胆固醇增强培养的人脐静脉内皮细胞的β-淀粉样蛋白生成

摘要：脑淀粉样血管病 (CAA) 常见于老年人，几乎总是发生在阿尔茨海默病 (AD) 患者中。β-淀粉样肽 (A β ) 是通过β-分泌酶-1 (BACE1) 和γ-分泌酶对β-淀粉样前体蛋白 (APP) 的淀粉样蛋白生成加工产生的。最近显示血管内皮细胞具有产生 A β的分子机制，这可能参与 CAA 的发展。高胆固醇血症被认为是 AD 的危险因素，而胆固醇是否可以调节内皮 A β则知之甚少生产。在本研究中，我们在体外验证了人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) 的淀粉样蛋白生成能力，并探讨了胆固醇暴露对其淀粉样蛋白生成潜力的影响。12.5 和 25 mg/dL 的胆固醇处理显着提高了细胞裂解物中的APP、BACE1 和 APP β -CTF 蛋白水平和β位点 APP 切割活性，以及​​培养基中的 A β 40 水平。然而，与 50 和 100 mg/dL 的胆固醇共孵育减弱了培养细胞的活力并降低了它们的淀粉样蛋白生成能力。这些发现表明，高胆固醇暴露会对血管内皮细胞造成压力，并且在一定剂量范围内可以促进这些细胞中的淀粉样蛋白生成反应。

关键词

衰老,阿尔茨海默病,胆固醇,神经变性,血管性痴呆

一、简介

脑淀粉样变性是一种由β-淀粉样肽（Aβ）在中枢神经系统的细胞外基质和血管壁沉积引起的病理状态，分别称为实质淀粉样斑块和脑淀粉样血管病（CAA）[ 1 ] [ 2 ]。淀粉样斑块和 CAA 是阿尔茨海默病 (AD) 痴呆和血管类型 [ 3 ] - [ 5 ] 的明确神经病理学病变之一，尽管在非痴呆老年人的大脑中可以看到这两种类型的淀粉样变性 [ 6 ] - [ 13] . 除了 Aβ 沉积，实质和血管淀粉样蛋白病理可能与退行性和反应性细胞变化共存，包括神经元和血管细胞丢失、神经炎性营养不良和神经胶质激活 [ 14 ] - [ 19 ]。

神经元似乎是大脑中可溶性和不溶性 Aβ 产物的主要来源，因为它们富含淀粉样蛋白生成生化机制，包括 β-淀粉样前体蛋白 (APP)、β-secre-tatse-1 (BACE1) 和 γ-分泌酶[ 20 ] - [ 22 ]。特别是，在患有淀粉样蛋白神经病理学的人脑中报告了升高的 BACE1 蛋白和酶活性 [ 22 ] - [ 30 ]。具体而言，在神经炎和血管病性 Aβ 沉积周围的营养不良轴突中，显微镜下可确定增强的 BACE1 表达 [ 18 ] [ 31 ] - [ 34 ]。

最初显示血管内皮细胞在体外表达全套淀粉样蛋白生成机制，最近在体内（包括人脑中的 CAA）中得到了证实 [ 35 ] - [ 42 ]。提示血管内皮细胞过度产生Aβ可能参与CAA发展的早期阶段[ 40 ]-[ 42 ]。因此，识别可能增强内皮淀粉样蛋白生成的循环因子变得很重要。长期以来，高胆固醇血症一直被认为是 AD 和血管性痴呆的危险因素 [ 43 ] - [ 53] . 然而，胆固醇是否会直接影响血管内皮细胞中的淀粉样蛋白生成活性仍然不太清楚 [ 54 ]。在本研究中，我们使用人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) 作为模型来探索胆固醇对内皮淀粉样蛋白表达和 Aβ 分泌的调节作用。培养的 HUVECs 对胆固醇处理表现出双相反应，低剂量暴露增强 Aβ 生成，而高剂量暴露导致细胞死亡并减少 Aβ 产生。

2。材料和方法

2.1。细胞培养和胆固醇治疗

HUVECs 是商业获得的（目录 #C 0035C ，生命技术公司）。细胞供应用含有10%胎牛血清的DMEM/F12重新悬浮，开始密度约为5×10 6 个细胞/mL。细胞在 37˚C 下在含有 95% 空气和 5% CO 2的加湿气氛中培养，置于六孔Corning-Costar 板（Catalog #CLS3516；Life Technologies Corporation）中。每个孔装有 2 ml 培养基和涂有聚赖氨酸的玻璃盖玻片，培养基每周更换两次。进行了初步实验以验证培养的细胞并优化生化分析。

对于每轮实验，在培养的第 4 天开始对 HUVEC 进行胆固醇处理，持续时间为 48 小时。在不同的时间分别进行了3次实验。对于每个实验，培养基中含有 0、12.5、25、50 和 100 mg/dL 胆固醇（货号 #C8667，Sigma-Aldrich， 圣路易斯 , 莫 , 美国 ) 重复添加到装有相同数量的细胞的孔中，这些细胞来自同一批原始 HUVEC 扩增。培养 48 小时后收集培养基以评估 Aβ40 浓度，收获相应的培养细胞组用于形态学研究和评估相关蛋白质和 APP β-切割活性。

2.2. 免疫细胞化学和显微镜检查

在盖玻片上生长的 HUVEC 用冷的 4% 多聚甲醛原位固定 20 分钟，并冷冻保存直至免疫荧光处理。染色前将盖玻片解冻至室温，在含有 5% 驴血清的 PBS 中孵育 30 分钟，然后与一对在不同物种中产生的一抗在 4°C 下反应过夜，包括 1) 小鼠抗 CD31 (内皮标记）[ 41 ]和兔抗APP C-末端（CT20）；2) 小鼠抗 CD31 和兔抗 BACE1 [ 20 ] [ 32 ]；3) 小鼠抗 CD31 和兔抗 presilinin-1 (PS1) N-末端 (ab14) [ 41 ]。用 PBS 冲洗几次后，盖玻片在室温下与 Alexa Fluor 一起进一步孵育 2 小时® 488 驴抗兔和 Alexa Fluor ® 594 偶联驴抗小鼠 IgG（1:200，Invitrogen， 卡尔斯巴德 , 加州 , 美国 ）。盖玻片最后用双苯并亚胺 (Hoechst 33,342, 1:50,000, Catalog #B2261, Sigma-Aldrich) 复染，彻底清洗，并用防褪色介质固定。在配备数字成像系统（CellSens Standard，Olympus Corporation， 日本 ）。

2.3. 蛋白质印迹

HUVECs 颗粒 (×4, w⁄v) 通过超声在 T- 每 含有蛋白酶抑制剂（罗氏，印第安纳波利斯，印第安纳州，美国）的提取缓冲液（皮尔斯，罗克福德，伊利诺伊州，美国）。裂解物在 15,000 克 ，收集上清液并通过 DC 蛋白质测定法（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA）测定蛋白质浓度。从先前的研究 (Xue et al., 2015) 中获得的人类皮质裂解物被用作测定对照，以交叉验证 HUVEC 相对于脑组织的蛋白质谱。在 10% 或 18%（对于 APP β-CTF）SDS-聚丙烯酰胺电泳凝胶中，每条泳道运行 50 微克蛋白质。将分离的蛋白质电转移到 Trans-Blot 纯硝酸纤维素膜（Bio-Rad Lab.）上，用 APP 抗体进行免疫印迹（ 22C 11)、APP β-CTF (AHP538)、BACE1、PS1-NTF (ab14)、β-微管蛋白-III、β-肌动蛋白在预先优化的工作稀释度下搅拌 12 小时。膜进一步与辣根过氧化物酶 (HRP) 缀合的山羊抗兔或抗小鼠 IgGs (1:20,000; Bio-Rad Laboratories) 反应，用 预期信用损失 加上蛋白质印迹检测试剂盒，并在随后在暗室中显影的柯达 X-OMAT Blue 放射自显影胶片上曝光。

2.4. APP β-位点切割 (BACE1) 活性测定

在 96 孔透明平底板中重复测量 HUVEC 中的 APP β 位点切割活性（代表 BACE1 酶活性）。如上文针对蛋白质印迹所述，将样品在冰上匀浆，并根据制造商的说明使用商业试剂盒（Calbiochem，La Jolla，CA，USA，目录#565785）测定酶活性。在 Bio-Rad 酶标仪 (PR 3100 TSC) 中捕获荧光信号。

2.5. 培养基中 Aβ 的酶联免疫吸附测定

获得细胞培养基中的 Aβ 水平以估计在不同时间段的培养或不同浓度的胆固醇处理后分泌肽的量。按照制造商的说明（Life Technologies Corporation），使用商业试剂盒（用于 Aβ40 的 Novex ® KHB3482）通过固体夹心酶联免疫吸附测定（ELISA）对培养基进行一式两份测定，以评估 Aβ40 水平。在 Bio-Rad 酶标仪中捕获信号，根据随试剂盒提供的合成肽读数产生的标准曲线计算 Aβ 浓度 (pM/ml)。

2.6. MTT 细胞活力测定

在胆固醇处理实验结束时，按照制造商的说明（Abnova，目录# KA1606，台北市，台湾）。在 Bio-Rad 酶标仪中测量荧光信号，计算细胞活力以比较培养组。

2.7. 量化、统计分析和图形准备

将光密度（蛋白质印迹，使用 NIH-Image J 数字化）和数字数据（APP β 位点切割酶活性、Aβ ELISA 和 MTT 荧光活性的光吸收信号）标准化为内标或对照组。计算比较组的平均值，并使用单因素方差分析和 Bonferroni 的多重比较测试 (Prism GraphPad, San Diego, CA) 进行统计分析。差异显着水平设定为 P < 0.05。人物是用 Photoshop 7.0 组装的，根据需要调整亮度/收缩。

3. 结果

3.1。HUVECs 表达淀粉样蛋白和分泌的 β-淀粉样肽

对来自商业 HUVEC 供应的培养细胞进行免疫细胞化学检查，以验证它们的细胞特征。体外生长 4-10 天的细胞大多为多边形，有时呈梭形，具有短的体突起和突起。所有这些细胞都表达 CD31，一种血管内皮的标志物（图 1 (A)、图 1 (D) 和图 1 (G)）。在双重免疫荧光中，几乎所有表达 CD31 的细胞也与 APP（图 1(A)-(C)）、BACE1（图 1(D)-(F)）[ 20 ][ 32 ]和 PS1-的抗体共标记NTF（图 1（G）-（I））[ 41 ]。

为了检查淀粉样蛋白的生化表达，HUVECs 裂解物与人类皮质裂解物平行印迹（可从我们最近的研究中获得）。相比之下，与脑样本相比，HUVECs 裂解物中的 holo-APP 含量较低，印迹蛋白条带在前者的分子量稍重的位置迁移（图 1（J））。成熟的 BACE1 (~70 Kd) 和 APP β-CTF (~14 Kd) 存在于类似迁移位置的皮质和 HUVEC 裂解物中（图 1 (J)）。β-肌动蛋白的信号在两个测定样品之间具有可比性，而神经元蛋白 β-微管蛋白的信号在皮质中相对于内皮裂解物要强得多（图 1 (J)）。

为了检查 HUVECs 的 Aβ 分泌，用 ELISA 试剂盒测定培养基中 Aβ40（被认为是 CAA 中最丰富的 Aβ 种类）的量。在培养 3 天后收集的培养基的几项初步试验中，发现 Aβ40 水平接近或略高于试剂盒的检测阈值。随后，进行一批培养，使得各个孔保持到不同的时间点，而无需更换/重新供应培养基。因此，测定来自具有细胞培养 2、4、6、8 和 10 天的孔的培养基的 Aβ40 水平。培养基中 Aβ40 的量在培养 2-10 天的组中显示出积累趋势 (图 1 (K))。

3.2. 胆固醇暴露影响培养的 HUVECs 的活力

用滴定浓度从 200 到 6.25 至 mg/dL 的胆固醇和 24 - 48 小时的培养时间进行了初步研究，这表明 6.25 mg/dL 处理相对于 0 mg/dL 处理没有明显影响组，而 200 mg/dL 处理导致大量细胞死亡。因此，设计了正式实验（3 个单独的组）来确定分别在 0、12.5、25、50 和 100 mg/dL 浓度下 48 小时胆固醇共孵育的效果。在治疗结束时，我们使用 MTT 测定在显微镜下评估细胞形态和细胞数量以及它们的活力。对细胞托盘裂解物和培养基进行生化分析，以量化淀粉样蛋白和 Aβ 分泌。

在相差成像显微镜检查中，用 0、12.5 和 25 mg/dL 胆固醇培养的组中的细胞很好地附着在盖玻片上，并显示出健康的形态和相当的密度（图 2(A)-(C)和图 2(A')-(C'))。相比之下，50 和 100 mg/dL 组的细胞出现减少或大量丢失，在显微镜下可见小尺寸圆形轮廓（可能是细胞残骸或碎片），仅可区分少数梭形细胞（图 2 (D) 和图 2 (D')、图 2 (E) 和图 2(E'))。同时，细胞活力受胆固醇共孵育的影响。因此，相对于对照组 (0 mg/dL)，胆固醇治疗组的 MTT 评分显示出剂量依赖性降低 (P < 0.0001, F = 32.6, df = 4, 10, 单因素方差分析)。事后测试（Bonferroni 的多重比较测试）表明 0 mg/dL 和所有其他剂量组之间存在显着差异；12.5 相对于 50 和 100 mg/dL 组之间，以及 25 相对于 50 和 100 mg/dL 组之间（图 2 (F)）。

3.3. 胆固醇暴露影响培养的 HUVECs 的淀粉样蛋白生成能力

总体而言，在用 100 mg/dL 胆固醇处理的组的细胞裂解物中，免疫印迹蛋白的量低于检测水平（或丢失），因此该组不包括在光密度定量中（图 3 (A)） . 与对照组（0 mg/dL）相比，holo-APP 蛋白水平在 12.5 和 25 mg/dL 组增加，但在 50 mg/dL 组降低（P < 0.0001，F = 66.0，df = 3 , 8)，事后检验表明 12.5 与 25 和 50 mg/dL 组以及 25 与 50 mg/dL 组的差异（图 3 (B)）。BACE1 蛋白水平在 12.5 和 50 mg/dL 组中相对于

图1. 培养的人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) 中淀粉样蛋白的表达和 Aβ 的产生。面板 (A)-(I) 显示 HUVEC 在从细胞系初始扩增后 8 天在体外生长，呈现梭形和多边形轮廓，它们表达内皮特征蛋白 CD31 (A) (D) (G)。这些细胞还表现出 β-淀粉样前体蛋白 (APP)（使用 C 端抗体 CT20）、β-分泌酶 1 (BACE1) 和早老素-1 (PS1)（使用 PS1-NTF 抗体 ab14）的免疫荧光。在细胞裂解液 (J) 中，HUVEC 中的 holo-APP 蛋白在相对于人脑皮质裂解液中免疫印迹的对应物稍重的分子位置迁移。BACE1 和 APP β-切割 C 末端片段 (APP β-CTF) 存在于脑和 HUVEC 裂解物中 (J)。请注意，β-肌动蛋白的量在两种类型的裂解物中是相当的，而相对于用作测定对照的人类皮质样品 (J)，HUVEC 裂解物中 β-微管蛋白的量是最小的。通过 ELISA 测定的培养基中 Aβ40 的量随着培养天数 (d) (K) 的延长而增加。(K) 中的插入显示了 ELISA 中 Aβ 浓度和吸光度之间的线性关系。(A) 中的比例尺 = 100 μm，适用于 (B)-(I)。

图 2. 胆固醇暴露对培养的人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) 活力影响的形态学特征。使用同一批细胞培养 HUVEC 4 天，然后在 0 ((A)、(A'))、12.5 ((B)、(B'))、25 ((C) , (C')), 50 ((D), (D')) 和 100 ((E), (E)') mg/dL 浓度，并在处理结束时在相差显微镜下检查。0 - 25 mg/dL 组中的细胞看起来很健康，并且在盖玻片上生长 ((A)-(C)、(A')-(C'))。在用 50 和 100 mg/dL 胆固醇处理的组中，细胞似乎大大减少或基本消失。((D)、(E)、(D')、(E'))。面板 (F) 显示基于 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2 的数据标准化为 0 mg/dL 对照组（定义为 100%）的相对活力评分，5-二苯基溴化四唑 (MTT) 荧光测定。细胞活力呈剂量依赖性下降（P < 0.0001, F = 32.6, df = 4, 10, 单因素方差分析），事后检验显示显着差异（* P < 0.05) 在 25 至 100 mg/dL 组中相对于对照组。

对照组（P < 0.0001, F = 17.3, df = 3, 8），通过事后检验显示 0 组与 25 mg/dL 组以及 12.5 和 25 组与 50 mg/dL 组的差异（图3 (C))。APP β-CTF 水平在 12.5 和 24 mg/dL 组中趋于增加，但在 50 mg/dL 组中相对于对照组降低（P < 0.0001, F = 57.1, df = 3, 8），两者之间有显着差异除 0 与 12.5 mg/dL 组外，每对比较剂量组（图 3(D))。此外，APP β-位点切割酶活性在 12.5 和 50 mg/dL 组中呈现出增加的趋势，而 100 mg/dL 组相对于对照组呈下降趋势（P < 0.0001, F = 32.8, df = 4, 10 ）。事后测试报告了 0 与 25 mg/dL、12.5 与 25 和 100 mg/dL 组、25 与 50 和 100 mg/dL 以及 50 与 100 mg/dL 组的显着差异（图 3（E））。最后，除了 100 mg/dL 组（P < 0.0001, F = 31.0, df = 4, 10），胆固醇治疗组的培养基中 Aβ40 水平相对于对照组升高。对照组相对于 25 和 50 mg/dL 组，12.5 相对于 25 和 50 mg/dL 组，25 相对于 50 和 100 mg/dL 组的事后存在显着差异测试（图3（F））。

4。讨论

4.1。血管内皮 Aβ 的发生及其潜在的药理意义

早期的研究表明，几种血管内皮细胞系，包括 HUVEC 和脑微血管内皮细胞 (BMEC)，表达 Aβ 产生的底物和酶 [ 35 ] - [ 39 ]。这些发现得到了最近对小鼠和人脑制剂进行的体内观察的支持[ 40 ]-[ 42 ]。我们已经证明 APP、β-CTF (C99)、BACE1 和 PS1 蛋白产物可在分离的人动脉内皮细胞的原代培养中检测到 [ 41 ]。根据早期报告，APP770 是血管内皮细胞在蛋白质水平上表达的 APP 同种型的主要变体，而神经元主要表达 APP695

图 3。胆固醇暴露对培养的人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) 淀粉样蛋白生成能力影响的生化特征。面板 (A) 显示来自一组实验的细胞裂解物蛋白的免疫印迹图像，记录了 100 mg/dL 组中的蛋白质损失，其中 APP、BACE1 和 APP β-CTF 的量，但不是 PS1-NTF，明显与对照组相比，12.5 和 25 mg/dL 组增加。定量地，APP (B)、BACE1 (C) 和 APP β-CTF (D) 水平显着升高 ( * ) 或趋于升高 ( #) 在这两组中与对照组相比。与对照组相比，12.5-50 mg/dL 组的细胞裂解物的 β 位点 APP 裂解 (BACE1) 酶活性更高，25 mg/dL 组表现出统计学意义 (E)。相对于对照 (F)，在 12.5-50 mg/dL 组中，培养基中的 Aβ40 水平升高。* P < 0.05 相对于对照。

[ 37 ]。与这一概念一致，在原代人内皮培养物中进行免疫印迹的 holo-APP 蛋白在相对于脑裂解物中的对应物稍重的分子量位置迁移 [ 41 ]。重要的是，来自人类和 AD 转基因小鼠模型的数据表明，脑血管内皮细胞中的 Aβ 过度产生（可能由过度 BACE1 活性介导）可能有助于 CAA 的发展 [ 40 ] - [ 42 ]，尤其是在早期致病阶段 [ 41 ] ] .

在这里，我们已经在形态学和生化上验证了培养的 HUVECs 具有完整的淀粉样蛋白生成生化机制。因此，这些细胞对 APP 和 BACE1 以及为 γ-分泌酶复合物的催化亚基提供服务的 PS1 表现出免疫标记 [ 22 ] [ 55 ]。与原代人血管内皮培养物一样 [ 41 ]，HUVEC 裂解物免疫印迹的 holo-APP 蛋白比脑源性 APP 稍重，这表明前者可能代表 APP770 变体 [ 37 ]。此外，培养的 HUVECs 可以分泌 Aβ 肽，随着时间的推移在培养基中积累，如通过 ELISA 评估的不同培养期间 Aβ40 水平的增加所示。

血管内皮细胞产生 Aβ 的发现可能具有一些意义，特别是在设计拮抗脑淀粉样蛋白发病机制的药物方面。BACE1 和 γ-分泌酶抑制剂/调节剂减弱 Aβ 的过度产生已被探索为 AD 或脑淀粉样蛋白病理学的药理学选择，尽管到目前为止，许多 γ-分泌酶抑制剂的临床试验未能确定治疗益处 [ 56 ]。BACE1 抑制剂似乎很有希望，因为它们阻断了淀粉样蛋白生成途径的初始步骤，并且可以降低 Aβ 和 APP β-CTF 的水平，后者也被认为具有神经毒性 [ 18 ] [ 21 ] [ 57 ] - [ 60] . 然而，新出现的证据也引起了人们的关注，即抑制神经元 BACE1 是否会通过破坏酶的神经生物学作用而导致严重的副作用 [ 61 ]。值得注意的是，最初开发的 BACE1 抑制剂通常不会进入临床试验，因为它们无法通过血脑屏障 (BBB)。在这方面，用脑不可渗透的 BACE1 抑制剂靶向内皮 Aβ 的发生可能不仅在药理学上可行，而且结果证明是一种祝福策略 [ 42 ]。假设，这些抑制剂可以对抗血管壁中 Aβ 的早期上升，保护 BBB 完整性并具有较少的神经元毒性作用，因此可以作为预防剂。

4.2. 胆固醇作为血管 Aβ 过量产生的诱导因子

根据流行病学数据 [ 43 ] - [ 53 ] ，胆固醇长期以来一直被认为是血管性痴呆和 AD 的危险因素。胆固醇通过载脂蛋白 E 及其与细胞表面受体的相互作用在组织/细胞之间运输 [ 46 ]。携带载脂蛋白 E epsilon 4 等位基因 (APOE-ε4) 的个体对 AD 和痴呆症的易感性增加 [ 48 ] [ 51 ]。这些携带与高胆固醇血症有关 [ 43 ] [ 48 ] [ 53 ] 以及脑淀粉样蛋白病理的患病率和严重程度增加，尤其是 CAA [ 2 ] [ 11 ] [ 52] [ 62 ] 。他汀类药物可降低血液中的胆固醇水平，似乎有利于预防 AD 和痴呆症 [ 49 ] [ 63 ]。

鉴于血管内皮位于潜在循环压力因素的第一前沿；确定可能影响这些细胞中淀粉样蛋白生成活性的这些因素是有意义的。如上所述，胆固醇代表了一种感兴趣的候选循环应激因素，以探索其对内皮 Aβ 发生的影响。在本研究中，我们发现培养的 HUVECs 以剂量依赖性双相模式对胆固醇暴露作出反应。在体外测试的较低剂量下，从大约 12.5 到 25 mg/dL，胆固醇暴露通过上调 APP 和 BACE1 而不是 PS1 的表达来增强 HUVEC 中的淀粉样蛋白生成。在较高浓度下，特别是在 50 和 100 mg/dL 时，胆固醇暴露会降低 HUVEC 的活力并导致死亡。高胆固醇暴露引起的细胞毒性与淀粉样蛋白的表达减少（APP、BACE1 和 β-CTF 免疫印迹信号的减少或丢失）和管家蛋白（GADPH 免疫印迹信号的丢失）以及 Aβ 生成减少（降低培养基中的 Aβ 水平），在 HUVECs 中。这些发现表明，升高的血液胆固醇可能是增强血管内皮细胞淀粉样蛋白生成的一个因素。

在临床实践中，高胆固醇血症通常定义为血液总胆固醇浓度大于 200 mg/dL（此截止值可能因医院而异）。在目前的体外环境中，培养的 HUVEC 似乎对外源性胆固醇挑战非常敏感。事实上，在远低于 200 mg/dL 的浓度下，它们已经对胆固醇暴露做出了相当强烈的反应（从增强的 Aβ 生成，甚至到受损的全细胞活力）。在我们的体外实验中观察到的剂量效应反应相对于测试的胆固醇浓度是渐进的。值得注意的是，低浓度处理（12.5 mg/dL 以及在试点研究中测试的 6.25 mg/dL）并未明显损害细胞形态、活力或蛋白质（例如，APP、BACE1 或 β-肌动蛋白）表达的反应。所以，虽然我们的研究结果可能（并且不应该）与临床术语中的高胆固醇血症真正相关（也许对于体外实验来说总是如此），但数据清楚地证明了胆固醇对血管内皮细胞淀粉样蛋白生成的调节作用。将体外研究结果转化为临床相关性需要始终谨慎。考虑到解释的局限性，本研究中获得的结果与理解高胆固醇血症的潜在病理生理作用有关。将体外研究结果转化为临床相关性需要始终谨慎。考虑到解释上的限制，本研究中获得的结果与理解高胆固醇血症的潜在病理生理作用有关。将体外研究结果转化为临床相关性需要始终谨慎。考虑到解释的局限性，本研究中获得的结果与理解高胆固醇血症的潜在病理生理作用有关。

5. 结论

总之，培养的人脐静脉内皮细胞表达了一整套生产β-淀粉样肽的生化机制，并能够将肽分泌到培养基中。这些细胞的淀粉样蛋白生成活性响应于一定浓度范围内的胆固醇暴露而增强，而强烈的胆固醇挑战会降低它们的活力。这些发现表明高胆固醇血症可能作为循环因子促进血管内皮细胞中β-淀粉样蛋白的产生和释放。

致谢

我们感谢 Edward Koo、Huaibin Cai 和 Samuel E Gandy 提供 APP、BACE1 和 PS1-NTF 抗体。本研究得到国家自然科学基金委资助 中国 (#81171160, #31371095) 并获得湘雅医学院生物医学研究伦理委员会批准。作者声明该研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的。

笔记

*通讯作者。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

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