干旱胁迫诱导的远缘臂草Wsi18启动子的鉴定

摘要：水稻Wsi 18 启动子赋予干旱诱导基因表达。该特性使其成为驱动相关基因以开发不同单子叶作物抗旱性状的有用候选者。在这项研究中，我们发现与水稻Wsi 18最接近的同源物Bradi 2 G 47700 基因在暴露于 ABA 和甘露醇的Brachypodium distachyon植物中上调。Wsi 18：产生uidA转基因双穗双穗芽孢杆菌植物，然后进行ABA或甘露醇处理。uidA的表达 与未经处理的相同转基因植物系相比，在三个转基因系（系 10、18 和 37）中，在暴露于 ABA 的植物中显着上调（分别增加了 5.61 ± 0.98、2.88 ± 0.75 和 9.13 ± 1.96 倍）。与没有甘露醇处理的相同转基因植物系相比，当用甘露醇处理时，uidA 在两个转基因系（系 18 和 37）中的表达也显示出上调（分别增加了 4.43 ± 1.07和8.47 ± 2.90倍）。此外，GUS 组织化学分析显示Wsi 18增加 用 ABA 或甘露醇处理转基因品系的叶和茎中的启动子活性。这是干旱诱导型水稻Wsi 18启动子在多种单子叶植物分子生物学研究的模式植物B. distachyon中的首次报道。总之，结果表明Wsi 18启动子及其同源物可以作为在不同单子叶作物中干旱胁迫诱导基因表达的有用工具。

关键词

W si 18 启动子,干旱 诱导, 二穗短柄草, ABA ,甘露醇

一、简介

非生物胁迫是对作物生产的严重威胁。每年，超过 50% 的全球主要作物产量因非生物胁迫而损失，干旱和高盐度等缺水胁迫是主要原因 [ 1 ]。据估计，到 2050 年，全球对作物衍生热量的需求将增加 100%，因此开发对非生物胁迫具有更大耐受性的作物品种对于满足这些需求至关重要 [ 2 ]。

通过基因工程将相关基因引入作物是培养植物抗逆性的重要途径。一些组成型启动子先前已用于此类目的，例如来自玉米的 Ubi1、来自水稻的 Act1、Rbcs 和 OsCc1 [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ]。然而，具有强组成型启动子的转基因植物经常遭受不良表型。例如，组成型过表达 Ubil: OsNAC6 的转基因水稻存在生长迟缓和低繁殖率的问题 [ 7 ]。组成型过度表达 35S 的转基因烟草植物：TPS1 具有更强的耐旱性，但生长迟缓 [ 8] . 这可能是由于不断过度表达转基因所需的资源成本，或与正常细胞代谢的负相互作用 [ 9 ]。应激诱导型启动子具有仅在应激条件下表达基因的优势。因此，具有应激诱导型启动子的植物可以消除由组成型转基因表达诱导的不良表型 [ 10 ] [ 11 ]。

迄今为止，仅在植物中鉴定出少数干旱诱导型启动子。Wsi18 是来自第 3 组晚期胚胎发生丰富 (LEA3) 家族的干旱诱导水稻基因 [ 12 ]。该启动子已在转基因水稻中进行了分析 [ 13 ] [ 14 ] [ 15 ]，在正常条件下，Wsi18 在转基因水稻组织中的基础表达较低，但在干旱、NaCl 或 ABA 处理后，由 Wsi18 驱动的基因表达在整个植物体中被诱导[ 15 ]。在干旱条件或暴露于 ABA 之后，Wsi18 的瞬时表达水平与强组成型启动子 Act1 所显示的水平相当 [ 16] . 尽管对水稻中的 Wsi18 进行了研究，但从未在其他植物物种中研究过其稳定的表达谱。此外，尚不清楚干旱诱导特性是否可以在其他单子叶作物中发挥作用，更重要的是，用于驱动合适基因的表达以在不同的单子叶作物中培养耐旱性。

禾本科由三个亚科的草组成，Ehrhartoideae、Panicoideae 和 Pooideae。Ehrhartoideae 包括水稻， Panicoideae 包括玉米和甘蔗，Pooideae 包括紫色假雀麦 (Brachypodium distachyon) 和 Triticeae 部落，其中包括许多重要的作物，如小麦、黑麦和大麦 [ 17 ]。水稻与Pooideae 的关系较远，并且与Pooideae 成员没有一些重要的农业性状。因此，水稻不太适合作为 Poodeae 成员的研究模式植物。B. distachyon 是一种新兴的单子叶植物模型，与许多谷类作物更相关[ 17 ]。

在这项研究中，我们鉴定了与水稻 Wsi18 基因最接近的同源物 Bradi2G47700 基因，并发现该基因在暴露于 ABA 或甘露醇后在双穗芽孢杆菌植物中上调。此外，我们表明 Wsi18 启动子在 ABA 和甘露醇处理下驱动转基因双穗芽孢杆菌植物中高水平的 uidA 表达。我们的研究结果表明，Wsi18 启动子在与许多重要单子叶作物密切相关的模式研究植物双穗双穗草属转基因植物中具有干旱诱导活性，并且 Wsi18 启动子可能是驱动相关基因抗旱的有效启动子。不同的单子叶作物。

2。材料和方法

2.1。向量构造

使用 pWsi18 质粒作为模板（从首尔国立大学的 Ju-Kon Kim 获得）和 FWsi18 和 RWsi18 的引物（表 1）通过 PCR 扩增 Wsi18 启动子区域。使用 pMDC32 质粒 [ 18 ] 和带有额外 attB 位点的 F2xCaMV35S 和 R2xCaMV35S 的引物通过 PCR 扩增 2×CaMV35S 启动子区域（表 1）。使用 Gateway® 技术（Thermo Fisher Scientific）将 Wsi18 启动子和 2 × CaMV35S 启动子的 PCR 产物分别插入 pMDC163 质粒 [ 19] ，分别生成 Wsi18::uidA 和 2 × CaMV35S::uidA 的构造。通过电穿孔将 Wsi18::uidA 和 2×CaMV35S::uidA 质粒分别引入根癌农杆菌菌株 AGL1。

引物名称

底漆使用

引物序列 5' à 3'

FWsi18

Wsi18网关克隆

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGGCTCTAGAGGATCCTGAGA

RWsi18

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCATGGCGCAAACTTGGCTG

F2xCaMV35S

2xCaMV35S 网关克隆

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCGACGGCCAGTGCCAAGC

R2xCaMV35S

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCCTCTCCAAATGAAATGAAC TTC

FWsi18/GUS

PCR基因分型

CCCGTTTCTCTGTCTTTTGC

RWsi18/GUS

GACCCACACTTTGCCGTAAT

FGUSQ

RT-qPCRuidAcDNA

TACCGTACCTCGCATTACCC

RGUSQ

加格特AAAGCCGACAGCAG

FBradi2G47700Q

RT-qPCR Bradi2G47700 cDNA

GGCAAGGACAAGACAGGAAG

RBradi2G47700Q

CCATTCCGATGGTGTTCATC

FSamDCQ

RT-qPCR SamDC cDNA

TGCTAATCTGCTCCAATGGC

RSamDCQ

GACGCAGCTGACCACCTAGA

表 1。本研究中使用的引物。

2.2. 转基因双穗芽孢杆菌植物的开发

Brachypodium distachyon 生态型 Bd21 种子获自美国农业部 (USDA)。种子在含有 2.17 g/L Murashige & Skoog (MS) 基础盐混合物 (Murashige and Skoog, 1962) (Phyto Technology Laboratories)、10 g/L 蔗糖和 12 g/L 胶凝剂 Phytagel™ ( Sigma-Aldrich) 在双蒸水 (ddH 2 O) 中。发芽后，在光照20小时、光照强度172 µmol·m − 2 ·s − 1、温度22˚CB的生长室中进行双穗愈伤组织诱导和植物转化，按照Alves的方案进行等。[ 20] . 简而言之，从植物中收集刚刚开始干燥的未成熟种子。将胚从种子中取出，铺在固体 MS 培养基上，并在 25°C 的黑暗中培养。一旦愈伤组织发育，就将致密的胚性愈伤组织（CEC）从任何柔软的湿易碎愈伤组织中分离出来，并转移到新鲜培养基中。然后将CEC分成更小的片段并通过与含有相应转化载体的农杆菌AGL1共培养进行转化。被农杆菌感染的愈伤组织在含有 100 µg/ml 潮霉素 B (Sigma-Aldrich) 的 MS 培养基上生长，以再生转基因植物。我们的杀伤曲线研究表明，这种水平的潮霉素选择基本上可以抑制非转基因组织的生长。挑选从选择培养基发育的芽并转移到新鲜培养基中用于植物发育。将 T1 种子（来自 T0 植物的种子）转移到含有 115 mg/L 潮霉素 B 的 MS 培养基中用于萌发。

从潮霉素选择开发的植物中提取DNA。T0 植物的叶子在液氮中速冻并用 Tissue Lyser II 机器 (Qiagen) 均质化。正向引物 FWsi18/GUS，与 Wsi18 启动子结合，反向引物 RWsi18/GUS，与 uidA 基因结合（表 1)，用于放大 Wsi18：uidA。根据产品说明使用 GoTaq® Flexi DNA 聚合酶 (Promega) 进行 PCR 反应，退火温度为 60˚C，延伸时间为 60 秒。预计转化的植物会产生 628 bp PCR 产物。为了进一步确认转化，从 T0 植物收集的 T1 种子在含有 115 mg/L 潮霉素 B 的种子萌发培养基上萌发。只有 PCR 分析呈阳性并在 115 mg/L 潮霉素培养基上成功萌发的植物才用于评估 Wsi18 启动子表达。

2.3. ABA 和干旱胁迫治疗

B. distachyon 植物种子置于培养皿中的 MS 培养基上进行发芽。将成功发芽的幼苗转移到 Magenta™ GA-7 植物组织培养箱 (Sigma-Aldrich) 中的相同 MS 培养基中。植物在生长室中生长，光周期为 20 小时，光照强度为 172 µmol·m − 2 ·s − 1和 22°C 的温度，持续 14 天。此时，植物已长势良好，并使用延长的光周期（20 小时）来帮助促进植物生长。对于 ABA 处理，植物在含有 100 µM ABA (Sigma-Aldrich) 的水培生长培养基中生长 8 小时。对于甘露醇处理，植物在含有 400 mM 甘露醇 (Sigma-Aldrich) 的水培生长培养基中生长 18 小时，该培养基以前被用作有效且典型的甘露醇介导的干旱处理 [ 12 ]。水培生长培养基由 49 mg/LH 3 PO 4、250 mg/L CaCl 2、185 mg/L MgSO 4 ·7H 2 O、179 mg/L KCl、58 mg/L NaCl、241 mg/L NH 4组成氯，454 毫克/升 KNO 3, 2.86 g/LH 3 BO 3 , 1.81 g/L MnCl 2 ·4H 2 O, 220 mg/L ZnSO 4 ·7H 2 O, 51 mg/L CUSO 4和 120 mg/L NaMoO 4 ·2H 2 O in ddH 2 O。

2.4. 相对含水量

测量每个实验组的相对含水量 (RWC)，以衡量每种压力处理造成的失水量 [ 21 ]。收集来自两个未转化植物的所有叶子，并在将植物从水培生长培养基中取出后立即称重以获得鲜重（Wfresh）。将叶子在培养皿中的 ddH 2 O 上漂浮 6 小时，吸干，并重新称重以得到膨体重量 (Wturgid)。然后将叶子在 50°C 的烘箱中放置 48 小时并重新称重以给出干重（Wdry）。RWC 使用以下等式计算：RWC = (Wfresh - Wdry)/(Wturgid-Wdry) × 100。

2.5. RNA 提取和定量实时 PCR

用于表达分析的样品由整个枝条部分组成，包括单个 3 周龄植物的叶子。将样品收集在不含 RNase 的微量离心管中，立即在液氮中快速冷冻，并在 -80˚C 下储存，直到进行 RNA 提取。对于 RNA 提取，冷冻样品用 Tissue Lyser II 机器匀浆，然后将 1 mL TRIzol® 试剂（Thermo Fisher Scientific）加入匀浆样品中，然后加入 200 μl 氯仿。使用 Nanodrop™ 1000 分光光度计对每个样品的 RNA 浓度进行定量。根据产品说明对 1 μg RNA 进行 DNase 1 处理（Thermo Fisher Scientific）以去除残留 DNA，并使用热灭活来灭活 DNase 1。使用 iScript™ Reverse Transcription Supermix (BIO-RAD) 按照产品说明对 DNase 1 处理的 RNA 样品进行互补 DNA (cDNA) 转化。cDNA 储存在 -20˚C 直到用于定量 PCR（qPCR）反应。使用 qPCR 反应混合物 SsoFast™ EVAGreen® supermix (BIO-RAD) 根据 CX96™ 实时系统 - C1000 触摸式热循环仪中的产品说明对 cDNA 模板进行定量 PCR (qPCR)。用于 qPCR 的引物列于 使用 qPCR 反应混合物 SsoFast™ EVAGreen® supermix (BIO-RAD) 根据 CX96™ 实时系统 - C1000 触摸式热循环仪中的产品说明对 cDNA 模板进行定量 PCR (qPCR)。用于 qPCR 的引物列于 使用 qPCR 反应混合物 SsoFast™ EVAGreen® supermix (BIO-RAD) 根据 CX96™ 实时系统 - C1000 触摸式热循环仪中的产品说明对 cDNA 模板进行定量 PCR (qPCR)。用于 qPCR 的引物列于表 1。反应的退火温度为 60°C，延伸时间为 30 秒。比较 Ct (Ct) 方法 (Livak 和 Schmittgen, 2001) 用于计算所使用的每个转基因品系中胁迫处理的植物和未胁迫的对照植物之间的相对倍数变化。对于每个样品，至少对感兴趣的基因以及内部对照基因进行了三个 qPCR 反应。对每个基因的技术重复进行平均以获得循环阈值 (Ct) 值。S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶 (SamDC) 被用作内部对照基因以标准化不同样品之间的表达水平，因为它已被证明在缺水条件下具有稳定的表达 [ 22] . 从感兴趣的基因（uidA，或Bradi2G47700）的Ct值中减去内参基因的Ct值，得到每个样品的Ct值。分析的每个转基因品系有 3 个应激处理样品和 3 个无应激对照样品。从每株内未胁迫的对照植物的平均Ct值中减去胁迫处理的植物和未胁迫的对照植物的Ct值以获得Ct值。计算倍数变化以表达每行内应激处理组和非应激对照组之间的表达差异。

2.6. GUS 组织化学分析

GUS 组织化学染色按照 Jefferson 等人的描述进行。[ 23 ]。简而言之，将每个处理组中带有植物叶子的枝条切下并立即浸入 GUS 染色溶液（2 mM 5-溴-4-氯-3-吲哚基葡糖苷酸 (X-gluc)、0.1 M NaPO 4 (pH 7.0) 、10 mM EDTA、1% triton X-100 和 1 mM K 3 Fe(CN) 6 )。X-gluc 是 uidA 基因产物 β-葡萄糖醛酸酶的底物。将每个样品真空渗透 30 分钟，然后在 37°C 下孵育过夜。将样品浸入 95% 乙醇中 48 小时以去除叶绿素，使染色更易于观察。

2.7. 统计分析

所有统计分析均使用程序“R”版本 3.1.3 版权所有© 2015（统计计算 R 基金会）。RWC 测量值表示为每个压力处理组和无压力对照组 9-10 次生物复制的平均值 ± 标准误差。使用 Welch 的两个样本 t 检验评估每个压力与其相应的无压力对照组之间的统计差异。显着性建立在 p < 0.05。所有 RT-qPCR 结果均表示为每个应激处理组中 3 个生物学重复的平均值±标准误差，以及每个转基因系的每个无应激对照组中 3 个生物学重复的平均值±标准误差。使用 Welch 的两个样本 t 检验评估每个应激治疗组与其相应的无应激对照组的倍数变化之间的统计差异。

3。结果与讨论

3.1。经甘露醇处理的 B. distachyon 植物的 RWC 降低

为了确定干旱处理的有效性，在植物经受 ABA 和甘露醇处理后测量植物相对含水量 (RWC)。与对照植物相比，用 ABA 处理的植物的 RWC 没有显着差异，RWC 分别为 93.44% ± 2.75% 和 90.41% ± 2.80%（图 1 (a)）。这是可以预测的，因为 ABA 本身不应该引起干旱，相反，ABA 仅用于介导植物对干旱的反应。另一方面，在含有甘露醇的水培生长培养基中生长的植物的 RWC 为 64.81% ± 4.63%，与 RWC 为 90.99% ± 3.87% 的对照植物相比显着下降（图 1(b))。因此，甘露醇处理可有效诱导双穗芽孢杆菌缺水状况，这在其他一些植物如马齿苋 [ 24 ]、烟草 [ 25 ] 和小麦 [ 26 ] 中观察到。

3.2. Bradi2G47700 基因表达在干旱胁迫下的双穗芽孢杆菌植物中上调

植物基因组数据库 http://www.phytozome.net/ 用于鉴定 B. distachyon 可能的 Wsi18 同源基因。推定的同源物是根据与水稻 Wsi18 基因的氨基酸序列相似性而非启动子 DNA 序列来鉴定的，因为编码区通常比非编码区更保守[ 27 ]。Bradi2G47700 氨基酸序列被鉴定为与 B. distachyon 中的 Wsi18 最相似的蛋白质，并且与 Wsi18 具有 74% 的氨基酸序列相似性（图 2）。为了研究干旱胁迫下Bradi2G47700基因在B. distachyon中的表达，对未转化的B. distachyon植物进行ABA和甘露醇处理，并在8小时和18小时通过RT-qPCR分析Bradi2G47700基因的表达。分别进行治疗。SamDC 基因已被证明在缺水条件下稳定表达 [ 22 ]，它被用作 RT-qPCR 的参考基因，以标准化样品之间的 Bradi2G47700 转录水平。将胁迫处理植物中 Bradi2G47700 转录物的标准化水平与未受胁迫的转录物水平进行比较

图 1。RWC 在甘露醇处理后显着下降，但在 ABA 处理后没有下降。测量相对含水量以评估胁迫处理植物（ABA和甘露醇）和对照植物之间的水分状况差异。对照组的测量值与各自的应激治疗组同时获得。数据是平均值 ± se (n = 10)，***p < 0.001 与对照，学生 t 检验，双尾。

图 2。Bradi2G47700 氨基酸序列分析。B. distachyon 的Bradi2G47700 氨基酸序列与来自水稻的水稻Wsi18 氨基酸序列进行比对。星号 (*) 表示具有单个完全保守残基的位置。冒号 (:) 表示化学性质非常相似的组之间的保守性。句点 (.) 表示化学性质不太相似的组之间的守恒。使用 www.phytozome.net [ 30 ] 将 Bradi2G47700 鉴定为推定的 Wsi18 同源物，并使用 Clustal Omega [ 31 ] [ 32 ] [ 33 ] 生成序列比对。Bradi2G47700 和 Wsi18 蛋白具有 74% 的序列相似性。

对照植物计算相对倍数变化。与非胁迫对照组相比，ABA 处理植物中的 Bradi2G47700 基因表达平均上调 794.14 ± 504.91 (P = 0.01914) 倍（图 3 (a)）。与未受胁迫的对照组相比，甘露醇处理的植物中的 Bradi2G47700 基因表达平均增加了 101.85 ± 8.17 (P < 0.01) 倍（图 3 (b)）。易等人。[ 15 ] 报道了 Wsi18 mRNA 丰度在叶组织或根部暴露于 ABA 中增加。有趣的是，Joshee 等人。[ 12 ]报道Wsi18基因可以被甘露醇和NaCl等水分胁迫条件诱导，但不能被ABA诱导。可能是 Joshee 等人。[ 12] 使用低剂量的 ABA (20 M)。ABA 的剂量为 Yi 等人。据报道（100 M）是五倍。总之，ABA和甘露醇处理后Bradi2G47700基因的上调表明B. distachyon中的Bradi2G47700基因是类似于Wsi18的水分胁迫诱导型。由于Bradi2G47700 与Wsi18 具有高度相似性，并且在干旱处理下也可诱导表达，因此Bradi2G47700 可能是Wsi18 的真正同源物。结果表明，可以探索其他单子叶作物中的 Wsi18 同源物，以开发针对各自和特定情况的干旱胁迫耐受性。

3.3. Wsi18 表达在 Wsi18 中上调：UidA 转基因 B. distachyon 经受 ABA 和甘露醇处理

转基因双穗芽孢杆菌植物被开发用于评估 Wsi18 启动子在缺水条件下和响应 ABA 的表达。首先进行 PCR 以评估植物转化。在 32 株再生植物中的 21 株中检测到 628 bp 的条带，这是 PCR 产物的预期大小（补充图S1）。除了 PCR 基因分型外，将 T1 种子（来自 T0 植物的种子）转移到含有 115 mg/L 潮霉素 B 的 MS 培养基中进行萌发。发现这个级别的选择就足够了

图 3。ABA和甘露醇处理后Bradi2G47700基因在B. distachyon中的表达。在暴露于 ABA (a) 和甘露醇 (b) 后，分析了野生型 B. distachyon 中 Bradi2G47700 的表达。实时 qPCR 用于测量每个样品中 Bradi2G47700 基因和内部对照基因 SamDC 的 mRNA 水平。将结果标准化为同一样本中的 SamDC 表达，然后标准化为对照。数据是平均值 ± se (n = 3)，***p < 0.001 与对照，学生 t 检验，双尾。

杀死非转基因植物（补充图S2）。PCR阳性的所有株系均在含有115mg/L潮霉素的培养基上正常发芽。另一方面，在 PCR 基因分型中未产生正确 628 bp 产物的植物要么在潮霉素 B 存在下不发芽，要么仅产生黑色根（未显示）。PCR 基因分型和潮霉素 B 种子选择提供两个水平的植物转化分析，只有 PCR 阳性并在高水平（115 mg/L）潮霉素 B 选择下显示正常发芽和生长的植物用于评估 Wsi18 表达。

实时 PCR 分析用于检查 uidA 报告基因的表达，该基因由 Wsi18 启动子驱动，在 Wsi18 的转基因系中： uidA 在 ABA 或甘露醇处理后。SamDC 基因用作 RT-qPCR 的参考基因，以标准化样品之间的 uidA 基因表达。将每个品系内的标准化 uidA 表达水平与同一转基因品系的未经干旱处理的对照植物的表达水平进行比较，以确定它们的相对倍数变化。将在新鲜水培生长培养基中生长与它们各自的胁迫处理相同的持续时间的植物用作对照。在五个转基因品系中，三个品系（第 10、18 和 37 行）中的 uidA 表达在 ABA 处理后显着上调。第 10、18 和 37 行显示倍数增加 5.61 ± 0.98 (P < 0.01)、2.88 ± 0。图 4 (a))。其他两行（第 3 行和第 12 行）中的 uidA 表达没有显示出显着的表达增加（图 4（a））。对于甘露醇处理，两行（第 18 行和第 37 行）中的 uidA 表达显着上调。第 18 行和第 37 行中的 uidA 表达式分别显示了 4.43 ± 1.07 (P < 0.05) 和 8.47 ± 2.90 (P < 0.05) 的倍数增加。虽然第 11、15 行中的 uidA 表达式

图 4。Wsi18 衍生的 uidA 基因表达在 Wsi18 中上调：使用 RT-PCR 进行 ABA 和甘露醇处理的 uidA 转基因双穗芽孢杆菌。由 Wsi18 启动子驱动的 uidA 的表达对 B. distachyon 中的 ABA 和甘露醇暴露有反应。RT-qPCR 用于分析暴露于 ABA (a) 和甘露醇 (b) 后对照和处理植物中的 uidA 表达水平。将每个样品中的 UidA 表达水平标准化为 SamDC，然后标准化为对照。数据是平均值 ± se (n = 3)，*p < 0.05，**p < 0.01 与对照，学生 t 检验，单尾。

和 27 分别显示上调增加 2.16 ± 1.27 (P = 0.2298)、6.10 ± 3.52 (P = 0.0938) 和 2.96 ± 0.90 (P = 0.0659) 倍，对照组和治疗组之间没有显着差异（图 4 (b))。在 [ 14 ] [ 28 ]之前，经常报道组成型和诱导型启动子在不同转基因植物中的转基因表达变化] . 在本研究中观察到的转基因系之间 uidA 表达差异的一种解释可能是转基因整合到 B. distachyon 基因组中的位点的差异，称为位置效应。在整合位点周围发现的转录调控序列，如增强子和抑制剂，以及整合位点周围的染色质结构，都可能影响转基因的表达。在高表达位点整合将产生比在转录活性较低的位点整合更高表达的转基因系[ 34 ]。此外，已显示拷贝数影响转基因表达水平。由于同源依赖性基因沉默，多个转基因拷贝的整合通常会产生低水平的表达。29 ]。同源依赖性基因沉默可以是转录基因沉默或转录后基因沉默的结果。转录基因沉默包括启动子甲基化等过程，它会阻止从启动子发生的转录，而转录后基因沉默会导致转录物在被翻译成蛋白质之前被降解。如果 Wsi18 在 B. distachyon 中不是可诱导缺水的，则在任何转基因品系的胁迫处理和未胁迫对照植物之间预计 uidA 表达没有差异。在某些转基因品系中，甘露醇和 ABA 处理确实显示出 Wsi18 驱动的 uidA 表达显着增加，这表明 Wsi18 在双穗芽孢杆菌中确实具有缺水诱导活性。

3.4. Wsi18 中 Wsi18 活性的定性分析：使用 GUS 组织化学分析的 UidA 转基因 B. distachyon

除了实时 PCR 分析，GUS 组织化学分析用于分析和可视化 Wsi18 启动子在甘露醇和 ABA 处理后介导的表达。GUS 组织化学分析可以提供对 Wsi18 蛋白表达的进一步评估。CaMV35S: uidA 转基因 B. distachyon 植物与未经干旱处理的野生型 B. distachyon 植物相比，在茎和叶中显示出更高量的 GUS 活性（图 5（一个））。每个分析使用三个转基因系，其中 uidA 报告基因由 Wsi18 启动子驱动；分析时植物为 3 周龄。ABA处理组中的植物在含有100μM ABA的水培生长培养基中生长8小时，甘露醇处理组中生长的植物在含有400mM甘露醇的水培生长培养基中生长18小时。未受胁迫的对照植物与用于胁迫处理的转基因品系相同，并且在新鲜的水培生长培养基中生长与它们各自的胁迫处理相同的持续时间。与对照植物相比，三个 Wsi18: uidA 转基因品系 10、12 和 37 在经过 ABA 处理的植物的茎和叶中显示出更高量的 GUS 活性（图 5(b))。与对照植物相比，经过甘露醇处理的三个 Wsi18: uidA 转基因品系 11、18 和 24 也显示出更高程度的 GUS 染色，在任何对照植物中均未检测到 GUS 活性（图 5 (c)）。不同转基因品系之间的 GUS 活性水平存在差异，然而，对于每种胁迫处理，胁迫处理后的 GUS 活性比未胁迫的对照植物中更为普遍。一些未受胁迫的对照植物确实显示出小范围的 GUS 活性，但总是比受胁迫处理的对照植物的程度要小。未受胁迫的对照植物中低水平的 Wsi18 启动子活性与 Yi 等人报道的转基因水稻中 Wsi18 活性的观察结果一致。[ 15] . Wsi18 在未受胁迫的对照植物中驱动的低水平表达可能是由于转基因中基因表达的调控不如其天然环境中的基因严格。未转化的植物充当阴性对照以确保没有内源性 GUS

图 5。Wsi18 中 Wsi18 活性的定性分析：uidA 转基因 B. distachyon 使用 GUS 组织化学测定。进行组织化学 GUS 测定以观察 ABA 和甘露醇处理后的 GUS 表达模式。(a) 野生型 B. distachyon 植物作为阴性对照，转基因 2 × CaMV35S：uidA B. distachyon 植物作为阳性对照；(b) 转基因 Wsi18 的 GUS 表达：uidA B. distachyon 植物在含有 100 µM ABA 的水培生长培养基中生长 8 小时，或对照条件；(c) 转基因 Wsi18 的 GUS 表达：uidA B. distachyon 植物在含有 400 mM 甘露醇的水培生长培养基中生长 18 小时或对照条件。

B. distachyon 中的表达，或染色溶液的污染。

我们的研究结果表明，与水稻 Wsi18 最接近的同源物 Bradi2G47700 基因在暴露于 ABA 和甘露醇的 B. distachyon 植物中上调。此外，我们发现 Wsi18 启动子可以被 ABA 和甘露醇产生的缺水条件诱导表达。对 ABA 的反应表明 Wsi18 可能是通过 ABA 依赖性信号通路诱导的，以介导植物的干旱胁迫。研究表明，Wsi18 同源物可用于驱动不同单子叶作物抗旱胁迫的相关基因。

致谢

我们要感谢首尔国立大学的 Ju-Kon Kim 提供了包含 Wsi18 启动子序列的 pWsi18 质粒。我们感谢 Rima Menassa 博士和 Danielle Way 博士在研究期间的讨论和建议。

补充

(一)(二)

图S1. 从 pMDC163-Wsi18 转化的愈伤组织再生的 B. distachyon 植物的 PCR 基因分型。在 PCR 基因分型中，正向引物 FWsi18/GUS 在 uidA 基因上游 331 bp 处与 Wsi18 启动子结合，而反向引物 RWsi18/GUS 在起始密码子下游 297 bp 处与 uidA 基因结合。hpt 基因赋予所有成功将 T-DNA 区域整合到其基因组中的植物对潮霉素 B 的抗性，并用作 T1 种子在含有 115 mg/L 潮霉素 B 的种子萌发培养基上萌发的选择标记。从接种含有 pMDC163-Wsi18 质粒的根癌农杆菌的愈伤组织再生的双穗芽孢杆菌植物的 PCR 基因分型。当在琼脂糖凝胶上运行时，使用转基因植物 DNA 的 PCR 产生了 628 bp 大小的条带。pMDC163-Wsi18 质粒用作阳性对照 PCR 反应 (+) 的模板 DNA。野生型 B. distachyon DNA (WT) 和无菌水 (H2 O) 代替 DNA，用作 PCR 反应的阴性对照。

图 S2。潮霉素杀伤曲线。将野生型 B. distachyon 种子播种在含有不同浓度潮霉素 B 的种子萌发培养基上 14 天。潮霉素B导致幼苗要么不发芽，要么出现黑根和生长迟缓。在含有 60 mg/L 潮霉素 B 的培养基上发芽 12 天足以破坏所有野生型种子的生长。更高浓度的潮霉素 B 能够在更短的时间内识别潮霉素 B 敏感种子。

利益冲突

作者声明与本文的发表没有利益冲突。

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