牛至提取物的化学成分及抗病毒作用

摘要：本研究旨在确定牛至的水提取物和乙醇提取物对一些重要的兽医病毒（牛病毒性腹泻病毒 (BVDV)、马动脉炎病毒 (EAV)、马流感病毒 (EIV)、猫杯状病毒 (FCV)、犬通过评估抑制病毒颗粒产生的可能性，犬瘟热病毒 (CDV)、犬腺病毒 (CAV) 和犬冠状病毒 (CCoV)。来自 1600 μg/mL 的水提取物对所有评估的细胞谱系均未显示细胞毒性，Madin Darby bovine肾细胞 (MDBK)、兔肾细胞 (RK 13)、Madin Darby 犬肾细胞 (MDCK) 和 Crandell 猫肾细胞 (CRFK)，牛至的乙醇提取物在 600 μg/mL 时无毒。的水提取物培养基中的牛至导致 EAV 滴度从50% (TCID 50 ) 细胞培养的 10 5.42感染剂量显着降低至 10 2.09 TCID 50 /100 μL，而培养基中存在牛至的乙醇提取物导致EAV 滴度从 10 5.42 TCID 50显着降低至 10 0.79 TCID 50 /100 μL。向 CDV 添加水提取物导致从 10 2.00 TCID 50减少到 10 0.00 TCID 50/100 μL，而在乙醇提取物存在下，滴度从 10 2.00 TCID 50降低到 10 1.50 TCID 50 /100 μL。没有检测到其他分析病毒的滴度有显着差异。关于牛至提取物的化学分析，在乙醇提取物中鉴定出酚类物质迷迭香酸、咖啡酸、鼠尾草酚、对香豆酸、鼠尾草酸、木犀草素、芹菜素、山奈酚和槲皮素。在牛至的水提取物中分别检出迷迭香酸、对香豆酸、鼠尾草酸、木犀草素、芹菜素、山奈酚和槲皮素。获得的数据刺激其他生物测定，以确定哪些化合物负责抗病毒活性以及哪些是所涉及的机制。所呈现的结果和我们能够从中得出的考虑使我们得出结论，牛至的乙醇提取物比水提取物表现出更低的细胞活力，并且对 EAV 具有显着的抗病毒活性，并且水和乙醇提取物都具有抗病毒作用CDV。

关键词

.病毒,牛至,酚类,细胞 毒性

一、简介

病毒性疾病因其临床严重性、某些人畜共患病特征以及经济损失而对人类公共卫生和农业部门构成挑战。虽然有些疾病通过疫苗接种计划得到控制 [ 1 ] [ 2 ]，但其他疾病在国内市场上没有可用的疫苗 [ 3 ] [ 4 ]。使用抗病毒药物进行控制和治疗具有几个限制条件，例如作用谱降低、治疗效用有限、微生物耐药性、成本高和可用性有限 [ 4 ] [ 5] . 很难开发出新的抗病毒药物，主要是因为病毒的性质，它们完全依赖细胞代谢过程来繁殖和生存。因此，抑制病毒或导致病毒死亡的化合物也对宿主细胞具有不同强度的毒性 [ 5 ] [ 6 ]。

已经进行了几项基于合成物质开发新的抗病毒药物的研究。然而，为了分离和表征新化合物，已经做出了巨大努力来评估天然产物的抗病毒潜力。这可以抑制病毒复制或用作新分子的模型。一些植物提取物和精油的治疗潜力已被评估，其中许多已显示出有希望的生物活性 [ 7 ] [ 8 ] [ 9 ] [ 10 ]。

在广泛用作预防和治疗疾病的替代植物的各种植物中，牛至因其抗菌和抗真菌特性而脱颖而出 [ 11 ] - [ 18 ]。牛至属植物唇形科（唇形科）[ 19 ]。由于具有生物活性成分 [ 20 ] [ 21 ] [ 22 ] [ 23 ] [ 24 ] ，在世界范围内被公认为一种药用、天然抗氧化剂和调味植物。

然而，有必要评估这种植物的抗病毒潜力，通过体外和体内生物测定确定其特异性、毒性和作用机制，此外还需要确定造成生物效应的化学成分。这项工作旨在评估牛至的乙醇和水提取物对牛病毒性腹泻病毒 (BVDV)、马动脉炎病毒 (EAV)、马流感病毒 (EIV)、猫杯状病毒 (FCV)、犬瘟热病毒 (CDV)、犬腺病毒（CAV）和犬冠状病毒（CCoV），以及化合物的鉴定。

2。材料和方法

2.1。提取物的获取

为制备水提取物，将 25 g 牛至干叶在 60°C 下在 250 mL 蒸馏水中浸泡一小时，同时搅拌。然后过滤提取物并重复该过程两次。为了获得乙醇提取物，将 35 g 干叶加入到 350 mL 乙醇中，在 60°C 下搅拌 24 小时。在过滤水和乙醇提取物后，根据公式 d = m/v 计算它们各自的密度。然后将提取物储存在密封容器中直至使用。

2.2. 样品中化合物的鉴定

使用瓦里安二极管阵列检测器 (DAD) 通过高效液相色谱 (HPLC) 确定化学组成。反相色谱柱 C-18（Phenomenex Gemini，25 cm × 4.6 mm × 5 µm）用于酚类化合物的分离。色谱柱保持在 40˚C 并分析以下感兴趣的波长：280、300 和 320 nm。进样量为 10 µL，流速为 1 mL∙min -1. 用磷酸和 1% 甲醇对流动相进行水酸化。酚类化合物的洗脱使用以下梯度模式进行：0% - 15% B 2 min；15% - 25% B 5 分钟；25% - 30% B 持续 10 分钟；30% - 35% B 持续 15 分钟；35% - 50% B 25 分钟；50% - 60% B 30 分钟；60%- 80% B 35 分钟；80% - 100% B 持续 45 分钟；和 100% - 5% B 持续 60 分钟。在样品中使用的相同分析条件下，基于酚类化合物模式的分析（Sigma-Aldrich，> 98% 纯度）鉴定和量化酚类化合物。应用的识别参数是光谱相似性，将峰的保留时间和光谱纯度与感兴趣的保留时间相匹配。使用外标和 6 点稀释曲线（一式三份）和 R对于每个单独的模式，2 > 0.9。

2.3. 病毒和细胞

如 Snijder 和 Meulenberg [ 25 ] 所述，EAV、EIV、FCV、CDV、CAV 和 CCoV 在细胞培养物中繁殖。BVDV Singer菌株在Madin Darby牛肾细胞（MDBK）中繁殖；兔肾细胞中的 EAV（Bucyrus 菌株）（RK 13-ATCC® 编号：CCL-37 TM）；EIV 和 CDV 在 Madin Darby 犬肾细胞 (MDCK) 中繁殖，而 FCV 和 CCoV 在 Crandell 猫肾细胞 (CRFK) 中繁殖。当观察到完全细胞病变效应 (CPE) 时，将病毒培养物冷冻，解冻后通过离心澄清并将悬浮液储存在 -70°C 直至使用。细胞在含有 10% 胎牛血清 (FBS) 和青霉素-链霉素 (Invitrogen, Gaithersberg, MD) 的 Eagle 培养基 (E-MEM) 中在 37˚C 和 5% CO 2下培养。

2.4. 细胞毒性

通过确定要评估的关于抗病毒作用的最高无毒稀释度来分析水和乙醇提取物在谱系 MDBK、RK13、MDCK 和 CRFK 中的毒性。将细胞在含有 10% 胎牛血清的 E-MEM 中于 37˚C 和 5% CO 2的微孔板中培养 24 小时，以形成单层细胞。去除 E-MEM，并用牛至的水和乙醇提取物（从 1/10 到 1/5120）的系列稀释液（在 E-MEM 中）处理细胞。仅用 E-MEM 处理的细胞用作对照。如所述[ 26 ] ，在72小时后通过MTT测定测量细胞活力。生存力百分比计算为 AT/AC × 100；其中 AT 和 AC 分别是处理细胞和对照细胞的吸光率。

2.5. 筛选抗病毒活性

为了评估抗病毒活性的存在，在去除细胞单层的生长培养基后，在每种提取物不存在或存在的情况下，以预先确定为无毒的浓度进行病毒滴定。滴定是通过 Behrends & Kärber 方法[ 27 ]进行的，基于细胞病变效应的不存在或存在。72 小时后进行读数，并将滴度确定为 50% (TCID 50 /100 µL) 的细胞培养的感染剂量。

2.6. 统计分析

此处描述的所有测定至少进行了 3 次，并使用 Microsoft Excel® 计算平均值 ± SD（标准偏差）。使用费舍尔检验进行统计分析，当 p < 0.05 时，值被认为是显着的。

3。结果与讨论

萃取导致水萃取物的密度率为 1.0002 g/cm 3和 0.7846 g/cm 3用于牛至的乙醇提取物。从这个浓度，对不同细胞谱系中的毒性评估连续稀释。细胞毒性的测定被认为是重要的，以区分细胞病变效应和毒性效应，并选择与毒性有关的潜在植物提取物。MTT 测定显示细胞活力的降低与每种提取物中评估的浓度成正比。在所有使用的谱系中，在浓度为 1600 µg/mL 的水提取物中检测到不存在细胞毒性。乙醇提取物的细胞完整性和活力接近 100%，仅在 600 µg/mL 浓度下观察到。这些浓度用于抗病毒测定。

HPLC-DAD 方法在牛至的水提取物和乙醇提取物中鉴定出类似的酚类和黄酮类化合物。在乙醇中检测到的酚酸和二萜类物质是鼠尾草酸、鼠尾草酚、对香豆酸、迷迭香酸和咖啡酸。在水提取物中未检测到鼠尾草酚和咖啡酸。黄酮类化合物槲皮素、芹菜素、木犀草素和山奈酚均存在于两种提取物中。此处确定的化学成分也在其他用牛至的水提取物和乙醇提取物进行的研究中进行了描述[ 28 ]。

众所周知，用于获得提取物的溶剂也会干扰化学成分的种类，这可能会导致不同的生物活性。用己烷、乙醇和二氯甲烷等不同溶剂获得的植物提取物的抗病毒活性可能不同[ 29 ]。

我们的分析研究是定性的，化学成分的浓度没有确定。通常，较大浓度的活性成分是由抗菌作用引起的。

在每种提取物不存在或存在的情况下，病毒的滴定结果显示在（图 1）中。牛至的水和乙醇提取物的作用对 EAV 特别感兴趣，因为在提取物存在的情况下病毒几乎完全失活。在没有乙醇提取物的情况下，EAV 的平均滴度为 10 5.42 TCID 50 /100 µL，而在存在这些提取物的情况下，滴度降至 10 0.79 TCID 50 /100 µL，表明其具有很强的抗病毒作用。在培养基中添加牛至的水提取物导致 EAV 滴度从 10 5.42 TCID 50显着降低至 10 2.09TCID 50 /100 µL。当对数据进行统计分析时，证实 EAV 滴度存在显着差异（p < 0.05）。在牛至的水提取物和乙醇提取物存在的情况下对 CDV 进行滴定也获得了统计学上显着的结果（图 1）。在提取物存在的情况下，BVDV、EIV、FCF、CAV 和 CCoV 颗粒的产生没有显着影响。

水提取物和乙醇提取物对 EAV 和 CDV 的作用机制尚未确定。众所周知，抗病毒作用可能因不同病毒而异，甚至在感染的不同阶段也不同；该作用可以是细胞外、细胞吸附、细胞内、复制期间或病毒颗粒释放阶段[ 30 ]。

此外，牛至属植物提取物中描述的一些成分。例如类黄酮和酚酸可呈现协同或拮抗作用，增加或抑制生物潜力 [ 30 ] [ 31 ]。槲皮素和黄芩素组合的协同作用已被证明可对抗人类巨细胞病毒 (HCMV) [ 32 ]。

在牛至的水提取物和乙醇提取物中存在的黄酮类化合物中，槲皮素已被描述为具有抗病毒活性 [ 33 ] [ 34 ]。有人提出，槲皮素的抗病毒潜力与它们与病毒包膜上糖蛋白结合的能力有关，从而干扰病毒在细胞中的吸附和渗透，并干扰 DNA 合成[ 35 ]。

化合物槲皮素和/或黄芩素可能与本研究中观察到的针对 EAV 和 CDV 的抗病毒作用有关。然而，在

图 1。在牛至水提取物 (1600 µg/mL) 或乙醇提取物 (600 µg/mL) 不存在或存在的情况下，EAV、EIV、BVDV、FCV、CDV、CAV 和 CCoV 的滴度 (TCID 50 /100 µL)。

目前的工作，仅用牛至的乙醇提取物鉴定了针对 EAV 的抗病毒活性。这表明水提取物中不存在的化合物（鼠尾草酚和咖啡酸）的作用。关于 CDV，乙醇提取物和水提取物导致病毒颗粒的产生减少。将进行更多的研究，以确定负责抗 EAV 和抗 CDV 活性的一种或多种化合物，并确定抗病毒作用的机制。本研究中提供的结果提供了有关牛至的抗病毒活性的丰富但尚未报告的日期，因此是刺激未来调查的重要科学信息的初步来源。

4。结论

所呈现的结果和我们能够从中得出的考虑使我们得出结论，牛至的乙醇提取物比水提取物表现出更低的细胞活力，并且对 EAV 具有显着的抗病毒活性，水提取物对 EAV 和水提取物都具有抗病毒作用。乙醇提取物对 CDV 具有抗病毒作用。

利益冲突

作者声明与本文的发表没有利益冲突。

参考

[ 1 ] Meyer, G.、Deplanche, M.、Roux, D.、Moulignie, M.、Picard-Hagen, N.、Lyazrhi, F.、Raboisson, D.、Mathevet, P. 和 Schelcher, F. (2012) 胎儿接种一次减毒活疫苗后预防牛病毒性腹泻 1 型病毒感染。兽医杂志，192, 242-245。

[ 2 ] Luo, Y., Yuan, Y., Ankenbauer, RG, Nelson, LD, Witte, SB, Jackson, JA 和 Welch, SW (2012) 含有异源瘟病毒糖蛋白 E rns 的嵌合牛病毒性腹泻病毒的构建和评估嵌合体作为针对 BVDV 的潜在标记疫苗。疫苗，30, 3843-3848。

[ 3 ] Lima, M. 和 Osorio, FA (2007) 动脉病毒科。在：Flores, EF, Eds., Virologia Veterinária, Editora UFSM, Santa Maria/RS, 641-653。

[ 4 ] 袁、CZ 和德怀特。CH (2003) 微生物学兽医编辑：瓜纳巴拉。

[ 5 ] Muller, V., Chavez, JH, Reginatto, FH, Zucolotto, SM, Niero, R., Navarro, D., Yunes, RA, Schenkel, EP, Barardi, CRM, Zanetti, CR and Simoes, CMO (2007) 评估南美植物提取物对 I 型单纯疱疹病毒和狂犬病病毒的抗病毒活性研究。植物疗法研究，21, 970-974。

[ 6 ] Flores, EF (2007) Estrutura e composicao dos vírus。在：Flores, EF, Eds., Virologia Veterinária, Editora UFSM, Santa Maria/RS, 21-33。

[ 7 ] Nolkemper, S., Reichling, J., Stintzing, FC, Carle, R. 和 Schnitzler, P. (2006) 唇形科水提物对 1 型和 2 型单纯疱疹病毒的体外抗病毒作用。Planta Medica, 72, 1378-1382。

[ 8 ] Bakkali, F.、Averbeck, S.、Averbeck, D. 和 Idaomar, M. (2008) 精油的生物效应：综述。食品和化学毒理学，46, 446-475。

[ 9 ] Koch, C., Reichling, J., Kehm, R., Sharaf, MM, Zentgraf, H., Schneele, J. 和 Schnitzler, P. (2008) 茴香油、矮松油和洋甘菊油对胸苷的疗效-激酶阳性和胸苷激酶阴性疱疹病毒。药学和药理学杂志，60，1545-1550。

[ 10 ] Saderi, H. 和 Abbasi, M. (2011) 评估伊朗生长的唇形科植物在细胞培养中的抗腺病毒活性。非洲生物技术杂志，10，17546-17550。