陆地异养二十二碳六烯酸生产用新型裂殖壶菌的特性和安全性
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摘要：本文研究的目的是扩展已发表的金银花 (AURA) 毒理学评估以及进一步的菌株表征，并 研究生物质或提取油具有抗菌特性或不良物质的潜力。AURA 正在研究作为 omega-3 长链多不饱和脂肪酸二十二碳六烯酸 (DHA) 的新来源，用于通过饲料补充剂来丰富动物源性食品。在最初的研究中，我们提供了d对新型海洋分离破囊壶菌的 18S rRNA 鉴定，确定了 AURA 生物质作为食品或饲料成分的营养成分，包括近似分析和脂肪酸谱分析，并证实了该菌株的 DHA 生产潜力。我们通过最低抑菌浓度 (MIC) 分析确定，未提取的 AURA 生物质是安全的，没有显示出抗菌作用，也没有证据表明浓度高达 1% w/w 的该产品或其提取物对参考人体肠道细菌有任何有害影响 测试。这表明 AURA 不应刺激对共生微生物群的选择性压力，因此不太可能有助于抗菌素耐药性的发展以及对人类和动物的伴随伤害。进一步分析表明，工业异养发酵生产的AURA生物质无不良反应；有毒海洋微藻代谢物、重金属、杀虫剂、微生物污染物和霉菌毒素。在食品或饲料中添加高达 1% w/w 的异养生长的 AURA 是一种安全且对环境有益的 DHA 补充策略。
关键词
Thraustochytrid ,二十二碳六烯酸,脂肪酸, Aurantiochytrium limacinum ,最低抑菌浓度,抗菌素耐药性
一、简介
全球食品工业继续面临养活不断增长的全球人口的挑战。然而，不断变化的环境因素确实会影响我们食物来源的来源。野生捕捞的海产品是人类饮食中长链多不饱和脂肪酸的主要来源，通过直接食用海产品、营养补充剂或将鱼产品纳入其他水生或陆生动物的饮食中[ 1 ]。已证明在反刍动物日粮中添加鱼油可促进肉类和奶制品中不饱和脂肪酸的流行 [ 2 ] [ 3]，这一事实可能对人类健康产生影响，其中饱和脂肪消耗的减少和随之而来的不饱和脂肪的增加可以降低心脏病和其他相关疾病的发病率 [ 4 ] [ 5 ]。从海洋环境中捕捞来养活水产养殖和陆地农业从长远来看不太可能是可持续的，必须寻找适当的替代品 [ 6 ] [ 7 ]。在考虑不饱和脂肪酸的来源时，需要考虑一系列安全因素。由于鱼的代谢能力低，重金属、持久性有机污染物和海洋微藻衍生的毒素的生物积累可导致鱼油中的污染物含量高。8 ] [ 9 ]。减少或去除这些污染物对于防止进入食物链至关重要，因为它们的毒性会抵消食物和饲料对人类和动物的益处 [ 10 ]。
使用海洋来源的原生生物从陆地异养发酵中提取的油与鱼油相比具有许多已证实的优势；陆地生产具有可扩展性，由于使用简单碳源的增长而更具可持续性，对海洋环境没有直接影响，并且可以生产出更一致和更具成本效益的产品 [ 11 ] [ 12 ]。Aurantiochytrium limacinum (AURA)通常被称为藻类或海洋微藻，实际上是 Stramenopile 组的成员，最近被描述为 athraustochytrid 或原生生物，表现出非光合真菌生理特征 [ 13 ]。通过最近的毒理学和遗传毒性测试，这种油质单细胞生物已被证明是安全的 [14 ] 并且可用于生产富含二十二碳六烯酸 (DHA) 的生物质，用于食用动物的膳食应用。这种膳食补充剂已证明可有效提高牛奶 [ 15 ]、肉类 [ 16 ] [ 17 ] [ 18 ] 和鸡蛋 [ 19 ] [ 20 ]中 DHA 和 EPA（二十碳五烯酸）以及其他 omega-3 脂肪酸的水平，一种补充人类饮食的宝贵手段。
从安全的角度来看，值得注意的是鱼/藻油补充剂（例如 DHA）的主要理想成分已显示出一定的抗菌活性 [ 4 ]。被视为毒素的化合物与被视为抗菌剂的化合物之间通常存在重叠。源自细胞过程的次级代谢物 (SM) 可以使生物体相对于其竞争对手具有优势，青霉素就是这种化合物的一个例子 [ 21 ]。海洋微藻是已知的生物活性 SMs 的生产者，例如石房蛤毒素、软骨藻酸和各种聚酮化合物 [ 9 ] [ 22 ]。聚酮化合物是与脂肪酸合成相关的 SM，通常具有临床重要性，在免疫抑制、癌症治疗和抗菌剂中发挥作用。23 ] [ 24 ] [ 25 ]。在降低与引入新型饲料材料相关的风险的背景下，谨慎的做法是确定材料的整体安全性并评估抗菌活性或悬浮在材料中的抗菌残留物的潜力。
这组研究的目标是为我们最近对 AURA [ 14 ] 的安全评估提供补充信息；包括有关身份和产品成分的更详细信息；有关污染物和不良物质的安全信息：霉菌毒素、重金属和杀虫剂；危害特性，确认未提取的金壶菌及其生物质和代谢物在抗菌素耐药性方面是安全的，可以合理确定对人类无害；最后测试未提取的金壶菌中是否有残留物或代谢物生物质或提取的油可能会在可食用组织中产生可能影响人体肠道菌群的假定残留物。我们的研究遵循美国食品和药物管理局兽医中心 (CVM) 工业指南 (GFI) #3“评估用于食品生产动物的化合物安全性的一般原则 ” [ 26 ] 残留化学部分；GFI # 152，“评估抗菌新动物药物的微生物学安全性 对 人类健康问题 细菌 的 影响”[ 27 ] 用于抗微生物药物耐药性测试，以及 GFI #159“评估人类食品中兽药残留安全性的研究：建立微生物ADI的一般方法” [ 28 ]用于测试指南询问 AURA 对人体肠道菌群的潜在影响的程序。
2。材料和方法
2.1。生化分析
异养生长、未提取的 AURA 生物质粉末 (CCAP 4087/2) 由 Alltech Inc. (Nicholasville, KY, USA) 提供给 Minnesota Valley Testing Laboratory (MVTL, New Ulm, MN, USA)。生物质产品的分析成分根据当前的良好实验室规范 (GLP) 指南 (21 CFR 第 58 部分) 确定：粗蛋白 (AOAC 990.03 [ 29 ])、粗脂肪 (AOAC 954.02 [ 30 ])、脂肪酸组成(AOAC 996.06 [ 31 ])、水分 (AOAC 930.15 [ 32 ]) 和灰分 (AOAC 942.05 [ 33 ])。
2.2. 18S rRNA 培养鉴定
Alltech Inc. (Nicholasville, KY, USA) 将纯化的代谢活性培养物单一培养物提供给德克萨斯大学 (Austin, Texas, USA) 的藻类培养物保藏中心，用于在自然科学学院 (University of Natural Sciences) 内进行鉴定和表征美国德克萨斯州奥斯汀市自然科学学院德克萨斯州奥斯汀分校）。菌落被分离并在培养基-H 中增殖用于以下分析：18S rRNA 鉴定、最小抑制浓度和聚酮化合物分析（第 2.3、2.4 和 2.5 节）。使用改进的用于 CTAB 介导的细菌基因组 DNA 分离的 JGI 方案从微生物中提取 DNA（概述于 [ 34] ) 并使用通用 18S 引物组进行 PCR 扩增。阅读产生了部分 18S 序列，该序列与 NCBI BLAST 数据库进行比较以确定序列相似性。
2.3. 最小抑制浓度（盘扩散）
化合物,提取 物和 菌株
在指数中期选择全细胞并通过离心浓缩。分离生长培养基上清液并储存用于以后的固相萃取，而剩余的细胞准备用于溶剂萃取。溶剂萃取涉及在冷丙酮中反复悬浮，然后离心和倾析以去除色素沉着。然后用四次甲醇洗涤提取剩余的细胞团块，然后在 80% 1-丙醇/水溶液中均质化。匀浆进行离心以分离细胞物质，随后的上清液加入甲醇提取物。用 80% 1-丙醇/水溶液再次重复该均质化过程。将萃取混合物蒸发以除去溶剂并重新悬浮在2ml水中。使用 2 ml 乙酸乙酯对该混合物进行脱脂；水相共脱脂四次，再次干燥。为了洗脱所需的分析物，将细胞提取物悬浮在 10 ml 25% 1-丙醇/水中并通过色谱柱，用 45% 1-丙醇/水溶液洗涤，在 80% 1-丙醇/水中洗脱溶液并干燥。将 30 ml 生长培养基上清液与 10 ml 25% 1-丙醇/水溶液混合，然后进行相同的固相萃取过程。将所得干燥的细胞提取物和上清液悬浮在 5% 甲醇/水溶液中，用于 MIC 分析[ 将细胞提取物悬浮在 10 ml 25% 1-丙醇/水中并通过色谱柱，用 45% 1-丙醇/水溶液洗涤，在 80% 1-丙醇/水溶液中洗脱并干燥。将 30 ml 生长培养基上清液与 10 ml 25% 1-丙醇/水溶液混合，然后进行相同的固相萃取过程。将所得干燥的细胞提取物和上清液悬浮在 5% 甲醇/水溶液中，用于 MIC 分析[ 将细胞提取物悬浮在 10 ml 25% 1-丙醇/水中并通过色谱柱，用 45% 1-丙醇/水溶液洗涤，在 80% 1-丙醇/水溶液中洗脱并干燥。将 30 ml 生长培养基上清液与 10 ml 25% 1-丙醇/水溶液混合，然后进行相同的固相萃取过程。将所得干燥的细胞提取物和上清液悬浮在 5% 甲醇/水溶液中，用于 MIC 分析[35 ]。DH5a大肠杆菌 培养物用作 MIC 分析的参考培养物。
最低 抑菌 浓度 测定
该实验是根据 CLSI M02-A12 指南使用圆盘扩散法 [ 36 ] 进行的。如下测试全细胞或提取物。
将九个圆盘放置在无菌 LB 琼脂板上以容纳细胞提取物。八个圆盘放置在盘子周围，一个盘子放在盘子的中心。中央椎间盘接受一剂 5% 甲醇溶液作为阴性对照。四个圆盘接受了测试溶液的浓度（表 1），而其余四个圆盘则应用了阳性对照。用于分析
测试/阳性对照溶液
浓应用（复制 1）
浓应用（复制 2）
细胞提取物
10 µg 和 20 µg
40 微克和 80 微克
上清提取物
10 µg 和 20 µg
40 微克和 80 微克
氨苄青霉素
100 µg 和 200 µg
1 毫克和 2 毫克
链霉素
100 纳克和 200 纳克
400 纳克和 800 纳克
表 1。圆盘扩散试验和阳性对照浓度。
整个细胞，四个测试圆盘被替换为直接在琼脂上点四滴 10 µl 致密 AURA 培养物）。在应用测试和对照溶液并让板干燥后，通过喷雾器将大肠杆菌（DH5a）培养物接种到琼脂上 。将重复的板在 37°C 下孵育 12 - 18 小时。如果存在或不存在间隙区域，则建立板的观察。
2.4. 最低抑制浓度（肉汤微量稀释）
以下细菌染色剂是根据 VICH GL36 (R) 指南 [ 28 ] 选择的，并从美国典型培养物保藏中心（马纳萨斯，弗吉尼亚州，美国）采购（表 2）。
最低 抑菌 浓度 测定
实验是根据 CLSI M07-A9 指南在 ABC 实验室（美国佛罗里达州盖恩斯维尔）使用肉汤宏观稀释法进行的 [ 37 ]。在适当的需氧、厌氧或微需氧生长条件下，用每种微生物分别测试每种产品。接种物最初是在固体培养基上制备的，胰蛋白酶大豆琼脂 (TSA) 在需氧条件下用于大肠杆菌 和粪肠球菌，TSA 与 5% 羊血 (SBA) 在厌氧生物下用于脆弱芽孢杆菌、长芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌。产气杆菌, F. canifelinum , P. anaerobius 和艰难 梭菌，而L. brevis在微需氧条件下在 de Mann、Rogosa Sharpe (MRS) 琼脂上制备。选择菌落并悬浮在无菌 0.85% 盐水中，以便在实验前获得 2.0 McFarland 的光密度。
好氧 分析
在 Mueller Hinton Broth (MHB) 中分别制备藻粉和藻油悬浮液的系列稀释液 (1:1) ( n = 13)，以获得 1% 至 0.0002441406% 的测试浓度。在 MHB 中类似地制备阳性和阴性对照。将 10 µl 体积接种到每个肉汤悬浮液中以形成约 10 的初始浓度。1 × 10 5 CFU/ml。稀释管在 35˚C ± 2˚C 有氧培养 18 - 20 小时。
厌氧 分析
藻粉和藻油悬浮液的系列稀释液 (1:1) ( n = 13) 分别在布鲁氏菌肉汤中与血红素和维生素 K 1一起制备，以获得 1% 低至 0.0002441406% 的测试浓度。在补充的布鲁氏菌肉汤中类似地制备阳性和阴性对照。接种 10 µl 体积
生物
隔离源
脆弱拟杆菌ATCC®25285TM
附件脓肿
长双歧杆菌ATCC®15707TM
成人肠
艰难梭菌ATCC®700057TM
未指定;应用：敏感性测试
粪肠球菌ATCC®51299TM
腹腔积液
大肠杆菌ATCC®25922TM_
临床分离物
产气柯林斯菌ATCC®29738TM
人类粪便
犬梭杆菌ATCC®BAA-689TM
临床标本，人类，狗咬伤
短乳杆菌ATCC®14869TM
人类粪便
厌氧消化链球菌ATCC®27337TM
未指定;应用：QC测试
表 2。选择用于肉汤宏观稀释 MIC 分析的菌株。
进入每个肉汤悬浮液以形成约 0.5 的初始浓度。1 × 10 5 CFU/ml。稀释管在 36°C ± 1°C 下厌氧培养 46 - 48 小时（B. fragilis和B. longum）或在 36°C ± 1°C 下厌氧培养 70 - 72 小时（C. difficile , C. aerofaciens , F. canifelinum和P. anaerobius）。
微需氧 分析
在 MRS Broth 中分别制备藻粉和藻油悬浮液的系列稀释液 (1:1) ( n = 13)，以获得 1% 至 0.0002441406% 的测试浓度。在 MRS Broth 中类似地制备阳性和阴性对照。将 10 µl 体积接种到每个肉汤悬浮液中以形成约 10 的初始浓度。3 × 10 5 CFU/ml。稀释管在 30°C ± 2°C 下微需氧培养 46 - 48 小时。
孵育后，检查含有 MHB、补充的布鲁氏菌肉汤和 MRS 肉汤的试管，并对浊度进行阳性或阴性评分。MIC是从完全抑制细菌生长的最低浓度的测试材料中确定的。
2.5. 藻毒素分析
聚酮 分析
“金藻”聚酮化合物的存在是通过 LC/MS 代谢指纹图谱进行的。在指数中期选择全细胞并通过离心浓缩。按照[ 35 ]制备细胞提取物和上清提取物。提取部分悬浮在 5% 甲醇溶液中，然后稀释至 1 µg/µl 用于 LC/MS 分析。对光谱进行了整理，并将 900 - 1200 m/z 区域中的峰与已知聚酮化合物的峰进行了比较。
海藻 酸 和 表海藻 酸 分析
未提取的 Aurantiochytrium limacinum ( CCAP 4087/2) 生物质（由美国肯塔基州奥特奇公司生产）提供给海洋研究所（爱尔兰戈尔韦）。样品在 50:50 甲醇/水溶液中制备，并通过超声提取 15 分钟。HPLC-DAD 和 UHPLC-DAD 分析是否存在软骨藻酸毒素是根据内部协议进行的。
2.6. 污染物、残留物和不良物质
这些分析由 Minnesota Valley Testing Laboratories Inc (Minnesota, USA) 根据当前的良好实验室规范 (GLP) 指南（21 CFR 第 58 部分）根据表 3中所示的方法进行。
3. 结果
3.1。生化分析
近似分析证实了未提取的金壶菌生物质的含油性质，样品中平均含有 72.85% 的粗脂肪（表 4）。粗蛋白、水分和灰分的百分比都很低（分别为 11.44%、3.10% 和 3.39%），表明底物显着转化为所需的脂肪酸。表 5揭示了脂肪酸谱和脂质组成。主要成分是棕榈酸（平均 36.35% w/w）和二十二碳六烯酸（平均 18.17% w/w）。AURA 生物质中的总多不饱和脂肪含量为 18.83% w/w，其中 DHA 占最大比例。
3.2. 18S rRNA 鉴定
基因鉴定组装的部分18S序列见图1。与 NCBI BLAST 数据库相比，测试菌株被确定为与以下六种原生生物最相似；Aura ntiochytrium Sp. ST-2012 克隆 BJ61 (Genbank: JQ982491.1), Aurantiochytrium Sp. TF81（基因库：KM023695.1），Aurantiochytrium Sp。TF23（基因库：KM023689.1），Aurantiochytrium Sp。LY-2012 分离株 PKU#Sed1 (Genbank: JX847370.1), Aurantiochyt rium Sp. LY-2012 分离物 PKU#MN7 (Genbank: JX847363.1), Aurantiochytrium Sp.
图 1。根据 GLP 原则分析未提取的Aurantiochytrium limacinum生物质 (AURA)的脂质组成和脂肪酸谱
分析物
方法
矿物质
铜（毫克/公斤）
AOAC 985.01 [38]
钙（毫克/公斤）
AOAC 985.01 [38]
铁（毫克/公斤）
AOAC 985.01 [38]
镁 (mg/kg)
AOAC 985.01 [38]
锰 (mg/kg)
AOAC 985.01 [38]
钾（毫克/公斤）
AOAC 985.01 [38]
钠 (mg/kg)
AOAC 985.01 [38]
硫 (mg/kg)
AOAC 985.01 [38]
锌 (mg/kg)
AOAC 985.01 [38]
硒 (mg/kg)
9.2669 国际滑联
氟化物 (mg/kg)
AOAC 975.08 [39]
重金属
锑 (mg/kg)
SW-846 6020 [40]
砷 (mg/kg)
SW-846 6020 [40]
镉 (mg/kg)
SW-846 6020 [40]
铅（毫克/公斤）
SW-846 6020 [40]
汞 (mg/kg)
ASTM D6722 [41]
微生物
有氧菌落数 (cfu/g)
FDA/BAM 第 3 章 [42]
大肠菌群计数 (cfu/g)
FDA/BAM 第 4 章 [43]
大肠杆菌 (cfu/g)
FDA/BAM 第 4 章 [43]
葡萄球菌确认 (cfu/g)
FDA/BAM 第 12 章 [44]
霉菌数 (cfu/g)
FDA/BAM 第 18 章 [45]
酵母菌数 (cfu/g)
FDA/BAM 第 18 章 [45]
假单胞菌 (cfu/g)
Chromagar/Difco BBL
梭菌 (cfu/g)
CMMEF 第 34 章 [46]
沙门氏菌( /25g)
FDA/BAM 第 5 章 [47]
李斯特菌 (cfu/g)
FDA/BAM 第 10 章 [48]
损坏
过氧化值（meq/kg 脂肪）
AOAC 965.33 [49]
霉菌毒素
黄曲霉毒素 B1 (ppb)
“Vicam Manual Mod”（BAM（第 18 章）方法 [45] 的修改）。
黄曲霉毒素 G1 (ppb)
黄曲霉毒素 B2 (ppb)
黄曲霉毒素 G2 (ppb)
脱氧雪腐镰刀菌烯醇（呕吐毒素）（ppm）
赭曲霉毒素 A (ppb)
玉米赤霉烯酮 (ppm)
农药
残留物如表 11 所示。
EPA 8081 方法的修改 [50]
表 3。用于评估异养发酵后未提取的 AURA 生物质中的污染物、残留物和其他不良物质的分析物和分析方法。
9.2669 ISU——爱荷华州立大学内部方法代码；Chromagar/Difco BBL——显色琼脂的专有计数方法。
分析物
批量分析结果 (N = 5)
范围 （％）
平均 （％）
粗蛋白质
8.32 - 15.8
11.44
粗脂肪
70.21 - 77.25
72.85
水分
2.27 - 5.57
3.10
灰
2.41 - 3.92
3.39
表 4。根据 GLP 原则 (n = 5)对未提取的Aurantiochytriumlimacinum生物质 (AURA)进行重量近似分析
脂肪酸
批量分析结果 (N = 5)
范围 （％）
平均 （％）
C10:0（癸酸）
0.010 - 0.017
0.013
C12:0（月桂酸）
0.112 - 0.156
0.128
C13:0（十三烷酸）
0.016 - 0.021
0.019
C14:0（肉豆蔻酸）
3.020 - 3.702
3.475
C15:0（十五烷酸）
1.050 - 1.283
1.135
C16:0（棕榈酸）
34.512 - 38.228
36.351
C16:1（棕榈油酸）
0.062 - 0.146
0.101
C17:0（魔芋酸）
0.308 - 0.440
0.363
C18:0（硬脂酸）
0.982 - 1.197
1.069
C18:1（油酸）
0.099 - 0.274
0.174
C18:2（叔十八碳二烯酸）
0.026 - 0.062
0.043
C18:2（亚油酸）
0.004 - 0.466
0.098
C20:0（花生酸）
0.103 - 0.186
0.145
C18:3（g-亚麻酸）
0.020 - 0.035
0.025
C18:3（亚麻酸）
0.014 - 0.129
0.045
C22:0（山嵛酸）
0.058 - 0.095
0.077
C20:3（g-二十碳三烯酸）
0.061 - 0.101
0.075
C20:3（二十碳三烯酸）
0.353 - 0.723
0.554
C20:4（花生四烯酸）
0.050 - 0.067
0.054
C22:2（二十二碳二烯酸）
0.005 - 0.296
0.162
C24:0（木蜡酸）
0.057 - 0.317
0.161
C20:5（二十碳五烯酸）
0.212 - 0.338
0.271
C22:3（二十二碳三烯酸）
0.006 - 0.053
0.029
C22:5（二十二碳五烯酸）
0.030 - 0.070
0.046
C22:6（二十二碳六烯酸）
16.920 - 19.837
18.174
总饱和脂肪酸
39.380 - 42.330
40.916
总单不饱和脂肪酸
0.170 - 0.370
0.280
总多不饱和脂肪酸
17.320 - 20.520
18.834
总反式脂肪酸
0.040 - 0.090
0.066
总脂肪酸
58.15 - 61.40
60.096
以甘油三酯计的总脂肪
60.83 - 63.61
62.874
表 5。根据 GLP 原则分析未提取的Aurantiochytrium limacinum生物质 (AURA)的脂质组成和脂肪酸谱
结果以成分的重量报告。
隔离 SL1101（基因库：JN986842.1）。此外，考虑到脂肪酸谱，原生生物显示自己与Aurantiochytrium sp。由 [ 51 ] 确定。
3.3. 最小抑制浓度（盘扩散）
如表6中的结果所示，在所有测试应用点都观察到大肠杆菌(DH5a)的 不受抑制的生长。同时，在阳性对照生物存在下观察到抑制，而在阴性对照中未观察到抑制。这些结果表明，在低浓度下，Aurantiochytrium细胞及其细胞提取物不会通过 DHA 产生或次级代谢物的存在对参考生物体构成可观察到的抗菌威胁。
3.4. 最低抑制浓度（肉汤微量稀释）
表 7和表 8中显示的实验结果显示了每种微生物的浊度分数相对于测试材料的相应浓度。在温育前，1% 和 0.0625% 浓度之间的测试悬浮液（由于测试材料的存在）的浊度是明显的，并且注意到在温育后浊度增加。每种微生物和测试材料组合的所有 13 个稀释管在孵育后均获得阳性评分，表明 9 种肠道微生物中没有一种被富含 DHA 的藻类粉末和浓度高达至少 0.03125% 的提取油抑制（由于最初的浓度高于 0.03125% 时的浊度）。
3.5. 藻毒素分析
细胞部分提取物和上清部分提取物的 LC/MS 谱图（图 2和图 3）与
分析物
测试浓度
测试材料
全细胞培养
下降 1 (+)
下降 2 (+)
掉落 3 (+)
下降 4 (+)
细胞提取物
10 微克 (+)
20 微克 (+)
40 微克 (+)
80 微克 (+)
上清提取物
10 微克 (+)
20 微克 (+)
40 微克 (+)
80 微克 (+)
阳性对照
氨苄青霉素
100 µg (-)
200 微克 (-)
1 毫克 (-)
2 毫克 (-)
链霉素
100 µg (-)
200 微克 (-)
400 微克 (-)
800 微克 (-)
阴性对照
5% 甲醇 (+)
5% 甲醇 (+)
表 6。在大肠杆菌(DH5a) 存在下，金壶菌提取物或全细胞培养物的最低抑菌浓度 (MIC)。
(+) 表示治疗点周围的生长；(-) 表示治疗点周围的生长受到抑制。
试管
AURA 粉末浓度 (%)
大肠杆菌_
粪肠球菌
B.脆弱
B.longum
艰难梭菌
F.canifelinum
C。
气化菌
厌氧菌_
短乳杆菌
1
1
+
+
+
+
+
+
+
+
+
2
0.5
+
+
+
+
+
+
+
+
+
3
0.25
+
+
+
+
+
+
+
+
+
4
0.125
+
+
+
+
+
+
+
+
+
5
0.0625
+
+
+
+
+
+
+
+
+
6
0.03125
+
+
+
+
+
+
+
+
+
7
0.015625
+
+
+
+
+
+
+
+
+
8
0.0078125
+
+
+
+
+
+
+
+
+
9
0.00390625
+
+
+
+
+
+
+
+
+
10
0.001953125
+
+
+
+
+
+
+
+
+
11
0.000976563
+
+
+
+
+
+
+
+
+
12
0.000488281
+
+
+
+
+
+
+
+
+
13
0.000244141
+
+
+
+
+
+
+
+
+
阳性对照
+
+
+
+
+
+
+
+
+
阴性对照
-
-
-
-
-
-
-
-
-
表 7。在选定的微生物存在下，未提取的Aurantiochytrium limacinum粉末的最低抑菌浓度 (MIC)
+ 表示培养基中的混浊度（生长）；- 表示培养基中没有混浊（没有生长）。
试管
AURA 粉末浓度 (%)
大肠杆菌_
E.
粪便
B.脆弱
B.longum
C。
艰难的
F.canifelinum
产气杆菌
厌氧菌_
短乳杆菌
1
1
+
+
+
+
+
+
+
+
+
2
0.5
+
+
+
+
+
+
+
+
+
3
0.25
+
+
+
+
+
+
+
+
+
4
0.125
+
+
+
+
+
+
+
+
+
5
0.0625
+
+
+
+
+
+
+
+
+
6
0.03125
+
+
+
+
+
+
+
+
+
7
0.015625
+
+
+
+
+
+
+
+
+
8
0.0078125
+
+
+
+
+
+
+
+
+
9
0.00390625
+
+
+
+
+
+
+
+
+
10
0.001953125
+
+
+
+
+
+
+
+
+
11
0.000976563
+
+
+
+
+
+
+
+
+
12
0.000488281
+
+
+
+
+
+
+
+
+
13
0.000244141
+
+
+
+
+
+
+
+
+
阳性对照
+
+
+
+
+
+
+
+
+
阴性对照
-
-
-
-
-
-
-
-
-
表 8。在选定微生物存在的情况下，提取的Aurantiochytrium limacinum粉末的最低抑菌浓度 (MIC)
+ 表示培养基中的混浊度（生长）；- 表示培养基中没有混浊（没有生长）。
图 2。Aurantiochytrium limacinum细胞部分提取物的光谱形式 LC/MS 分析
图 3。Aurantiochytrium limacinum上清液部分提取物的光谱形式 LC/MS 分析
[ 35 ]。基于加标对照，聚酮化合物 prymnes 的光谱峰在 Prym1 的 985.89 2+ m/z 和 1141.44 2+ m/z 或 Prym2 的 919.88 2+ m/z 和 1141.44 2+ m/z 处会很明显。虽然表型相似，但 Aurantiochytrium limacinum在系统发育上与金藻相距甚远，并且与产生Prymnesium parvum的聚酮化合物的光谱相比，被证明具有不同的代谢指纹。没有一个光谱峰与已知的聚酮化合物对齐，这表明这种生物不太可能对此类藻类毒素的产生构成威胁。此外，正如对未提取的 AURA 生物质样品中存在的软骨藻酸和表软骨藻酸的额外分析所证明的那样（表 9）；尚未发现Aurantiochytrium limacinum会产生任何经常观察到的海藻毒素。
3.6. 污染物、残留物和不良物质
工业发酵中重金属、农药等不良物质的进一步评估结果见表10和表11。这些分析很重要，因为它们表明Aurantiochytrium
批＃
隔离源
1
<0.25 微克/克
2
<0.25 微克/克
3
<0.25 微克/克
4
<0.25 微克/克
5
<0.25 微克/克
表 9。未提取的Aurantiochytriumlimacinum生物质(AURA)的软骨藻酸和表软骨藻酸分析
分析物
批量分析结果 (N = 5)
范围
平均
矿物质
铜（毫克/公斤）
-
<1.24
钙（毫克/公斤）
2736 - 3810
3353.2
铁（毫克/公斤）
-
<12.5
镁 (mg/kg)
2482 - 3312
2833.6
锰 (mg/kg)
-
<1.25
钾（毫克/公斤）
1633 - 3208
2228.4
钠 (mg/kg)
1104 - 1539
1277.8
硫 (mg/kg)
5248 - 7047
6013.2
锌 (mg/kg)
3.74 - 36.81
20.722
硒 (mg/kg)
<0.02
<0.02
氟化物 (mg/kg)
<5 - 8.49
<5.794
重金属
锑 (mg/kg)
<0.025
<0.025
砷 (mg/kg)
0.192
0.259
镉 (mg/kg)
<0.005
<0.005
铅（毫克/公斤）
<0.025
<0.025
汞 (mg/kg)
<0.02
<0.02
微生物
有氧菌落数 (cfu/g)
40 - 450
354
大肠菌群计数 (cfu/g)
<10
<10
大肠杆菌 (cfu/g)
<10
<10
葡萄球菌确认 (cfu/g)
<10
<10
霉菌数 (cfu/g)
<10 - 20
14*
酵母菌数 (cfu/g)
<10
<10
表 10。根据 GLP 原则对未提取的Aurantiochytrium limacinum生物质 (AURA) 进行矿物质、重金属、微生物病原体、腐败和毒素分析
cfu = 菌落形成单位；ND = 未检测到；meq = 毫当量；ppb = 十亿分之几；ppm =百万分之几；*假设 ND = 0。
农药
结果 (ppm)
奥尔德林
<0.01
α-六氯化苯
<0.01
β-苯六氯化物
<0.01
δ-六氯化苯
<0.01
Carbophenothion (三硫磷)
<0.15
α-氯丹
<0.01
γ-氯丹
<0.01
二嗪农
<0.14
狄氏剂
<0.02
双磺胺
<0.15
硫丹（硫丹）
<0.02
异狄氏剂
<0.03
乙硫磷
<0.14
七氯
<0.01
七氯环氧化物
<0.01
六氯苯
<0.01
林丹
<0.01
马拉硫磷
<0.01
甲氧氯
<0.05
表 11。符合 GLP 原则的未提取 Aurantiochytrium limacinum生物质 (AURA) 中的农药
DDD = 二氯二苯基二氯乙烷；DDE = 二氯二苯基二氯乙烯；DDT = 二氯二苯基三氯乙烷。
生产过程本身是安全的，适合目的。工业规模的异养发酵没有显示任何重金属积累升高的迹象，卫生指示生物和微生物病原体均不存在，霉菌毒素污染物水平低于检测限。同样，农药残留水平低于这些分析方法的检测限。铜和硒的含量很低，这与 AURA 旨在用作食用动物的富含 DHA 的饲料材料有关，其中许多动物可能对这些矿物质的高浓度存在敏感。
4. 讨论与结论
最初从佛罗里达海岸的海洋环境中分离出来，这里研究的油质原生生物显示出作为多不饱和脂肪酸来源的早期前景。生化分析表明，该生物体不仅产生超过 70% 的粗脂肪，而且 18% 的脂肪酸含量是二十二碳六烯酸 (DHA)。这与其他陆地来源相比具有优势 [ 52 ]，并将原生生物作为 DHA 的可行来源，并作为鱼油衍生 DHA 的替代品，用于水产养殖和动物营养的饮食。显微镜和生化分析已确定该生物体是破囊壶菌科的成员。由于表型分类无法解决物种身份，这被确认为Aurantiochytrium limacinum通过 18S rRNA 分析。
在确立了 AURA 作为商业 DHA 来源的潜力后，注意力集中在有机体的安全性上。每一种新的分离物都有可能成为具有生物活性的次级代谢物的生产者，并且已知来自海洋环境的其他生物会产生有毒的代谢物。“金藻”是一组在形态上与Aurantiochytrium相似的藻类原生生物，是有毒聚酮化合物的生产者，例如 prymnesin-1 (prym1) 和 prymnesin-2 (prym2) [ 35 ]。Aurantiochytrium的 LC/MS 光谱提取物显示与已知聚酮化合物的光谱特征没有相关性。同样，对软骨藻酸和表软骨藻酸生产的分析表明 AURA 不是这些神经毒性化合物的生产商。在生物化学上确定不存在已知毒素后，进行分析以确定细胞团或其提取物是否会对指示生物具有抑制作用。尽管使用高达 80 µg 的 AURA 提取物给药，但在大肠杆菌 (DH5a) 群中未观察到 抑制作用。因此，累积起来，没有证据表明这种Aurantiochytrium limacinum菌株对动物或其微生物群落构成任何特定威胁。
确定没有产生已知的微藻毒素或产生明显的抗菌作用，注意力转向了主要理想成分（DHA）及其对食用动物微生物群的影响。关于在饮食中补充 DHA 对共生生物群落的影响程度的细节有限，但是可以从 DHA 对其他环境中的微生物的影响得出一些推论。提取的 DHA 的 MIC 针对一系列食源性病原体存在；枯草芽孢 杆菌(350 µg/ml)、单核细胞增生李斯特 菌(350 µg/ml)、金黄色葡萄球菌( 500 µg/ml)、绿脓杆菌(250 µg/ml)、大肠杆菌。 大肠杆菌O157:H7 (1650 µg/ml)、产气肠杆菌( 4800 µg/ml)、肠炎沙门氏菌(1650 µg/ml) 和鼠伤寒沙门氏菌(1650 µg/ml) [ 53 ]。由于在治疗口腔健康状况方面的潜在临床应用，已确定了一系列口腔病原体的 MIC；变形链球菌( 625 µg/ml) 、白色念珠菌( 1250 µg/ml)、牙龈卟啉单胞菌(9.76 µg/ml)、Aggregatibacter actinomycetemcimitans (625 µg/ml)、Aggregatibacter segnis (19.53 µg/ml)、 具核梭杆菌 亚 种。vinventi (39.06 µg/ml)，具核梭 杆菌 亚种。polymorphum (39.06 µg/ml), Prevotella intermedia (78.12 µg/ml) [ 54 ]。值得注意的是，不同菌株对DHA的敏感性不同；孙等 人。确定口腔病原体的 MIC；P. gingivalis (4.11 µg/ml)、F. nucleatum (>32.85 µg/ml) [ 55 ] 和S. mutans (32.85 µg/ml) [ 56]。DHA 已显示出通过抑制敏感生物的生长来改变瘤胃内种群动态的趋势。例如，溶纤丁 弧菌的生长在低浓度 (50 µg/ml) [ 4 ] 下显示出生长抑制作用。
有证据表明，多不饱和脂肪酸对特定微生物具有一定的抗菌或抑菌作用 [ 4 ] [ 53 ] [ 54 ] [ 55 ] [ 56 ]，此外，DHA 有可能来源于补充动物饲料未提取 的Aurantiochytrium limacinum粉末或提取的油，可能会影响肠道中的微生物种群。然而，关于一系列微生物对 DHA 的抗微生物作用的敏感性的现有实验数据表明，这些微生物中的大多数具有 MIC ≥ 312.5 µg/ml。事实上，没有证据表明 DHA 可以促进食用动物体内或公共卫生领域抗菌素耐药性的发展 [ 54] 指出，“迄今为止，没有发现细菌对游离脂肪酸产生抗性，也没有出现抗性表型”。由于美国食品和药物管理局确定人类 DHA 的可接受每日摄入量 (ADI) 为每天 3000 毫克（欧洲食品安全局将 ADI 设定为每天 5000 毫克），因此 DHA 不太可能从食用源自饮食中添加了 AURA 的动物的食品将直接或通过促进抗菌素耐药性对人类构成威胁。
对微生物病原体、杀虫剂和重金属存在的最终筛选表明，生产过程是安全的、符合目的的，并且没有制造污染物。由提取的异养生长的Aurantiochytrium limacinum (CCAP 4087/2) 产生的 DHA 有望成为传统海洋捕捞鱼油的安全且环保的替代品。
致谢
作者对 Lynne Kuchel 女士（美国梅里埃营养科学公司）、Rebecca Timmons 女士（美国奥特奇公司）和 Carrie Conn 女士（美国奥特奇公司）的技术投入和项目指导表示感谢。作者感谢 Heather Hart 女士（美国 ABC 实验室）运行 MIC 检测，感谢 Schonna Manning 博士（美国德克萨斯大学奥斯汀分校）在 AURA 表征方面的工作以及分享对微藻、原生生物和破囊壶菌。最后，CAM 希望感谢已故的 Pearse Lyons 博士（美国奥特奇公司）在可持续农业领域的领导和对 AURA 项目的重大贡献。
利益冲突
作者声明与本文的发表没有利益冲突。
参考
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