.10

0.98

长度，厘米

92.15 ± 2.47

92.61 ± 3.78

0.92

胸围，厘米

108.60 ± 0.98

108.45 ± 1.49

0.79

每日摄入量，克

373.47 ± 95.41

290.74 ± 73.11

0.52

表 2。瘤胃液补充对犊牛生长性能的影响。

益生菌对试验期间犊牛日增重、身高、体长、胸围和采食量无显着影响（P>0.05）。

3.2. 血清指数结果

表3 显示了各组小牛血清指数的变化。由于试验动物的个体差异，试验前各组之间的小牛血清指数（补充表S1）存在统计学差异，这种差异无法避免。因此，对血清结果的变化进行了统计分析。数值大小表示两个时间点的变化量，正负值分别表示增加或减少。第一阶段为7日龄至15日龄，说明治疗后血清指标的变化；第二阶段为15日龄至63日龄，表示治疗一段时间，直至断奶后血清指标发生变化。从表中可以看出，补充

团体

p

C

磷

第一阶段

IgA，微克/毫升

30.85 ± 2.07

33.82 ± 2.11

0.35

IgG，微克/毫升

−104.69 ± 9.76

−112.26 ± 8.67

0.58

IL-1β, ng/mL

17.82 ± 1.74

11.98 ± 2.14

0.08

肿瘤坏死因子-α, ng/mL

3.33±5.62

3.63 ± 2.67

0.96

IL-4，纳克/升

47.93 ± 1.98

0.00 ± 0.79

<0.01

IL-6，纳克/升

2.98±0.53

2.51±0.16

0.42

干扰素-γ,ng/L

−280.13 ± 33.20

−224.76 ± 22.38

0.22

生长激素，微克/升

−1.08 ± 0.43

−3.61 ± 0.28

<0.01

LP，微克/升

−0.40 ± 0.18

1.48±0.14

<0.01

第二阶段

IgA，微克/毫升

2.455 ± 1.23

0.70 ± 0.47

0.23

IgG，微克/毫升

−1.89 ± 57.51

65.45 ± 9.68

0.29

IL-1β, ng/mL

9.46 ± 2.64

10.60 ± 2.85

0.78

肿瘤坏死因子-α, ng/mL

9.09 ± 5.07

9.17 ± 3.15

0.99

IL-4，纳克/升

−41.86 ± 1.29

−45.35 ± 4.54

0.49

IL-6，纳克/升

7.31±0.45

7.46±0.08

0.76

干扰素-γ,ng/L

153.00 ± 20.55

108.35 ± 28.19

0.25

生长激素，微克/升

−0.12 ± 0.17

0.71 ± 0.47

0.15

LP，微克/升

0.08 ± 0.34

0.90 ± 0.27

0.11

表 3。益生菌对小牛血清的影响。

益生菌仅对第一阶段血清IL-4、GH、LP有显着影响（P < 0.05），对第一阶段或第二阶段其他血清指标无显着影响（P > 0.05）。

3.3. 16S rDNA 测序结果

从图1中，我们发现所有样品的稀释曲线趋于平坦，说明样品测序充分，深度几乎覆盖了样品中的所有物种。

标签以97%的相似度聚类得到OTU，基于Silva（细菌）分类数据库对OTU进行分类得到每个样本的OTU数。从 8 个样本中总共获得了 349 个 OTU。对照组有337个OTU，P组有302个OTU。从维恩图可以看出，两组共有290个OTU，只有C组有47个OTU，只有P组有12个OTU（图2）。

将OTU代表序列与微生物参考数据库进行比较，得到每个OTU对应的物种分类信息。此外，对每个样本群落的组成进行了各个层次（门、纲、目、科、属、种）的统计，得到了不同分类层次的物种丰度。仅显示丰度水平前十的物种，其他物种合并为“其他”。在图中，Unclassified 表示没有分类注释的物种。

在门水平上，C组瘤胃液检出11个门，P组检出11个门（图3）。C组主要含有49.95%的拟杆菌门、32.06%的厚壁菌门、13.19%的变形杆菌门、1.64%的纤维杆菌门和2.31%的特内里奎特门。P组主要含有43.90%的拟杆菌门、37.04%的厚壁菌门、17.79%的变形菌门。

图 1。观察物种的基于样本的稀疏曲线。

图 2。跨不同组共享 OTU。

图 3。门级样本中的分类组成分布。

图4属水平上，C组瘤胃液检出122个属，P组瘤胃液检出121个属。C组主要含有Prevotella_7的15.40%，Prevotella_1的24.22%，Prevotella_1的10.93%。琥珀弧菌科_UCG-001, 9.80% Roseburia。P组主要含有19.04%的Prevotella_7、18.85%的Prevotella_1、14.60%的Succinivibrionaceae_UCG-001、9.51%的Roseburia和7.89%的Megacphaera。

图 4。属水平样品中的分类组成分布。

表4显示了C组和P组瘤胃液细菌含量大于0.01%的细菌分类统计，其中Deltaproteobacteria、Desulfovibrionales、Bacteroidales_BS11_gut_group、Desulfovibrionaceae、Bacteroidales_S24-7_group、Acetobacteraceae、Ruminococcaceae_NK4A214_group、Asaia、 [ Ruminococcus ] gauvreauii _ group、Desulfovibrio、Kingella、Selenomonas和 Lachnoclostridium。红螺菌属、伯克霍尔德菌科、韦荣菌科_UCG-001、琥珀弧菌属、巨球菌属、伯克霍尔德菌属-帕拉伯克霍尔德菌属和瘤胃梭菌_6有不同的趋势。

3.4. 代谢组学分析

两组之间代谢物水平的差异，以及这些差异的统计学意义，可以通过火山图快速查看。差异表达火山如下：与C组相比，P组正离子模式下有26个显着代谢物，其中22个显着减少，4个显着增加；负离子模式下显着代谢物24种，其中显着减少7种，显着增加17种（图5）。

从表5可以看出，与C组相比，P组的一些代谢物明显增加，包括2-甲基苯甲酸、肌醇。主要相关代谢途径包括抗坏血酸和醛糖酸代谢（ko00053）、半乳糖代谢（ko00052）、肌醇磷酸代谢（ko00562）。显着减少的代谢物包括：硫胺素，涉及的主要代谢途径是硫胺素代谢（ko00730）。

图 5。C组和P组之间代谢物分布的火山图注：火山图中的每个点代表一种代谢物，横坐标代表该组相对于物质的倍数变化（以2为底的对数），纵坐标代表P值学生的 t 检验（以 10 为底的对数）。散点大小代表 OPLS-DA 模型的 VIP 值。散度越大，VIP值越大，差异表达的代谢物越可靠。图中绿点代表差异表达的代谢物，红点代表上调的差异表达代谢物，黑色代表检测到但没有显着差异的代谢物。

细菌

平均值 (C)

标准错误 (C)

平均值 (P)

标准误差 (P)

磷

班级

变形杆菌门

1.34

0.33

0.39

0.18

0.03

命令

脱硫弧菌目

1.29

0.30

0.38

0.17

0.02

红螺菌目

0.02

0.00

0.06

0.02

0.08

家庭

拟杆菌目_BS11_gut_group

0.07

0.03

0.00

0.00

0.01

脱硫弧菌科

1.29

0.30

0.38

0.02

0.02

拟杆菌目_S24-7_group

0.06

0.20

0.09

0.07

0.03

醋杆菌科

0.01

0.00

0.04

0.01

0.04

伯克氏菌科

0.01

0.00

0.02

0.01

0.09

属

瘤胃球菌科_NK4A214_group

0.16

0.03

0.05

0.01

<0.01

亚赛亚

0.00

0.00

0.03

0.01

<0.01

[瘤胃球菌]gauvreauii_group

0.19

0.05

0.02

0.01

0.01

脱硫弧菌

1.29

0.30

0.38

0.17

0.01

金杰拉

0.01

0.00

0.02

0.00

0.03

硒单胞菌属

2.06

0.75

0.33

0.06

0.03

表 4。瘤胃液中细菌含量的差异。

代谢物

代谢途径

倍数变化

磷

贵宾

2-甲基苯甲酸

代谢途径 (ko01100)

1.373

0.020

2.156

肌醇

抗坏血酸和醛酸代谢（ko00053）；

半乳糖代谢（ko00052）；

磷酸肌醇代谢 (ko00562)

1.429

0.012

2.315

硫胺素

硫胺素代谢 (ko00730)

0.485

0.026

2.123

表 5。代谢物及其相应的代谢途径。

4。讨论

4.1。补充益生菌对小牛生长的影响

实验中补充益生菌仅增加小牛日增重，但差异不显着（P>0.05）。饲喂益生菌从数值上降低了小牛的采食量，差异不显着（P>0.05）。用酵母或酵母培养物喂给反刍动物的实验也有不一致的结果。研究发现，喂食后体重没有显着变化，甚至体重减轻 [ 22]。研究还发现，饲喂后体重增加显着增加，饲料利用率得到改善。Kawas 提到补充酵母提高了饲喂低蛋白日粮的羔羊的体重增加，但对饲喂高蛋白日粮的羔羊没有任何有益影响。饲喂枯草芽孢杆菌培养物的荷斯坦犊牛的体重和饲料效率没有显着差异[ 23]。饲喂益生菌的小牛缺乏一致的结果，益生菌已被证明可以提高生长性能、增加体重和饲料转化率，但也没有任何益处。研究人员对益生菌的研究结果并不完全一致。本实验结果表明，饲喂益生菌可以在一定程度上提高犊牛的生长性能，但效果并不显着。

4.2. 补充益生菌对小牛血清的影响

IL-4是T细胞分泌的一种淋巴因子，具有多种生物学功能。在其他细胞因子的协同作用下，对B细胞具有增殖分化作用。对照组第一阶段IL-4明显升高，而P组无明显变化。研究表明，饲喂枯草芽孢杆菌对犊牛血清 IgA 和 IL-6 无影响，但 IFN- γ升高[ 24 ]。本实验中，饲喂益生菌对小牛血清的影响只能用个别血清指标来显示，但具体机制有待进一步研究。

4.3. 补充益生菌对小牛瘤胃液微生物的影响

给未断奶的羔羊喂食发酵剂显着增加了瘤胃中 unclassified_BS11_gut_group 的丰度 [ 25 ]。添加莫能菌素显着降低了奶牛拟杆菌属_BS11_gut_group和瘤胃球菌科的丰度[ 26 ]。P组未检测到Bacteroidales_BS11_gut_group；因此，丰度显着低于C组。P组瘤胃球菌科_NK4A214_群、[瘤胃球菌]_gauvreauii_群和瘤胃梭菌_6的丰度也显着低于C组，这与添加莫能菌素的结果一致。添加黄豆苷元显着降低了小牛粪便中 Bacteroidales_S24-7_group 的丰度 [ 27]，而在我们的试验中，P 组益生菌的 Bacteroidales_S24-7_group 丰度显着高于 C 组。小麦胚芽球蛋白可以增加肠道内有益菌的数量，维持肠道菌群的动态平衡。小麦胚芽球蛋白模型小鼠瘤胃球菌科 NK4A214 组的丰度降低 [ 28]。麦麸喂养仔猪可以通过减少消化量来减少肠道病原体的增殖。饲喂麦麸后，猪粪便中瘤胃球菌科NK4A214群的丰度降低。实验中，P组瘤胃球菌NK4A214组的丰度显着低于C组，与其他研究结果一致。2008 年，Domingo 等人从人类粪便中分离出抗糖化型高氏瘤胃球菌，它是一种严格厌氧的革兰氏阳性球菌，在糖尿病大鼠肠道中显着增加[ 29 ]。瘤胃球菌的丰度P组的gauvreauii明显低于C组。研究表明，厌氧菌在反刍动物中产生活性植酸酶，尤其是硒单胞菌[ 30 ]。在糖精培养的刺激下，可以提高硒单胞菌对乳酸的利用[ 31 ]。在本研究中， P组的硒单胞菌明显低于C组。因此，我们证明了在维持正常的基础上，补充益生菌可以将一些细菌的丰度向更有利于犊牛生长需要的方向改变。瘤胃细菌。

4.4. 补充益生菌对小牛瘤胃液和代谢途径的影响

我们发现补充益生菌仅对小牛瘤胃液中的少数代谢物有显着影响。其中，与碳水化合物代谢途径相关的代谢物肌醇和2-甲基苯甲酸显着增加。与辅因子和维生素代谢途径相关的维生素 B1 显着减少。肌醇又称环己醇，是一种具有生物活性的糖醇，是动物和微生物的生长因子。产生肌醇的主要微生物是酿酒酵母、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌[ 32 ]。在许多细菌中都发现了肌醇的代谢途径，参与这些途径的基因大部分是保守的。33 ]。研究表明，Rhizobium leguminosarum bv。viciae 和 Sinohozobium meliloti 可以利用土壤中丰富的肌醇作为生长的唯一碳源 [ 34 ]。补充益生菌会增加瘤胃液中一些代谢物的水平，并可能促进碳水化合物代谢途径。

5. 结论

本研究研究了活性益生菌对犊牛生长性能和瘤胃细菌定植的影响。发现补充活性益生菌对瘤胃微生物区系有影响，但对生长性能和代谢物影响不大。

致谢

本研究得到山东省重点研发计划专项资金（2019JZZY010704）感谢与山东碧兰生物科技公司的合作。国家重点研发计划（2017YFD0500502） )，山东省牛农产业技术研究系统(SDAIT-12-011-06)，国家自然科学基金(31572427)(31372340)，泰山学者项目。

补充

补充表S1。7日龄小牛的血清指标。

团体

磷

C

磷

IgA，微克/毫升

41.04 ± 1.13

42.50 ± 1.03

0.38

IgG，微克/毫升

559.05 ± 10.87

560.07 ± 5.38

0.94

IL-1β, ng/mL

49.22±2.51

45.66±0.72

0.22

肿瘤坏死因子-α, ng/mL

52.18 ± 1.66

50.55±1.01

0.43

IL-4，纳克/升

58.58 ± 1.69

107.53 ± 1.32

<0.01

IL-6，纳克/升

13.30 ± 0.59

13.10 ± 0.18

0.76

干扰素-γ,ng/L

749.93 ± 27.41

788.33 ± 21.83

0.32

生长激素，微克/升

15.24±0.19

15.98±0.09

0.01

LP，微克/升

6.68±0.11

5.53±0.13

<0.01

利益冲突

作者声明与本文的发表没有利益冲突。

参考

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