石川子宫内膜培养物中的不透明多倍体细胞能够形成巨线粒体

摘要：能够形成巨线粒体的不透明多倍体细胞是Ishikawa 子宫内膜上皮细胞集落的一个恒定特征，约占细胞的5 % - 10%。不透明细胞似乎通过膜延伸与其他不透明细胞通讯，并通过细胞外囊泡与集落中的其他细胞通讯。不透明细胞首先形成为矩形结构，略大于周围的单层细胞。细胞最终会聚集起来，在菌落中停留 20 小时或更长时间，然后再分离。石川不透明细胞最不常见的特征是它们形成线粒体核子的能力，即围绕聚集染色质的巨型线粒体。这个 论文回顾了导致巨线粒体适应的证据，包括氧化磷酸化能力的丧失，使适应的巨线粒体依赖于代谢，如还原羧化。

关键词

线粒体 核,巨线粒体,不透明多倍体细胞,膜延伸,细胞外囊泡,还原性羧化,内源性生物素,缺氧

一、简介

尽管假设培养的单层细胞大部分是相同的，并且细胞仅在死亡时才从单层分离，但通过更仔细地检查在单层培养中及以上常规发现的少数特殊细胞，已经有了发现。刘劲松博士的实验室 [ 1 ] 一直在研究在卵巢和其他癌细胞系中发现的称为多倍体巨细胞 (PGCC) 的细胞类型 [ 2 ] [ 3 ]。巨细胞可以通过非对称分裂等无丝分裂方式增殖。在石川子宫内膜细胞系中发现的被描述为不透明的多倍体细胞 [ 4 ] 也能够萌出新的“正常”细胞。

Liu 博士及其同事对 CoCl 2刺激形成的 PGCC 进行了表征，证明巨细胞表达癌症干细胞标志物以及正常细胞特征性的标志物。此外，研究人员表明，在长期培养中，通过适当添加培养基，PGCC 可以分化成脂肪、软骨和骨骼 [ 1 ]，随后的论文 [ 5 ]中的结果扩大了分化的潜力。源自单个 PGCC 的球体可以长成广泛的人类肿瘤，包括生殖细胞肿瘤、高级别和低级别癌以及良性组织，导致这些研究人员认为 PGCC 是癌症干细胞和卵裂球的体细胞等价物。

2011 年，Chaffer 及其同事 [ 6 ] 将注意力集中在漂浮在单层上方的细胞上，而不是紧贴在培养皿上，他们提供了令人信服的数据，证明该群体富含干细胞。他们继续证明，分化的乳腺上皮细胞可以在培养中以随机方式转化为干细胞样状态。

本文还报道了在 1985 年 M. Nishida 博士的实验室最初分离的 Ishikawa 子宫内膜上皮细胞系中观察到的具有明显重要性的小细胞群 [ 7 ]。该细胞系能够形成分离细胞的半球，在汇合的单层中的流体储库上拱起。一旦利用了该过程的常规诱导 [ 8 ]，就可以研究 20 到 24 小时的结构变化分化，包括随着石川细胞的合胞体形成半球而提高生物素水平所起的作用 [ 9 ] [ 10 ] [ 11]。通常作为“失败”对照观察到的内源性生物素水平升高引起了人们对这种羧化酶辅助因子的重要性的兴趣和/或警告它的存在可能会导致使用生物素化抗体检测特定蛋白质的测定中的混乱[ 12]。内源性生物素成为 Ishikawa 分化研究中的一个重要因素，它解释了在与亲和素过氧化物酶和 3-氨基-9-乙基咔唑 (AEC) 作为底物孵育后，合胞体中的大球形巨线粒体染成鲜红色。在 Ishikawa 细胞中，观察到线粒体融合在聚集的染色质周围，形成线粒体核子，这是一个巨大的瞬时细胞器，对生物素进行深色染色。随后，在不透明细胞中也检测到内源性生物素，可以观察到这些细胞从菌落中脱离并形成空心球体 [ 13 ]。正如我们的研究早期所证明的那样 [ 14 ]，内源性生物素与线粒体羧化酶结合，在圆顶分化过程中，线粒体羧化酶的浓度随着线粒体生物发生的增加而增加。

正如将要讨论的，携带细胞外囊泡的膜延伸似乎是导致形成巨大不透明细胞的过程的一部分。像许多其他细胞系一样，石川细胞能够在各种情况下形成膜延伸，包括在适应培养基变化的细胞中：转移到无血清培养基中的单层细胞或在转移到含血清培养基中的无血清培养基中形成的聚集球体[ 15]。本文研究的单层培养物没有受到同样的压力，而是呈对数增长。观察到细胞外囊泡向上延伸到集落到形成第二个巨细胞的区域，这是一个有趣的间接证据，即巨细胞可能通过输出的物质诱导形成额外的巨细胞。最终巨大的不透明细胞分离 [ 13 ] 并可以迁移到培养皿的其他区域并开始新的菌落。这可能是细胞等分试样达到汇合时发生的增殖过程的一部分，这是成功细胞培养的常规事件。

为了研究典型 Ishikawa 培养物中不透明细胞的起源，我们开始一次跟踪培养数小时，希望能够捕捉到从典型单层细胞形成不透明细胞的过程。找到其中形成不透明细胞的培养物，在整个过程中每隔 20 小时拍摄显微照片（图 3-7）。结果表明，在该时期的大部分时间都可以检测到结构变化。在观察开始时最初存在的不透明圆形细胞在观察期间经历从集落脱离的过程。Ishikawa 培养物中的巨大不透明细胞是特殊的，特别是它们能够形成一个或多个线粒体核。将根据与其他巨型线粒体共有的特殊性和特征来讨论线粒体核子。

2. 结果

石川子宫内膜单层主要由典型的上皮细胞组成，通常由一到两个可见的细胞核为主，并与相邻的细胞像马赛克一样贴合在一起。但不透明且明显的多倍体细胞始终存在于培养物中，有时以 2 或 3 个为一组。不透明细胞约占单层细胞的 5% - 10%，并通过大小、形状（圆形而不是扁平）来区分，大量细胞膜的存在，并且经常但不总是存在如图 1 所示的尾随过程。如图 1和图 2中的光学显微照片所示，线粒体核子在此类细胞的中心形成，内源性生物素染色明亮。这些巨细胞可以分离并形成空心球体[13 ] 如果添加新鲜血清，则能够迁移并重新附着在培养皿上的其他地方，或者保留为空心球体并变成多细胞 [ 16 ]。

图 2显示含有线粒体核的放大细胞能够通过延伸穿过

图 1。含有线粒体核的巨型多倍体细胞可以从汇合的单层分离。在分离之前，这些细胞的特征是由延伸回菌落的细胞外过程组成的延伸。在这张显微照片中，细胞中心似乎有三个线粒体核子，并且两个过程中出现了多个细胞外囊泡。巴 = 50 微米。

图 2。包含多个线粒体核子的两个细胞似乎通过在它们之间延伸的细胞过程交换物质。巴 = 50 微米。

殖民地。扩大的交流结构似乎包含多个线粒体核子。

图 3-7 是在培养皿中以单层形式增殖的典型 Ishikawa 细胞集落的显微照片。对集落进行 20 小时的跟踪以表征不透明细胞与周围单层细胞相比的行为。在显微照片中对细胞进行了编号，以便于随着时间的推移比较菌落。不透明细胞#3 凭借大小和形状在菌落中占主导地位，“发光”，细胞膜比相邻单层细胞几乎无法检测到的细胞膜更坚固。两个外泌体装饰的突起从这个不透明的细胞延伸出来，较长的突起在穿过细胞质褶皱时深入到菌落中。材料的污迹似乎定义了该过程的最远范围，尽管可以预期来自囊泡的材料扩散到该点之外。在接下来的 18 小时内，将在位置 7 和 10 检测到变化。

如果一个典型的单层细胞是第二个巨细胞分化的起点，那么在我们观察开始时就无法检测到该细胞（图3）。也许将单层细胞转变为扩大的不透明细胞的过程始于充分的解构，以使原始单层细胞的轮廓在某些时候无法检测到。然而，仅 2 小时后，在标有“10”的区域中很快就会出现可辨别的结构。它由大量膜形成的光环和类似于分化结构中心的条纹的东西支配。像这样的从头形成，连同不对称分裂[ 5]，可以解释尽管它们有游走的倾向，但能够形成线粒体核的增大的不透明单细胞如何在培养的石川上皮细胞中作为一个相对恒定的群体持续存在。

在观察开始时的图 3中，在菌落的左上部分明显有一个正在进行有丝分裂的细胞。值得一提的是，在对数生长的培养物中，在整个 20 小时的观察中没有观察到更多的有丝分裂图，尽管经过数十年的细胞培养检查，我承认通常对有丝分裂图的表现感到不知所措，甚至

图 3。集落下边缘的单个不透明细胞。由来自巨细胞#3 两端的囊泡组成的延伸。两者中较长的一个，携带超过 10 个囊泡，通过细胞质褶边靠近细胞 #4 和 #5，在培养间隙左侧的细胞 #8 和右侧的细胞 #9 结束差距。第二个更短的延伸从不透明细胞的右侧出现，结束于细胞#1 的细胞质褶边。#2 单元格在 #3 号单元格的左侧和上方大约 350 微米。由 #6、#8 和 #9 细胞定义的区域 10 是新巨细胞发育的地方。随着时间的推移，位置 7 处的单层细​​胞将变得更加清晰。Bar = 50 微米。

在日志增长期间。造成这种情况的部分原因可能在于过去 20 年左右描述的其他扩散模式的证据。已经发表的论文描述了通过有丝分裂以外的过程来增殖滋养层和人类癌细胞。这些过程的一些名称包括：萌芽 [ 17 ] [ 18 ]、爆发 [ 1 ]、去多倍体化 [ 19 ] [ 20 ] 和新生 [ 21 ]。在石川细胞中也观察到了有时被称为不对称分裂的例子，实际上似乎有一个细胞在不透明细胞分离前不久从#3 巨细胞中出芽的例子（图 5 ）。

关于有丝分裂增殖的大部分已知信息来自破坏有丝分裂周期的实验。正如一些癌症在化疗后复发一样，经过治疗的癌细胞不一定都会在体外被化疗药物杀死。使用紫杉醇，一种有效的化学治疗剂，刘和他的同事毒害卵巢癌细胞 [ 5 ]。大多数细胞死亡，但少数存活的细胞通过 DNA 内复制成为多倍体巨细胞。这些 PGCC 能够通过“核出芽、核分裂或核裂变然后细胞分裂”来无丝分裂产生细胞 [ 5]。将实验更进一步，研究人员对存活细胞进行了核型分析，发现了多种染色体重排，包括缺失和易位，以及染色体数量低于亲代细胞。作者提供的证据表明，子细胞在单个巨细胞周期后获得具有大量基因组改变的新核型，并且核型不是静态的。它们随着时间的推移而变化，表明正在进行的“编辑”过程正在解决至少一些由有丝分裂增殖引起的变异性 [ 5]。在这项研究的基础上，刘博士和他的同事们提出了一个巨细胞周期，其中包括多倍体巨细胞的无丝分裂生殖行为，并观察到由于编辑过程和不对称分裂，一些子代细胞可以螺旋回到典型的有丝分裂周期 [ 22 ] [ 23 ]。

两小时后，除了图 3中观察到的有丝分裂完成外，图 4中的显微照片显示了在位置 10 形成的大结构的轮廓。值得注意的一些变化包括发育结构和周围单层之间的分界编号为 6、8 和 9 的细胞，以及在位置 7 出现的类似单层细胞的结构。在发育中的细胞 #10 的内部可以观察到类似于在发育中的巨线粒体 [ 25 ] 中观察到的晶体结构的东西.

细胞外囊泡有些模糊（图 4），表明包装材料正在渗入菌落。在过去的十年中，人们对细胞外囊泡的兴趣开始升温，这可能是因为有证据表明它们可能与癌症有关 [ 26 ] - [ 34 ]。仅从文献样本来看，装饰从 3 号细胞延伸到菌落中间的延伸部分的十几个水泡包可能含有蛋白质、RNA、DNA、脂质或以上所有物质。一个实验室的工作表明，细胞外囊泡参与了癌症致病成分的转移，特别是微 RNA [ 35 ]。这显然是一个有趣的可能性，虽然完全是推测性的，

图 4。观察开始两小时后，仍可在从细胞#3延伸的突起上检测到细胞外囊泡。一些囊泡似乎正在扩散。最显着的变化发生在指定为#10 的地区。该区域大约是周围细胞的两倍大，并且大部分在 2 小时后由与不透明细胞 #3 周围的轮廓相似的边界限定，这是相差显微照片的特征。巴 = 50 微米。

3 号细胞输出的囊泡中物质的水平转移可能与位置 10 的第二个不透明球形细胞的分化有关。正如本文引言中所讨论的，“干性”的质量非常重要似乎从一个细胞传递到另一个细胞 [ 6 ]，关于形成多倍体不透明细胞和线粒体核的能力也是如此。

扩大的不透明细胞通常会脱离并形成漂浮的球体 [ 13 ]。然后它们可以在距原始菌落一定距离处重新附着，类似于癌症转移中涉及的 EMT 过程。由于他对细胞外囊泡的实验，[ 36 ] Gopal 及其同事认为，经历 EMT 过程的细胞，就像细胞 #3 的情况一样（图 3-7），在细胞外的蛋白质和 RNA 含量方面被重新编程。囊泡。显而易见的问题是该材料是否会导致第二个细胞（即细胞“10”）的诱导，该细胞变得能够形成线粒体核子并分离。

再过 4 小时后（图 5），图 3和图 4中观察到的较小延伸消失了，3 号巨细胞的中心出现了一个芽，细胞质褶皱正在缩小，10 号细胞继续填写。

图 6中的显微照片显示了 12 小时后的菌落。10 号单元格已四舍五入。不再可能观察到细胞 #3 和 #10 之间的离散囊泡，并且延伸通过的细胞质褶边具有

图 5。观察开始八小时后，从细胞#3 向细胞#1 延伸的细胞外囊泡随着较短的延伸大部分消失。较长延伸部分上的囊泡继续扩散或扩散。单元#8 上方的矩形区域已被进一步定义。与这些变化同时，矩形结构右侧的间隙消失了。巴 = 50 微米。

图 6。观察开始后十二小时。巨细胞#10 完全形成。从 3 号细胞向右延伸的细胞质褶皱消失了。从细胞#3 到细胞#7 的管道现在看起来更像是一种“管道”，而不是图 3-5 中的细胞外囊泡延伸。巴 = 50 微米。

进一步收缩。类似材料流之类的东西似乎正在退出 3 号牢房。

在 t = 20 小时的最终观察中（图 7），很明显，不透明的圆形结构 #3 已从板上抬起，并带有一个可见的延伸

图 7。观察开始后二十小时。细胞#3 已从培养皿中释放出来，尽管它继续通过至少一个延伸被拴在菌落上。分离的证据包括单个可见扩展的缩短外观。如图 6 所示，细胞 #3 似乎漂浮在细胞 #4 和 5 上方，直到 20 小时都清晰可见。最后，细胞 1 和 3 之间的表观距离“加长”，细胞 3 之间的表观距离10 已经“缩短”了。巴 = 50 微米。

回到殖民地。将显微镜的焦点放在单层上，可以检测到不透明的细胞 #3 悬停在细胞 #4 和 #5 上方。仍然将其连接到单层的延伸部分似乎缩短了，细胞 1 和细胞 3 之间以及细胞 3 和细胞 10 之间的关系发生了变化，只能通过细胞#3 的向上运动来解释。正如在之前的论文 [ 13 ]中已经讨论过的，这种“行为”与巨细胞中发展的线粒体核内中心气态液泡的发展相一致。

最初是对石川培养物中圆形不透明细胞的观察，最终提供了有关囊泡装饰膜延伸的信息。细胞外囊泡位于光学显微镜容易检测到的边缘。虽然在过去几年中对细胞外囊泡含量的分析越来越多，但对细胞培养物中细胞外囊泡命运的扩展观察远不常见。一个短暂而短暂的延伸，50 微米长，带有三个或四个细胞外囊泡，结束于围绕细胞 #1 的集落边缘的一大片细胞质。第二个过程要长 4 到 5 倍，穿过菌落边缘的细胞质褶边，“携带”大约十几个细胞外囊泡。到 8 小时后，较小的延伸完全消失了，似乎被细胞#1周围的细胞质吸收，没有任何明显的效果。第二个扩展也正在消失。它所通过的胞质溶胶褶皱已显着收缩，留下看起来更像一条“管道”，类似于将两个巨细胞与线粒体核子连接起来的结构。图 2。光学系统已经从离散的水泡包变成了看起来像物质从 3 号巨细胞流出到 7 号和 10 号细胞附近的集落区域的东西。到 20 小时时，很明显 3 号细胞已经分离并且在位置 10 处形成了一个新的不透明单元。如 [ 13 ] 所述，分离单元的潜力是形成一个空心球体，可以漂浮到新的位置重新附着。如果不发生重新附着，则染色质从空心球体细胞质边缘的巨核流出，会产生多细胞球体 [ 16 ]。通过比较图 6和图 7可以观察到最明显的分离证据. 从 #3 电池到 #10 电池的表观距离从 260 微米减小到 192 微米，而从 #1 电池到 #3 电池的表观距离从 138 微米增加到 195 微米。

3. 讨论

3.1。线粒体核子

在刺激圆顶（充满液体的半球）形成的强加条件后数小时内，首次在石川细胞中以规则的时间间隔在整个上皮单层中观察到线粒体核子[ 8 ]。混合和瞬时的线粒体核子是由多个线粒体在合胞体中聚集的核周围融合形成的 [ 9 ]。三个或四个线粒体核子在一个合胞体中形成，充满气体，然后分别升高，以便在短时间内，它们在“扩张”的合胞体顶膜中产生多个突起，该顶膜很可能包括与巨型线粒体相关的内质网膜，在诸如子宫内膜 [ 37 ]、肾上腺皮质 [ 38 ] 等组织中观察到的关联] 和人类肝细胞 [ 25 ]。

小气泡在有丝核子内聚集核的染色质内形成。该气泡中的至少一种气体可能是一氧化氮，一种气态神经递质，已被证明会在低温下极度受压的细胞核中形成致命气泡 [ 39 ]。在线粒体内，气泡不会导致细胞死亡，但会产生一个被称为“光学透明”核的图像，这是在怀孕期间在癌组织或子宫内膜中观察到的结构 [ 9 ] [ 40]。气态神经递质可以激活可能导致后来 DNA 片段化的酶。染色质聚集体在一个单独的隔室中逐渐压缩，靠着展开的合胞体顶膜，因为在融合线粒体产生的结构内形成更大的液泡 [ 9 ]。每个线粒体核液泡，连同上升到顶膜的染色质团，形成一个看起来像“印戒”的结构，这是另一种经常与切片活检癌组织相关的结构。我们的研究结果表明，这些细胞代表了由线粒体活动带来的两个不同阶段。

压力和活化酶的某种组合和/或 pH 值的变化会爆炸性地使染色质和 DNA 细丝从膜突起滑出回到共同的结构中，随着破裂的线粒体核子的消退，在整个合胞体中形成一个阵列 [ 10 ]。这样的阵列将片段化的 DNA 打开到被认为参与分化的各种表观遗传改变 [ 41 ]。在一段时间内，细胞质和细胞核之间的基本区别消失了。染色质碎片相对快速地重新结合形成不规则的团块，圆顶细胞的细胞核从中出现，在现在的顶端和基底合胞膜的包膜中排列成一层，在积聚的液体上升高。

这种核扩散过程比结果部分已经讨论的无丝分裂过程更具争议性。在圆顶形成中，细胞核是从大量重新结合的染色质中“产生”的 [ 11 ]。类似地，解构的染色质可以流过空心球体 [ 17 ] 和膜延伸 [ 15 ]]。穿过空心球体外壳的染色质碎片流看起来像篮球的接缝。很难预测这些流在固定切片组织中的外观。当然，充气球体会塌陷。自从最早观察到“爆炸”染色质以来，我们推测蛋白质和 DNA 的结合和分散可能与近 50 年来在哺乳动物所有类别的组织中观察到的“核包膜受限染色质”神秘结构有共同之处 [ 42 ] [ 43 ]年。

染色质流具有与巨细胞所述的出芽和破裂的无丝分裂过程相关的所有问题，以及一旦物质结合成细胞核，必须将碎片染色体重新缝合在一起所引入的“复杂性”。究竟是什么保证了后代细胞包含与亲本基因组相同的遗传物质和染色体结构的互补物？答案可能是他们没有，但有一个“编辑”过程可以纠正出现的足够多的问题，以便细胞能够发挥作用。研究已经积累了一段时间，表明来自肿瘤和癌细胞系的细胞通常比典型的非癌细胞含有更多或更少的染色体，这种情况被称为非整倍性 [ 44]。染色体碎片化时的另一个问题（如用化学治疗剂处理的细胞系中所示）是存活细胞的核型显示出 Heng 及其同事所称的“基因组混乱”[ 45 ]。对于相信有丝分裂遗传的染色体互补是后代成功的绝对“必要条件”的细胞生物学家来说，这是不可预测的，这些研究人员表明，即使基因组混乱，一些细胞也能存活。当基因组每天进行核型分析超过一周时，正如 Liu 及其同事在这篇论文中所做的那样 [ 45]，观察到显着变化。第 1 天测量片段化的峰值。基因组混乱在第 2 天和第 3 天之间达到峰值。“正常”基因组占第 5 天测量值的 50%，在第 8 天达到峰值。典型实验中大约 0.1% 的细胞存活而且，正如作者所描述的，一些稳定的克隆种群将在几周后从动态重组的基因组中产生。所有这些都表明存在一个持续的编辑过程，它能够为混乱的基因组带来足够的秩序，使其再次能够有丝分裂，但可能仍然与祖细胞的基因组不同（进化生物学家可能会发现所有这相当令人兴奋，细胞生物学家不那么兴奋）。持续有效的基因组编辑和少量细胞的最终存活使得染色质流式无丝分裂在某些情况下更容易接受，并且有优势。这是一个可以在很短的时间内产生数十个“新”细胞的过程，因此染色质流可能代表多个终末分化细胞增殖的能量和时间效率模式。15 ]。

在线粒体核子依赖性分化的第二个例子中，一个或多个线粒体核子在单个多核单层上皮细胞的中心形成。含有线粒体的细胞从集落中的相邻细胞中分离出来，然后从基质中分离出来，漂浮到单层上方的介质中，形成一个空心球体 [ 13 ]。巨大的气泡在内线粒体膜内形成，将包括多倍体核在内的细胞内容物推入线粒体外膜和细胞膜之间的细胞质边缘[ 13]。空心球体是可移动的，可以重新附着在培养皿上的其他地方，释放气泡并成为单层生长的场所，这一过程唤起了与癌症转移有关的上皮间质转化 (EMT) 的周期性。在培养皿中，这可能是细胞增殖形成融合单层的机制之一。如果球体没有重新附着，即向培养基中添加血清的功能，多倍体单细胞球体可以变成多细胞的 [ 16 ]，它是通过染色质流过细胞质壳来实现的。总的来说，这个过程会导致细胞“移动”，这是一种具有重要功能的能力，例如伤口愈合，但它可能像高度转移性癌症一样是灾难性的。

本文旨在阐明能够形成线粒体核的不透明细胞分化的最早阶段，并提出关于能形成各种大小的气泡的线粒体核的代谢性质的理论 [ 9 ]；有些像圆顶形成那样迅速分崩离析，有些则具有独立存在的能力，就像最近描述的多个球体的蜂巢一样[ 16 ]。

3.2. 巨线粒体

线粒体核子似乎是被 Tadeo Wakabayashi 在广泛评论中称为巨型线粒体的细胞器的一个子集 [ 24 ]。他总结了他和其他实验室的工作，参考了 50 多年关于超大线粒体的实验文献，并编目了 100 多个在患病或正常组织中观察到的巨线粒体，这些观察是由运动和激素实验诱导的，或者是由药物甚至毒素引起的。行政。大量的观察结果，包括健康细胞而不是垂死细胞中的巨线粒体的例子，表明巨线粒体不仅仅是受损的细胞器，正如有时所假设的那样。Wakabayashi 发表的电子显微照片 [ 24] 证明巨线粒体的内部结构与好氧生物中参与氧化磷酸化的“典型”线粒体有很大不同。虽然巨线粒体的功能似乎是多种多样的，但 Wakabayashi 强调当线粒体电子传递系统发生故障时，这些适应的细胞器在重建体内平衡中的作用，这表明细胞器正在适应中和活性氧和/或游离分解产生的电子。这种机制可能有助于解释在许多不同类型的患病组织中存在巨线粒体：它们可能是疾病状态的结果，而不是疾病的原因。

巨型线粒体的知识至少可以追溯到 1883 年，正如 Charles Bowen [ 46 ] 在一篇关于当时称为 nebenkern（巨型球形线粒体）的论文中所引用的那样。此外，早期研究人员在活精子细胞中追踪 nebenkern 形成后认识到，巨线粒体是与尾巴伸长有关的瞬时细胞器。精子细胞中的巨大线粒体与微管一起组织细胞骨架动力学，负责将精子细胞尾部从 7 微米伸长到近 2 厘米 [ 47 ] [ 48 ]。鉴于线粒体的体积被保留而其表面积扩大，内质网很可能参与了这一过程。

电子显微镜为了解巨线粒体结构提供了一个窗口，但由于它们的大小，通常必须采用连续切片和模型构建来获得完整的图片 [ 49 ]。子宫内膜上皮细胞研究人员特别感兴趣的是，巨线粒体作为生殖周期的一部分出现在子宫的上皮内层中。跟进 Gompel [ 50 ] 描述巨型线粒体、Armstrong 及其同事 [ 37 ] 的报告] 研究了子宫组织中的巨型线粒体作为该周期的函数，采用连续切片组织。通过这种方法，在排卵前后采集的 14 份子宫内膜标本中，有 12 份发现了巨线粒体。该报告表明，巨大的线粒体被植入了内质网，内质网布满了核糖体。阿姆斯特朗记录了巨型线粒体的出现出现在周期的中间，在第 18 天后迅速下降。基于线粒体参与体外腺样分化 [ 9 ] [ 10 ] [ 11 ]，似乎有理由提出在组织中观察到的巨线粒体也参与了分泌期的腺体形成。

针对巨型线粒体的大小和 3 维复杂性，空间填充模型源自 3 维透射电子显微镜 (TEM) [ 51 ]。Sun 及其同事建立了巨线粒体形成变化的信息序列 [ 52]，他用电子传递系统的破坏剂依托泊苷处理 HeLa 细胞，并记录了 16 小时内的变化。他们确定细胞色素 C 从线粒体泄漏到细胞质中，这是用这种毒素处理的细胞的早期可测量变化，这种现象也被观察为即将发生细胞凋亡的早期信号。如前所述，光学透明的细胞核和印戒细胞以及染色质碎片等结构伴随着线粒体核子的形成，因为据报道它们伴随着细胞凋亡，但它们不会导致细胞死亡，而是导致细胞分化 [ 9 ] [ 10 ] ] [ 11]。在 Sun 的序列中，细胞色素 C 从线粒体泄漏到细胞质中之后，氧化磷酸化的解偶联通过线粒体膜电位的丧失来测量，这对于氧化磷酸化是必不可少的。施用毒素 15 小时后，研究人员观察到线粒体内部结构的变化，特别是内膜从“典型”克里斯塔结构转变为可以充满气体并合并的独立囊泡基质隔室。给予依托泊苷后的细胞“快照”显示，有四类巨型线粒体，与正常不同，可能在 16 小时内依次形成：在其中一种变异中，正常的克里斯塔细胞膜与囊泡膜共存；观察到一些线粒体是完全泡状的；其中一些囊泡线粒体也肿胀；最后，一些囊泡线粒体肿胀得如此厉害，以至于几乎所有的内膜都被推到了正在扩张的细胞器的边缘[52 ]。

最近，断层扫描能够对已故非酒精性脂肪肝患者肝脏中的巨线粒体和正常线粒体进行全面调查 [ 25]。在这项研究中，研究人员使用了 4 个肝脏，检查了每个线粒体，并得出结论，他们所谓的巨型线粒体的内部结构“与正常大小的对应物相比是多倍的，而且明显不同”。他们观察到细长的巨型线粒体、线粒体内晶体结构和球形巨型线粒体结构。一个重要的考虑因素是，在形成巨线粒体的细胞中，也发现了典型的线粒体。在一个细胞中，研究人员计算了近 2400 个线粒体。在这个数字中，55% 是巨大的，其余的都是正常的，这表明存在于单个细胞中的适应和正常线粒体也可能在该细胞中活跃。在研究石川细胞的圆顶结构时，9 ]。这些结构之间的代谢变化可能是互补的。

上世纪中叶电子显微镜黄金时代的一系列研究表明，在专门从事合成代谢活动的器官中也发现了巨大的线粒体，例如合成大多数类固醇激素的肾上腺 [ 53 ]。在对大鼠肾上腺的研究中，Canick 和 Purvis 还发现了巨大的和典型的线粒体的混合物 [ 54]。皮质醇等类固醇激素的合成和释放受到来自垂体的营养激素的刺激。通过去除垂体可以引起两种线粒体相对量的时间依赖性变化。在这种情况下，研究人员检测到脂滴的大小和巨型线粒体的体积增加，这可能是原材料的堆积。巨线粒体占对照动物线粒体总体积的 8%，随着垂体切除术的肿胀，该值增加到 65%。已经发现，ACTH 的给药会在 9 天内逐渐逆转垂体切除术的这些影响，因为它恢复了类固醇激素的合成。如子宫内膜所述，

巨线粒体中液泡的内容，其中一些大到被称为空化[ 38 ]，在很大程度上仍然是一个悬而未决的问题。我们对线粒体核子的研究结果表明，这些液泡是由 CO 2和可能其他气体在巨型线粒体内的滞留形成的。这种可能性在石川细胞中描述的系统中通过观察扩大的液泡的力量提出了这种可能性]。附有内质网的巨线粒体必须保留气体的其他线索包括膜展开的速度[9 ]; 观察到当空心球体粘附在培养皿上时，迅速形成的液泡可以很容易地以气泡的形式被驱散 [ 13 ]，并且观察到当给药停止类固醇激素的合成时，液泡会变得巨大到“爆裂”的程度酶抑制剂 [ 38 ]。此外，液泡对线粒体核中染色质质量的压力很可能导致固缩染色质。似乎没有什么可以解释这些不同的观察结果以及气态液泡的形成和膨胀或其溶解。

nebenkern，甚至是圆顶形成过程中的线粒体核子所带来的那种结构变化，似乎并不能解释肾上腺中巨线粒体的存在。也许对 CO 2的随时获取使得“储存”在巨线粒体中的 CO 2在合成代谢组织（如肾上腺）中有价值。腺体使用胆固醇作为合成和分泌各种类固醇激素的起点。胆固醇的所有 27 个碳原子均来自乙酰基，有迹象表明，负责合成类固醇的肾上腺细胞富含在圆顶形成中检测到的相同 CO 2固定酶，正如 Paul 和 Laufer 的工作所证明的 [ 55]，他将高水平的内源性生物素的存在与肾上腺特定细胞中合成类固醇的能力联系起来。

3.3. 气泡的组成

然后解释巨线粒体（如线粒体核子）形成的理论是，多个典型线粒体融合成一个巨大的线粒体以及与内质网的结合可能在某些情况下从根本上改变结构，使 CO 2从适应的结构中缓慢扩散出来，如果有的话，气体会填满泡状基质隔间，这些隔间开始在细胞器本身内聚结成更大的液泡。液泡可以扩大并产生力，液泡可以储存CO 2。巨线粒体的形成是为了实现这些预期目标中的一个或两个吗？

任何细胞产生的主要代谢气体都是 CO 2，​​但是人们普遍认为 CO 2被动地通过生物膜扩散，就像它在实验室中通过脂质双层一样，这一直反对任何怀疑它可以被保留的假设。当 Boron 及其同事 [ 56 ]使用孤立的胃腺证明 CO 2的顶膜和基底膜渗透率之间存在差异时，这一假设受到了成功的挑战。Endeward 和 Gros [ 57 ] 的研究方法证明了生物膜对 CO 2的影响有多大（两个数量级）渗透性。这些研究人员和他们的同事证明，某些膜对 CO 2扩散的抵抗力明显高于其他膜 [ 58 ] [ 59 ]。此外，该实验室已经证明了 CO 2通过膜所需的压力增加与 O 2消耗量下降之间存在惊人的相互关系[ 60 ]。

CO 2通过典型线粒体膜的扩散比通过大多数其他膜的扩散更快，Gros 实验室的一项观察结果表明，通过葡萄糖的氧化磷酸化快速产生 CO 2的细胞器是有意义的。问题变成当正常线粒体与内质网融合成巨线粒体时会发生什么。Tandler 和 Hoppel [ 61 ] 和 Wakabayashi [ 24 ] 等研究人员是由正常线粒体融合形成巨线粒体这一概念的早期拥护者，这一过程在我们对圆顶形成的研究中很明显 [ 62]。Wakabayashi 对巨线粒体脂质的特性进行了广泛的研究，以试图了解可能导致易熔细胞器的潜在生化变化。Wakabayashi [ 24 ] 将巨线粒体的脂质与正常线粒体进行比较，发现磷脂酰乙醇胺和酸性磷脂以及不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比例增加，这些变化可能会增加融合性，如最近关于磷脂酰乙醇胺、磷脂酸和心磷脂的研究所示，线粒体特有的带负电荷的脂质 [ 63 ] [ 64 ]。但鉴于结果表明胆固醇是决定 CO 2扩散性的重要变量 [ 58 ]Wakabayashi 在他的研究 [ 16 ] 中发现的胆固醇增加可能与巨线粒体保留CO 2的可能性最相关。这种脂质变化以及内质网池 [ 37 ]对线粒体的密切投资可能会影响气体的通过，特别是因为 ER 本身被认为是胆固醇合成的场所。尽管尚未测量形成线粒体核子的石川细胞的绝对脂质含量，但其他数据表明脂质参与了线粒体核子的形成。丁酸等脂肪酸刺激圆顶的形成，因此刺激线粒体核的形成超过三倍 [ 65]。此外，伴随线粒体核子形成的内源性生物素的增加最终被证明与线粒体 CoA 羧化酶 [ 14 ] 的增加有关，这些酶是参与脂肪酸合成的含生物素的酶，例如丙酰 CoA 羧化酶。

为了使巨线粒体适应从而使CO 2滞留成为液泡的来源，巨线粒体膜的形成显着减慢CO 2 的排出以及CO 2由除氧化磷酸化，这一过程依赖于 O 2和正常线粒体内膜的典型克里斯塔结构。连同线粒体膜电位的丧失，融合成巨线粒体的典型线粒体内膜结构变化的性质表明，超过这一点，氧化磷酸化所必需的化学渗透[ 66] 将不再可能。除此之外，增加的气体水平表明另一种新陈代谢。Otto Warburg 坚持认为癌细胞必须使用替代代谢途径，因为观察到癌细胞对 O 2的吸收减少。DeBerardinis 和他的同事 [ 67 ] 扩展了 Warburg 的观察，证明虽然癌细胞利用葡萄糖，但大多数分子最终以乳酸的形式排出，而不是通过氧化磷酸化代谢。在那篇论文中，研究人员提出了谷氨酰胺代谢作为替代途径的潜力的证据。

从那时起，人们对谷氨酰胺代谢有了很多了解。这个难题的一个重要部分是实验证明谷氨酰胺可以通过还原羧化处理，绕过氧化磷酸化。对能够在极度缺氧条件下增殖的黑色素瘤细胞系进行的实验证实，谷氨酰胺代谢产生的 α 酮戊二酸的还原羧化作用比氧化代谢更重要，因为它是生产柠檬酸盐的途径 [ 68 ]。该反应使用位于线粒体中的 NADP+/NADPH 依赖性异柠檬酸脱氢酶 (IDH2)。马伦及其同事 [ 69] 表明具有缺陷线粒体的肿瘤细胞能够利用谷氨酰胺依赖性还原羧化作为柠檬酸盐代谢的主要途径。还原性谷氨酰胺代谢也发生在胞质溶胶中，并且依赖于第二种异柠檬酸脱氢酶 (IDH1) [ 70 ]。

在完全形成的巨线粒体中，内膜从 christae 转变为可以填充气体的单独的囊泡基质隔室 [ 62 ]。如电子显微照片所示，隔室合并，形成一个大到将所有膜推到巨线粒体边缘的液泡 [ 62 ]。在某些时候，可能在这个过程的早期，巨线粒体膜将无法进行氧化磷酸化，这表明适应的线粒体可能只能进行还原羧化。Shim 及其同事 [ 71 ] [ 72] 建立了谷氨酰胺和巨线粒体之间的重要联系，发现谷氨酰胺是还原羧化的底物，对于诱导巨线粒体至关重要。事实上，巨线粒体可能是最适合还原羧化的细胞器，特别是如果它的适应性使其或多或少不透氧的话。根据还原羧化的程度，这种可能性表明，CO 2的“池”可能会增加或减少，这取决于分解代谢或合成代谢是代谢的主要形式。并且似乎合理地建议保留的CO 2池将支持还原羧化。

很难夸大这种可能性的优势，特别是对于主要功能是合成代谢的线粒体，因为如 Zimorski等人。[ 73 ] 最近写道，“在氧气存在的情况下，每个细胞的生物质合成所消耗的能量是缺氧条件下的 13 倍。” 由于 CO 2很容易扩散进出典型的线粒体，因此对供应没有过多的强调，但对 CO 2的需求似乎是高度可变的。肾上腺需要按需排泄类固醇激素然后停止排泄这一事实使得能够储存CO 2的适应线粒体的想法似乎更加合理。某种 CO 2的释放由于溶解的 CO 2已被证明是 IDH [ 74 ]的主要底物，因此必须想象来自溶解状态的液泡。同一篇论文得出结论，由作者所谓的“苹果酸”酶催化的丙酮酸还原羧化实验也使用溶解的 CO 2作为主要底物。

关于还原羧化，可能还有很多需要了解的地方。Du 和他的同事 [ 75 ] 已经证明它是视网膜色素上皮细胞中的主要代谢途径。此外，在分离的上皮细胞中，还原性羧化作用增强 [ 76 ]。值得注意的是，正如 Labuschagne等人的一项研究报告的那样。[ 77 ]，还原羧化的增加伴随着线粒体的形态变化。如前所述，谷氨酰胺对于果蝇中巨线粒体的形成至关重要 [ 71 ] [ 72 ]。最近的一篇论文甚至描述了谷氨酰胺对癌细胞细胞外囊泡的起源和功能的影响 [ 78]。

在地球的历史上，目前的氧气水平仅存在于过去 5 亿年 [ 73 ]。导致氧化磷酸化发展的氧水平升高威胁到在没有O 2的情况下发展的过程，例如将气态氮转化为氨。我开始了我的职业生涯，研究使某些种类的蓝细菌即使在存在 O 2的情况下也能将 N 2转化为 NH 3的适应能力。该过程涉及 20 到 24 小时的分化 [ 79] 大约 10% 的营养细胞进入异型囊，这种细胞类型在主要是好氧的细丝中维持“相对缺氧的微环境”。[ 80 ] 这不是细胞适应酶的唯一例子，酶在 O 2的存在下失去活性。研究人员表明，莱茵衣藻的叶绿体中存在称为微氧生态位的厌氧部位，以保护 [FeFe] 氢化酶的活性免受 O 2失活，O 2 是细胞器本身产生的气体 [ 81 ]。另一个导致缺氧环境的结构变化的例子实际上是在单细胞绿色原生生物的巨型线粒体中发现的。

没有叶绿体的纤细眼虫突变体看似完全依赖于氧化磷酸化，但如果电子传输系统中毒或有机体置于厌氧条件下，它仍然能够发挥作用。在这些不利条件下，生长立即停止，但培养基中没有任何进一步的变化，眼虫适应并在大约 20 小时后再次开始增殖。Sharpless 和 Butow [ 82 ] 建立了一种独特的 NADP+ 依赖性丙酮酸脱氢酶的诱导作用，该酶对抗霉素或氰化物中毒不敏感，并且受到 AMP 的显着刺激。然而，正如研究人员在尝试纯化酶时发现的那样，诱导的酶会被 O 2灭活。一旦适应的线粒体被打破，它的活性就会丧失[ 83]。

3.4. 结论

不可避免的结论是大线粒体眼虫的适应结构保护了新诱导的酶免于被O 2失活。我们可以假设高等生物中的巨型线粒体具有类似的功能吗？不透明的巨细胞内的巨线粒体是否通过适应的膜结构和胆固醇强化来实现局部缺氧？观察到，即使作为氧化磷酸化能力的证据，巨线粒体仍保留气体显着降低 [ 52 ]，以及对膜通透性与 CO 2和 O 2吸收之间的相互关系的观察[ 61 ]，表明适应的线粒体可能主要是缺氧。

最后，本文展示了不透明的多核细胞是如何在石川培养中产生的，这一过程似乎是 Virchow 关于所有细胞都来自其他细胞的假设的一个例外。无法证明在观察开始之前区域 10 中不存在单层细胞，但不透明细胞的形成似乎不依赖于任何可以检测到的先前结构。观察到的是单个不透明细胞能够形成线粒体核子，该细胞在数小时内形成，间接证据表明它是在另一个不透明多核细胞产生的细胞外囊泡的影响下发育的。不太确定但值得一提的是，似乎同时形成了单层细胞。

如果在这些特殊细胞中形成的线粒体核子是保护 O 2敏感酶的结构，那么在巨线粒体中的某些情况下，对 H 2形成至关重要的生化酶甚至可能是可诱导的和有活性的。很难高估它有多么有用，它可以使细胞中的一些线粒体群适应缺氧甚至缺氧，能够更有效地合成代谢，能够储存 CO 2，​​甚至能够产生 H 2将 NADP+ 恢复到还原状态的能力。

四、材料与方法

石川子宫内膜上皮细胞在不含酚红的 MEM 中生长，添加 2 mM 谷氨酰胺、100 U/ml 青霉素、0.1 mg/ml 链霉素和 0.25 mg 两性霉素 B (GIBCO, Grand Island, NY)。Nishida 及其同事 [ 7 ] 从子宫内膜腺癌中建立的细胞系来自纽约西奈山医院的 Erlio Gurpide 博士的实验室。以大约 5 × 10 5 个细胞/cm 2的密度接种的细胞, 在含有 5% 小牛血清 (CS) 的 MEM 中生长 1-2 周。实验是在细胞处于对数生长期时进行的。菜肴被标记，以便我们可以在所需的时间间隔返回感兴趣的殖民地。使用 Olympus 倒置载物台显微镜以 200 倍和 400 倍的倍率观察结构。

如图 1和图 2所示，使用可染色量的生物素来检测线粒体核的存在，通过在培养皿中加入含 4% 多聚甲醛的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 来固定培养物。10 分钟后，用 5-10 ml PBS 轻轻洗涤细胞四次。向细胞中加入 1% Triton X-100 溶液以使膜透化。再次在 5 分钟后，用连续更换的 PBS 洗涤培养物。洗涤后，将细胞暴露于 1:200 稀释的 Extravidin 偶联辣根过氧化物酶 (HRP) (Signa) 中 30 分钟。进一步洗涤后，将 3-氨基-9-乙基咔唑 (AEC) 溶液添加到细胞中，该溶液是通过将 20 mg AEC 溶解在 2.5 ml 二甲基甲酰胺中并用 47.5 ml 调节至 pH 5.0 的 50 mM 乙酸钾稀释而制备的连同 0.25% H 2 O 2. 将该溶液在 37°C 下孵育 45 分钟以显色。去除 AEC 溶液，检查培养物，然后在 4°C 的 PBS 存在下储存。如果培养物中未添加与过氧化物酶连接的抗生物素蛋白，则不会发生反应。如果首先将不含过氧化物酶的抗生物素蛋白添加到培养物中，然后再添加与过氧化物酶连接的抗生物素蛋白，则不会观察到染色。如果在 AEC 之前未将亲和素 HRP 添加到培养物中，则不会发生染色，这表明内源性过氧化物酶不负责染色。为了确保抗生物素蛋白与生物素反应，我们使用与辣根过氧化物酶相连的链霉抗生物素蛋白以及生物素的一抗和与辣根过氧化物酶相连的二抗对圆顶进行染色。在所有情况下都会发生染色，

利益冲突

作者声明与本文的出版没有利益冲突。

参考

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