黄旱莲内生菌的特性及其对C57BL/6J小鼠肠道微生物群的调节作用

摘要：旱莲草对人体健康的促进作用已被广泛研究。先前的研究证明，E. prostrata通过肠道微生物群 (GM) 在 SAMP6 小鼠中具有抗骨质疏松症功能。内生菌广泛存在于植物中，尤其是在中草药中。然而，关于E. prostrata的内生菌知之甚少。在这项研究中，我们专注于筛选和鉴定植物E. prostrata的内生菌，并探索它们在调节 GM 中的作用。根据生化、生理测试和 16 SrDNA序列分析，在植物E. prostrata的不同位置鉴定出10种内生菌，分别属于乳球菌属、芽孢杆菌属、肠球菌属、微小杆菌属和泛菌属。通过牛津杯法研究内生菌EP01-10的抗菌活性。此外，还检测了EP01-10的抗酸和抗胆盐能力，以探索其在胃肠道中的存活能力。结果表明，乳球菌、芽孢杆菌和微小杆菌菌株（ EP01、03和 05）对 大肠杆菌和金黄色葡萄球菌以及乳球菌、芽孢杆菌和肠球菌菌株（EP01、02、04、08 和 10）具有在胃肠道中存活的能力。对 C57BL/6J 小鼠中的 GM 进行 16S rRNA 测序以进行多样性和结构分析，以响应 E. prostrata提取物的给药。E. prostrata提取物有助于改善微生物群落多样性，特别是显着增加乳球菌的丰度。因此，作为一种内生菌，乳球菌在E. prostrata中发挥着重要作用 调节肠道。我们的研究表明，中草药内生菌可能是通过调节转基因来治疗疾病的新靶点。

关键词

内生菌,旱莲,肠道 微生物, C57BL/6J 小鼠,乳球菌

一、简介

越来越多的研究证实，一些中草药可以调节肠道微生态的平衡[ 1 ][ 2 ]。中草药内生菌及其代谢产物在农业、食品、医药、生态等领域发挥着重要作用，具有广泛的抗菌活性[ 3 ][ 4 ][ 5 ]。内生菌的抗菌物质细胞毒性低，多为新颖的[ 6 ]。此外，内生菌可以调节植物次生代谢产物的生物合成[ 7 ]。包括芽孢杆菌、肠杆菌和节杆菌在内的内生菌在植物根和茎中普遍存在 [ 8]。根际也有内生菌，与土壤中常见的细菌很接近[ 9 ]。生产抗生素或促植物生物质在生物防治、固氮和植物生长中发挥着重要作用[ 10 ]。然而，内生菌的筛选以及它们如何参与植物在肠道中发挥其生物学功能仍有待研究。

旱莲草是向日葵科的一种传统中药 (TCM)，在中国已被用于治疗子宫出血、牙齿松动、耳鸣和头晕 [ 11 ] [ 12 ] [ 13 ]。本研究中使用的 E. prostrata 提取物（通过 EtOH）分别通过 UHPLC-Q-TOF-MS 和 UPLC-MS/MS 进行定性和定量分析 [ 14 ]。E. prostrata 提取物中七种主要化合物的含量如下：0.233 ± 0.005 mg∙g -1 (ecliptasaponin IV)、1.021 ± 0.004 mg·g -1 (ecliptasaponin A)、0.272 ± 0.003 mg∙g -1 (芹菜素), 0.115 ± 0.003 mg∙g -1 (3'-羟基生物链霉素 A), 0.306 ± 0.004 mg∙g -1（木犀草素），0.125 ± 0.008 mg∙g -1（木犀草素-7-O-葡萄糖苷），0.271 ± 0.001 mg∙g -1（维德洛内酯）。药理研究表明，E. prostrata 提取物通过调节肠道微生物群 (GM) [ 15 ]显示出抗骨质疏松症的作用。E. prostrata 含有广泛分布于植物中的多种活性成分，可能有助于为内生菌提供良好的环境。

本研究从E. prostrata野生植物样品中分离出多种内生菌，其中部分内生菌对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有显着抑制作用。然而，E. prostrata 的内生菌与 GM 的关系尚不清楚。基于在胃肠道中的存活能力，进一步分析了E. prostrata的内生菌。进行 16S rRNA 测序以评估 E. prostrata 对 GM 群落的影响，并找出参与调节小鼠 GM 的内生菌。中药内生菌的筛选和表征是一个热点领域，它通过转基因扩展了药效学及其潜在机制的研究。

二、方法与材料

2.1。微生物和培养条件

表1所列微生物EP01-10本研究中使用的从 E. prostrata 草药样品中分离得到的包括 6 株芽孢杆菌菌株、1 株乳球菌菌株、1 株微小杆菌菌株、1 株泛菌菌株、1 株细菌菌株以及大肠杆菌CMCC44103 和金黄色葡萄球菌ATCC6358 的指示菌株在微生物实验室保存天津中医药大学. 本研究中使用的所有培养基成分均为试剂纯级，购自 Solarbio Co., Ltd.（中国北京）。除非另有说明，否则使用的所有其他化学品均为分析级。抗菌研究中使用的固体培养基由 MRS 琼脂（马铃薯，200 克；葡萄糖，20 克；琼脂，18 克；蒸馏水，1 升）和 Luria-Bertani 琼脂（蛋白肽，10 克；酵母提取物， 5 g；NaCl，10 g；琼脂，18 g；和蒸馏水，1 L)。相同的无琼脂液体培养基，用于发酵试验。通过将菌株的单个菌落从平板转移到 10 mL 活化 LB 或 MRS 培养基来活化菌株 EP01-10。将烧瓶在 37°C、150 rpm 下摇动 16 小时。

2.2. 实验动物

实验动物包括 2 个月大的雌性健康小鼠 C57BL/6J（SPF 级），由华福康股份有限公司（中国北京）提供。动物饲养于中国医学科学院放射医学研究所（中国天津），室温（22°C±2°C），相对湿度58% - 65%，光照周期12小时交替。在这项研究中，每组测试了 10 只相同处理的小鼠（每笼 5 只）。

2.3. E. prostrata的原料制备和剂量

E. prostrata于2018年4月采自清远九龙山

姓名

位于 E. prostrata

菌落特征

最高同源株

EP01

根

中等大小，凸起，略带白色，湿润，边缘整齐

乳球菌属ARa2

EP02

叶子

白色，圆形，光滑不透明，边缘整齐

粪肠球菌

EP03

干

白色，圆形，光滑不透明，边缘整齐

巨大芽孢杆菌

EP04

根

白色，圆形，光滑不透明，边缘整齐

芽孢杆菌WS22

EP05

叶子

黄色，光滑，边缘规则，突出

乙酰微小杆菌

EP06

根

白色，圆形，光滑不透明，边缘整齐

细菌 L35

EP07

干

圆形，黄色，边缘整齐，低凸，光滑

成团泛菌

EP08

叶子

白色，圆形，光滑不透明，边缘整齐

巨大芽孢杆菌

EP09

根

白色，圆形，光滑不透明，边缘整齐

芽孢杆菌

EP10

根

无色透明或半透明，比较平整，边缘整齐光滑

蜡状芽孢杆菌

表 1.E. prostrata不同部位内生菌株的菌落特征。

（中国广东）。新鲜的 E. prostrata 的表面用无菌水清洗并在室温下干燥。在无菌条件下，将 100 mg 的根、茎和叶分别切成试管。加入 1 mL 无菌 miliQ 水，样品以 4000 rpm 的转速离心 1 分钟。收集上清液用于以下内生菌筛选。

根据先前的研究[ 15 ]，将 2 kg 干燥的 E. prostrata 用 70% EtOH 回流两次（每次 2 小时），然后将提取物在真空下浓缩至 200 g，并在 4°C 下储存以供饲用。用于治疗P6小鼠的E. prostrata（EP）组原始剂量设计为4.8 g∙kg -1，相应的提取物剂量为0.48 g∙kg -1（表2）。将上述提取物溶解在水中，每只小鼠每天定期喂食 4 周（EP，n = 10），另外 10 只小鼠作为对照组（对照组，n = 10）进行食物喂养。本研究中的所有小鼠都满足 SPF 水平的营养需求。

2.4. 匍匐茎内生菌的筛选鉴定

每 50 μL 上清液包被在 LB 和 MRS 板上，并在 37°C 下培养 24 h。通过观察平板上的菌落特征，从平板中选出不同表型的细菌菌落进行鉴定。用试剂盒（中国天根）提取菌株的基因组DNA，作为PCR模板。使用通用引物 27F：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3' 和 1492R：5'-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3' 对 16S rDNA 序列进行扩增和测序。在 PCR 热循环仪 (Bio-Rad, USA) 中通过聚合酶链式反应进行扩增。PCR 扩增系统和反应因子根据前人的工作 [ 16]。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，试剂盒（中国天根）纯化。然后由 BGI Biotech Co., Ltd.（中国北京）对每个分离株的 16S rDNA 序列进行测序。根据测序结果，使用NCBI-nBLAST在GenBank数据库中搜索最近的亲属。

2.5. E. prostrata 内生菌胃肠道试验中的抗菌活性和存活能力

大肠杆菌和金黄色葡萄球菌被用作以下测定的指示菌株，以检测根据赵等人的筛选菌株的抗菌活性。[ 16 ]。无菌水和 0.4 mg/mL 庆大霉素分别用作阴性对照和阳性对照。将平板在 37°C 下培养 24 小时，并测量抗菌圆直径。每个实验重复 3 次。

团体

小鼠（喂食）

原始剂量

提取剂量

控制

C57BL/6J（饲料）

-

-

预EP

C57BL/6J（饲料）

-

-

后EP

C57BL/6J（食物 + E. prostrata 喂养）

4.8g·kg-1

0.48 g·kg-1

表 2。每组的 E. prostrata 剂量。

胃肠道生存能力试验包括耐酸试验和耐胆盐试验。用37%盐酸（高压灭菌后测定值）配制pH值为3.0、4.0、5.0和7.0（对照）的MRS培养基用于耐酸性试验。在MRS培养基中加入0.5%、1%和2%的胆盐进行胆盐耐量试验，以不含胆盐的培养基作为对照。培养 3 小时后通过平板接种和菌落计数评估耐酸性和耐胆盐试验。存活率以实验组菌落数除以对照组菌落数计算。

2.6. 粪便样本采集和Illumina测序

将每组的新鲜粪便样本（每组 10 只小鼠中的 3 只）收集在无菌试管中，然后冷冻并储存在 -80˚C。然后，通过试剂盒（Tiangen，China）从样品中提取总基因组DNA并通过琼脂糖凝胶监测。然后，使用无菌水将 DNA 样品稀释至 1 ng·μL -1，然后送去测序（Novogene，北京，中国）。使用 515F 5'-GTGCCAAGCMG CCGCGGTAA-3' 和 806R 5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3' 的引物通过 PCR 扩增细菌 16S rRNA 基因 V4 区域。所有 PCR 反应均按照 Zhao 等人的方法进行，PCR 产物进行。[ 15 ]，该文库在 Illumina HiSeq 2500 平台上进行了测序，并生成了平均 250 bp 的双末端读数。

2.7. 生物信息学分析

原始标签在特定过滤条件下对QIIME质量控制过程（V1.7.0）进行，以获得高质量的清洁标签（有效标签）[ 17 ]。通过 Uparse 软件（Uparse v7.0.1001，USA）[ 18 ] 以 ≥97% 的序列相似性对操作分类单元 (OTU) 进行聚类。每个 OTU 的代表性序列在绿色基因数据库中筛选用于分类注释 [ 19 ]。使用 MUSCLE 软件（V3.8.31，美国）进行从 OTU 分类的不同分类水平 [ 20]。随后的α多样性（包括观察物种和chao1指数）和β多样性（包括主坐标分析（PCoA））的分析都是基于这个输出的归一化数据，并进一步用QIIME进行统计计算，并用R软件（V2.15.3）显示）。通过线性判别分析 (LDA) 结合效应大小测量 (LEfSe) 确定各组中富集和显着的细菌，P < 0.05 [ 15 ]。

3. 结果

3.1。植物E. prostrata不同部位内生菌的形态特征

从根中筛选出 5 株细菌，从茎中筛选出 2 株，从叶中筛选出 3 株（表 1）。其中，从根、叶中筛选出的菌落具有白色、圆形、表面光滑不透明、边缘整齐、革兰氏染色阳性的共同特征。通过形态分析，这些细菌与最常见的根际细菌芽孢杆菌相似。此外，从茎中筛选出的EP07菌落具有圆形、黄色、边缘整齐、低凸、光滑和革兰氏阴性特征，鲜有报道。

3.2. 16S核糖体DNA序列分析

确定了扩增的 PCR 产物的 16S rDNA 序列（图 1）。1500 bp片段的序列（补充数据S1）与Genbank中爆破的响应菌株显示出相似性（最小同一性98％），并且同源性最高的菌株显示在表1中。分子和表型鉴定均表明，从 E. prostrata 中筛选出的 10 株菌株均可能属于芽孢杆菌属、乳球菌属、肠球菌属、微小杆菌属和泛菌属。

3.3. E. prostrata内生菌的抑菌活性

采用牛津杯法对分离鉴定的10株细菌进行抑菌活性检测。菌株 EP01、03、05 对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有很强的抗菌活性（如图 2所示）。菌株EP02、04、06、07、08、09和10对这两种病原菌均无抑菌作用。从E. prostrata中分离出的具有抗菌活性的菌株的抑菌区见表3。结合以往的研究，具有抑制活性的菌株广泛分布于根、茎和叶中。EP01菌株的抑菌活性强于其他菌株。然而，菌株EP08和EP09也是芽孢杆菌，它们没有抑制活性。阳性对照组抗生素庆大霉素对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌更敏感。

3.4. 胃肠道内生菌的生存潜力

基于胃肠道环境，高浓度培养基

图 1。从菌株 EP01-10 中检测到的目标 DNA 的琼脂糖凝胶电泳。电泳条件：3 ul 样品 + 1% 琼脂糖凝胶，标记带组成：100 bp、250 bp、500 bp、750 bp、1000 bp、2000 bp、3000 bp、5000 bp。750 bp条带浓度为60 ng/3uL，呈亮条带，其他条带为30 ng/3uL。电泳方向为自上而下。

图 2。从 E. prostrata 中分离出的菌株的抗菌活性。指示菌株是大肠杆菌（a）和金黄色葡萄球菌（b）。NC，阴性对照 miliQ 水；PC，0.4 毫克/毫升庆大霉素。

指标

抑制区 (mm)

EP01

EP03

EP05

个人电脑

金黄色葡萄球菌 ATCC6358

16.33±0.21

16.77 ± 0.36

17.66±0.12

12.43±0.04

大肠杆菌CMCC44103

16.32±0.45

13.51±0.01

14.38 ± 0.21

23.21 ± 0.09

表 3。从 E. prostrata 中分离出的菌株的抑制区。

酸和胆汁盐用于生存试验。考虑到在pH 7.0和无胆盐条件下细菌的存活率为100%（对照），其他条件下的存活率计算为菌落数除以对照（图3）。在 pH 3.0 条件下，菌株 EP01、02、04、08 和 10 培养 3 h 后成活率下降至 >60%，而在 pH 4 条件下成活率 >80%。以 0.5%、1% 生长后和2%胆盐3 h，EP01、02、03、04、08、09和10的数量与没有胆盐的数量相比没有减少。总而言之，包括EP01、02、04、08和10在内的内生菌具有在胃肠道中生存的能力。

3.5. 由 E. prostrata 改变的肠道微生物群落

通过16S rRNA测序，平均得到732个OTU簇。我们通过计算观察到的物种和α多样性指数的Chao 1发现Post-EP小鼠的GM多样性高于Pre-EP小鼠（图4（a））。未加权的基于 uniFrac 的 β 多样性 PCoA 揭示了每组微生物群组成的不同聚类（图 4 (b)）。多样性分析表明，Pre-EP 和 Post-EP 之间的 GM 存在显着差异。在门水平上，厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门构成了所有样品中的三个优势门（图 4（c））。在 Post-EP 组中，厚壁菌门的丰度显着（p < 0.01）高于 Pre-EP（图 4（d））。

图 3。(a) E. prostrata 内生菌的酸耐受性和 (b) 胆盐耐受性试验。

3.6. E. prostrata 通过靶向被鉴定为内生菌的乳球菌来调节肠道微生物群

热图显示了本研究中丰富的前 20 个属水平（图 5 (a)）。在EP喂养小鼠（Post-EP）的GM中，Odoribacter、Atopobium、Prevotellaceae UCG-004、Lactococcus和Lactobacillus等细菌属高于Pre-EP组的比例；细菌属包括Prevotellaceae UCG-001、Bacteriodes、Blautia、Clostridium、Allobaculum和Faecalibaculum的比例均小于Pre-EP组。我们进一步应用 LDA 结合 LEfSe 来探索各组的生物标志物和不同水平的细菌群落的相对丰富度。图 5(b) 总结了每组细菌群落的富集和变化。在属水平上，治疗前组内富集了拟杆菌属、梭菌属、异杆菌属和粪杆菌属；在用 E. prostrata 处理的小鼠组中，乳酸杆菌、Atopobium、Prevotellaceae UCG-004、乳球菌和梭杆菌富集。与Pre-EP组相比，Lactococcus属的丰度高于Post-EP组。在乳球菌中，经 E. prostrata 处理后，L. garvieae、L. raffinolactis 等物种的丰度显着增加。然而，乳酸乳球菌却相反。因此，作为一种内生菌，乳球菌是该植物在肠道中的重要目标（图5（c））。

4。讨论

E. prostrata 作为一种中药，对转基因具有显着的调节作用。最近的研究表明，E. prostrata 可以通过改变 GM 来改善小鼠的骨骼健康 [ 15 ]。细菌多样性丰富，微生物区系结构丰富

图 4. 每个治疗组的微生物群组成的多样性分析。(a) 观测物种和 Chao1 的 Alpha 多样性分析；(b) 基于加权 UniFrac 的主坐标分析 (PCoA)。x轴代表一个主成分，y轴代表另一个主成分，百分比代表主成分对样本差异的贡献；图中的每个点。代表一个样本，同一组样本用相同的颜色表示；(c) 各组在门水平上的相对细菌丰度；(d) 组间门显着性差异的 MetaStat 统计分析。横轴是样本分组；纵轴是相应物种的相对丰度。“*”表示两组差异显着（P < 0.05），

图 5。(a) 属水平细菌群落的相对丰度；(b) Post-和 Pre-EP 组的 LEfSe 分析结果。显示了具有不同丰度的物种。直方图的长度代表不同物种的大小（即LDA得分）；(c) 每组乳球菌属和种的绝对丰度。

E. prostrata 治疗后改变。E. prostrata 对不同动物模型的厚壁菌门和乳杆菌属、乳球菌属和 Atopobium 有改善作用，表明它们可能是 E. prostrata 转基因的潜在靶点。此外，Lactococcus 菌株是从植物 E. prostrata 中分离出来的，具有在肠道中存活的能力。然而，部分E. prostrata内生菌不能在实验室中分离出来，也不能通过16S测序检测，这限制了E. prostrata内生菌对转基因药效的研究。

与中药内生真菌相比，中药内生菌的研究较少。内生菌产生的代谢物，尤其是抗菌物质，可以抑制病原体的生长，调节肠道疾病 [ 21 ] [ 22 ]。据报道，抗菌药物有助于微生物群诱导的肥胖和代谢疾病易感性 [ 23 ]。胃肠道感染是人类健康的一个主要问题，但抗生素会对转基因产生有害影响 [ 24 ]。因此，产生内生菌的抗菌剂的抗感染作用是一种有希望的抗生素替代品，特别是对于不允许使用其他方法的特殊情况（例如，孕妇）[ 25]。本研究中分离的芽孢杆菌、乳球菌和微小杆菌是抗菌物质的主要生产者。乳酸菌 (LAB) 是一组可以产生细菌素的微生物，细菌素是蛋白质类抗菌分子。根据 Alvarez-Sieiro 等人 [ 26 ] 的研究，在 13 个乳球菌菌株的基因组中鉴定了 3 种羊毛肽、7 种糖肽、1 个 LAP、20 个 ii 类和 1 个 iii 类的假定细菌素基因簇。此外，在四个 Exiguobacterium 菌株的基因组中鉴定了两个 iii 类推定的细菌素基因簇。已知和推定的细菌素、非核糖体合成肽 (NRP)、聚酮化合物 (PK) 和其他抗菌剂的基因簇也广泛分布在各种芽孢杆菌基因组中 [ 27]。

益生菌是功能性食品中增长最快的消费品之一，因为它们通过转基因有益于人类健康 [ 28 ]。从食用中草药中分离出的内生菌可以在肠道定植，这意味着它具有发展成益生菌的潜力[ 29 ]。因此，中药材内生菌的研究与应用具有广阔的前景。此外，内生菌与中草药的相互作用仍有待研究。

近年来，生态环境遭到严重破坏，药用植物被掠夺性利用，许多野生珍贵药用植物难以引种栽培，导致天然药用资源严重短缺，有效成分含量偏低。可能的原因之一是缺乏内生菌，这些内生菌有助于形成如此丰富的次生代谢物以满足人类的需求 [ 30 ]。虽然内生菌的研究已经引起人们的关注 20 年，但内生菌在中药中的应用并没有引起太多关注 [ 31 ] [ 32 ]]。内生菌与中医药的研究相结合，特别是在解决资源问题方面，具有很大的经济和理论价值。

5. 结论

综上所述，E. prostrata 植物富含内生菌，主要包括乳球菌和芽孢杆菌，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有很强的抗菌活性，并具有在胃肠道中生存的能力。E. prostrata 提取物改善了微生物区系的多样性，特别是显着增加了 Lactococcus 的丰度，表明内生菌 Lactococcus 有助于 E. prostrata 调节 GM。

资金信息

天津市教委科研项目（2017KJ142）资助。

致谢

我们感谢韩立峰博士和张丽娟教授的化学和技术贡献，并感谢郑胡先生在本研究期间对测序的帮助。赵鑫获得天津中医药大学“双一流”建设专项资金支持。

道德声明

本研究严格按照国家科技部发布的《实验动物护理和使用指导意见》中的建议进行。该方案经天津中医药大学实验动物伦理委员会批准（许可证号：TCM-LAEC20180028）。

补充资料 S1

>EP01

GGATTAGCTAGAGCTAGACATGATAGTCGAGCGACGAATCGAGGTACTTGTACCAAGATGAAGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACGCGTGGGAAATCTGCCGAGTAGCGGGGGACAACGTTTGGAAACGAACGCTAATACCGCATAACAATGGGAATCGCATGATTCTTATTTAAAAGAAGCAAAAGCTTCACTACTTGATGATCCCGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTAGTGTAAAGGACTACCAAGGCGATGATACATAGCCGGCCTGAGAGGGTGAACGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGAGAAGAACGTTAAGTAGAGTGGAAAGTTACTTAAGTGACGGTATCTAACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTCCCGAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTAAAAGGCAGTGGCTCAACCATTGTGTGCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGGAGAGGGGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCGGAGGCGAAAGCGGCTCTCTGGCCTGTAACTGACACTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGCTGTAGGGAGCTATAAGTTCTCTGTAGCGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCGATGCAATCCTTAGAGATAAGGAGTTACTTCGGTACATCGGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTACTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAGTGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGTGGTACAACGAGTCGCCAACCCGCGAGGGTGCGCTAATCTCTTAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGGAAGTTGGGAGTACCCAAAGTAGGTTGCCTAACCGCAAGGAGGGAGGTCATCATAGAGTAGAGGGCGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGTGGTACAACGAGTCGCCAACCCGCGAGGGTGCGCTAATCTCTTAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGGAAGTTGGGAGTACCCAAAGTAGGTTGCCTAACCGCAAGGAGGGAGGTCATCATAGAGTAGAGGGCGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGTGGTACAACGAGTCGCCAACCCGCGAGGGTGCGCTAATCTCTTAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGGAAGTTGGGAGTACCCAAAGTAGGTTGCCTAACCGCAAGGAGGGAGGTCATCATAGAGTAGAGGGC

>EP02

GCAAGTCGTACGCTTCTTTTTCCACCGGAGCTTGCTCCACCGGAAAAAGAGGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATCAGAAGGGGATAACACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGTATAACAATCGAAACCGCATGGTTTTGATTTGAAAGGCGCTTTCGGGTGTCGCTGATGGATGGACCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCCACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGAGAAGAACAAGGATGAGAGTAACTGTTCATCCCTTGACGGTATCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTTTGACCACTCTAGAGATAGAGCTTCCCCTTCGGGGGCAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTGTTAGTTGCCATCATTCAGTTGGGCACTCTAGCAAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGAAGTACAACGAGTTGCGAAGTCGCGAGGCTAAGCTAATCTCTTAAAGCTTCTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGATAGATGATTGGGGGAAGTCGAACAACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGAAGTACAACGAGTTGCGAAGTCGCGAGGCTAAGCTAATCTCTTAAAGCTTCTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGATAGATGATTGGGGGAAGTCGAACAACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGAAGTACAACGAGTTGCGAAGTCGCGAGGCTAAGCTAATCTCTTAAAGCTTCTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGATAGATGATTGGGGGAAGTCGAACA

>EP03

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>EP04

TGGGGGTGCTATACATGCAGTCGAGCGAACTGATTAGAAGCTTGCTTCTATGACGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTTCGGGAAACCGAAGCTAATACCGGATAGGATCTTCTCCTTCATGGGAGATGATTGAAAGATGGTTTCGGCTATCACTTACAGATGGGCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACGAGAGTAACTGCTCGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGAAAAGCGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTTTTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACTCTAGAGATAGAGCGTTCCCCTTCGGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAAAGGGCTGCAAGACCGCGAGGTCAAGCCAATCCCATAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGAGTAACCGTAAGGAGCTAGCCGCCTAAGTGACAGAGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAAAGGGCTGCAAGACCGCGAGGTCAAGCCAATCCCATAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGACGAACACCGCCCGTCACACCCGGAGGTTTGTAACACCGAGATAGCCGGTAGGTAGTAACACCGAGATAGCCGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAAAGGGCTGCAAGACCGCGAGGTCAAGCCAATCCCATAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGACGAACACCGCCCGTCACACCCGGAGGTTTGTAACACCGAGATAGCCGGTAGGTAGTAACACCGAGATAGCC

>EP05

GGTGCTATACATGCAGTCGAGCGCAGGAAACTGACGGAACTCTTCGGAGGGAAGGCAGTGGAATGAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAAGGAACCTGCCTCAAGGATTGGGATAACTCCGAGAAATCGGAGCTAATACCGGATAGTTCAACGGACCGCATGGTCCGCTGATGAAAGGCGCTTCGGCGTCACCTTGAGATGGCCTTGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAACGGCCCACCAAGGCGACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTAAGGGAAGAACACGTACGAGAGGAAATGCTCGTACCTTGACGGTACCTTACGAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGCCTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGCCATTGGAAACTGGAAGGCTTGAGTACAGAAGAGAAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTTTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTGGGGGGTTTCCGCCCCTCAGTGCTGAAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAACTCTTGACATCCCATTGACCGCTTGAGAGATCAAGTTTTCCCTTCGGGGACAATGGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATCCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAGGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGAGTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGGGCAGCGAGACCGCGAGGTGGAGCCAATCCCATAAAGCCGTTCCCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCAGGTCAGCATACTGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGCAACACCCGAAGCCGGTGAGGTAACCGCAAGGAGCCAGCCGTCGAAGTGGGAGATTTAGGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGAGTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGGGCAGCGAGACCGCGAGGTGGAGCCAATCCCATAAAGCCGTTCCCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCAGGTCAGCATACTGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGCAACACCCGAAGCCGGTGAGGTAACCGCAAGGAGCCAGCCGTCGAAGTGGGAGATTTAGGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGAGTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGGGCAGCGAGACCGCGAGGTGGAGCCAATCCCATAAAGCCGTTCCCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCAGGTCAGCATACTGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGCAACACCCGAAGCCGGTGAGGTAACCGCAAGGAGCCAGCCGTCGAAGTGGGAGATTT

>EP06

GAGCTATACATGCAAGTCGAGCGGACAGAAGGGAGCTTGCTCCCGGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAGTTCCTTGAACCGCATGGTTCAAGGATGAAAGACGGTTTCGGCTGTCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCAAGAGTAACTGCTTGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTTCCCTTCGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCTGCGAGACCGCAAGGTTTAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGCAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGTGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCTGCGAGACCGCAAGGTTTAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGTTTGCAACACCCGAGGCCCGGTAGGCTGGGTAACCGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCTGCGAGACCGCAAGGTTTAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGTTTGCAACACCCGAGGCCCGGTAGGCTGGGTAACC

>EP07

GTTTGCCCGCTACAGTAGAGATGATCGTGGCTCAGGAAGTCATAACAGCTGTGAACCACGGGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGGATCTGCCCGATAGAGGGGGATAACCACTGGAAACGGTGGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTCACTATCGGATGAACCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGCGGGGTAATGGCCCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGCGGTGCGGTTAATAACCGCGCCGATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGAACTGCATTTGAAACTGGCAGGCTTGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTTCCCTTGAGGAGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCACGGAATTCGGCAGAGATGCCTCAGTGCCTTCGGGAACCGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGATTCGGTCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCACAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATCGGAGTCTGCAACTCGACTCCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAATAAGTAAGTACGGTAGCTTAACCTGTGGGAGCGCAGCTAACCATAGAGGAAATGGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCACAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATCGGAGTCTGCAACTCGACTCCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAATAAGTAAGTACGGTAGCTTAACCTGTGGGAGCGCAGCTAACCATAGAGGAAATGGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCACAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATCGGAGTCTGCAACTCGACTCCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAATAAGTAAGTACGGTAGCTTAACCTGTGGGAGCGCAGCTAACCATAGAGGAAATGGC

>EP08

TGCAGTCGAGCGAACTGATTAGAAGCTTGCTTCTATGACGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTTCGGGAAACCGAAGCTAATACCGGATAGGATCTTCTCCTTCATGGGAGATGATTGAAAGATGGTTTCGGCTATCACTTACAGATGGGCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACGAGAGTAACTGCTCGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGAAAAGCGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTTTTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACTCTAGAGATAGAGCGTTCCCCTTCGGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAAAGGGCTGCAAGACCGCGAGGTCAAGCCAATCCCATAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGAGTAACCGTAAGGAGCTAGCCGCCTAAGCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAAAGGGCTGCAAGACCGCGAGGTCAAGCCAATCCCATAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGAGTAACCGTAGAGGAGCTAGCCGCCTACATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAAAGGGCTGCAAGACCGCGAGGTCAAGCCAATCCCATAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGAGTAACCGTAGAGGAGCTAGCCGCCTA

>EP09

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利益冲突

作者声明与本文的发表没有利益冲突。

参考

[ 1 ] Chang, CJ, Lin, CS, Lu, CC, Martel, J., Ko, YF, Ojcius, DM, Tseng, SF, Wu, TR, Chen, YM, Young, JD 和 Lai, HC (2015) 灵芝减少通过调节肠道微生物群的组成导致小鼠肥胖。自然通讯，6，7489。

[ 2 ] Xu, J.、Chen, HB 和 Li, SL (2017) 了解草药与肠道微生物群之间相互作用的分子机制。医学研究评论，37, 1140-1185。

[ 3 ] El-Deeb, B.、Fayez, K. 和 Gherbawy, Y.（2013 年）沙特阿拉伯沙漠 Plectranthus Tenuiflorus 药用植物中内生细菌的分离和表征及其抗菌活性。植物相互作用杂志, 8, 56-64,

[ 4 ] Zhang, L., Chen, Y., Wang, X., Xie, X., Li, Y. and Jin, Z. (2018) 三七内生细菌的生长促进功能。大连理工大学学报，4。

[ 5 ] Brader, G.、Compant, S.、Mitter, B.、Trognitz, F. 和 Sessitsch, A. (2014) 内生细菌的代谢潜力。生物技术的当前观点，27, 30-37。

[ 6 ] 黄，JY，张，CJ，姚，YL，等。(2017) 内生菌抗菌物质研究进展。中国生物技术杂志, 33, 178-186.

[ 7 ] Kusari, S. 和 Spiteller, M. (2011) 我们准备好利用内生菌进行生物活性植物次生代谢物的工业生产了吗？天然产物报告，28，1203-1207。

[ 8 ] Zhao, LX, Xu, LH and Jiang, CL (2012) 中药植物内生微生物的研究方法。酶学方法，517，3-21。

[ 9 ] Marquez-Santacruz, HA, Hernandez-Leon, R., Orozco-Mosqueda, MC, Velazquez-Sepulveda, I. 和 Santoyo, G. (2010) 墨西哥果壳番茄植物根部细菌内生菌的多样性（酸浆）及其根际检测。遗传学和分子研究，9，2372-2380。

[ 10 ] Burdman, S.、Jurkevitch, E. 和 Okon, Y. (2000) 在农业中使用促进植物生长的根际细菌 (PGPR) 的最新进展。在：Subba Rao, NS 和 Dommergues, YR, Eds., Microbial Interactions in Agriculture and Forestry, Science Publishers Inc, Calicut, India, 229-250。