聚精氨酸的皮下持续释放可改善阿尔茨海默病转基因小鼠模型的认知障碍

摘要：聚精氨酸肽是一类很有前途的生物活性化合物，能够穿过血脑屏障 (BBB) 并具有神经保护特性。在这项研究中，我们测试了多聚精氨酸肽在阿尔茨海默氏症三转基因小鼠模型中的活性。s 病。为了确定最佳候选者，我们通过评估记忆获取、长期海马增强 (LTP) 和细胞毒性来检查具有不同长度（R7、R9 和 R11）的化合物的相对神经保护功效。此外，我们探索了数百种关键细胞信号蛋白的表达谱，并对脑样本进行了高含量抗体微阵列比较分析。用聚精氨酸 R9 长期治疗的动物表现出显着改善的记忆获得。该化合物可挽救因 A β恶化的海马 LTP以比本研究中测试的其他药物更好的速度，并诱导参与神经保护和神经可塑性的细胞途径。该治疗提高了小鼠海马中 Synapsin Ia 的表达水平；然而，它对β-淀粉样变性的发生率没有显着影响。聚精氨酸 R9 肽是一种耐受性良好的化合物，可穿过 BBB 并呈现独特的神经保护特性。该物质可阻止小鼠模型中 AD 症状的发展，并可推荐用于临床研究。

关键词：L-精氨酸,记忆, LTP , β-淀粉样蛋白,细胞毒性,凋亡

一、简介

AD 是一种缓慢进展的神经退行性疾病，起病隐匿。该病多发于老年人和女性[ 1 ]。它是痴呆的最常见原因，占所有病例的 60% - 80%。这种疾病以流行的速度传播，全世界已经有超过 4700 万人受到这种疾病的折磨[ 2 ]。到 2018 年，全球痴呆症的成本估计将达到 1 万亿美元 [ 3 ]，这使得该问题的社会负担和重要性堪比癌症 [ 4 ]。标准医疗保健的最新进展导致预期寿命显着延长，随后增加了 AD 发病率。

尽管普通医学取得了最新进展，但尚无有效的治疗方法来治疗该疾病。各种并发症阻碍了有效治疗的开发。一个持续的“挑战”是通过 BBB 提供潜在的代理。通过 BBB 进入大脑的小分子分子量小于 400 - 600 Da [ 5] . 在本研究中，多肽 R7-R11 的分子量范围为 1219.4 至 1916.2 Da，应用于皮下。最近的研究结果表明，聚精氨酸肽能够通过 BBB 在体内全身递送至大脑。一项研究 R11 介导的肽在正常和缺血性啮齿动物大脑中的递送效率的体内动力学研究表明，该肽在全身给药后一小时出现在微血管和大脑周围的神经元中 [ 6] . 肽的信号在两小时后消失；然而，在短暂的大脑中动脉闭塞小鼠模型中，与对侧相比，在给药后长达 8 小时，R11 信号在同侧的细胞中增强并保持可检测到。

近年来，人们对含有聚精氨酸的各种生物活性化合物的兴趣日益浓厚，一些研究表明它们具有强大的神经保护特性 [ 7 ]。在体外谷氨酸兴奋性神经元损伤模型和体内动物中风模型中获得了可靠的数据，表明正肽电荷和精氨酸残基对神经保护至关重要 [ 8] . 已确定聚精氨酸肽具有高度的神经保护作用，其功效与精氨酸含量的增加呈正相关。特别是，假设为了最大限度地保护神经，需要大约 15 个精氨酸残基。据作者称，聚精氨酸在谷氨酸暴露前给药可降低细胞内神经元钙水平。

目前，由富含精氨酸的化合物介导的神经保护的确切机制尚未完全阐明。有证据表明聚精氨酸 R6 可以干扰细胞表面离子通道，尤其是 NMDA 受体 [ 9 ]。元帅等人。优雅地证明了聚精氨酸 R7 及其衍生物能够在完整的视网膜中阻断 NMDA 诱导的半胱天冬酶活化 [ 10] . 这组作者说，聚精氨酸肽对 NMDA 诱导的视网膜神经元死亡的抑制与应激诱导的线粒体内膜电位超极化的减弱有关。作者观察到在 R7 存在下线粒体呼吸的浓度依赖性降低，并假设该肽提供的神经保护是其对靶向线粒体的亲和力以及随后的静息线粒体膜电位 (ΔΨm) 降低的结果。值得注意的是，在没有外源压力的情况下，检测到聚精氨酸产生的 ROS 显着减少。尽管聚精氨酸的线粒体靶点仍未确定，

上述 ΔΨm 的降低似乎对于预防各种神经退行性疾病和 AD 中的细胞凋亡至关重要 [ 11 ]。线粒体膜超极化导致过量的 ROS 产生和相应的细胞死亡。一般来说，线粒体功能障碍被认为在 AD 的发病机制中起重要作用，一些作者将线粒体功能障碍确定为 AD 病理生理学的触发因素 [ 12 ] [ 13 ]。

尽管关于聚精氨酸肽的神经保护作用的确切机制在科学文献中没有达成共识，但最近的数据表明它们能够缓和钙内流，这可能对细胞存活具有破坏性和极其不利的影响 [ 14 ] . 此外，麦克杜格尔等人。已经证明，聚精氨酸 R12 肽的应用降低了谷氨酸受体亚基 NR2B 在神经元细胞表面的表达 [ 15 ]。作者尚未确定负责 NR2B 下调的机制。然而，推测不能排除内吞过程。

我们相信富含精氨酸的肽的神经保护作用可以通过它们的短衍生物来增强，包括 L-精氨酸本身，它是一种半必需氨基酸。有证据表明，AD 患者的死后大脑显示 L-精氨酸水平适度下降 [ 16 ]。因此，精氨酸缺乏可能与该疾病的神经退行性进展有关。经证实，在中风后 30 分钟内服用 L-精氨酸可显着降低中风样症状的频率和严重程度 [ 17 ]。值得注意的是，在老年性痴呆患者的饮食中每天补充 1.6 克 L-精氨酸，持续三个月，可使认知功能提高约 40% [ 18] ; 然而，药物的效果在停止治疗后并没有持续。

在人类中，L-精氨酸通过在 BBB 处表达的 Na +非依赖性阳离子氨基酸转运蛋白 (CAT1) 从循环血液中转运到大脑中 [ 19 ]。已证明大鼠 BBB 中的 L-精氨酸流入转运可饱和，Michaelis-Menten 常数 (km) 值为 56 μM。然而，L-精氨酸的生理血清浓度在啮齿动物（约 170 μM）和人类（约 100 μM）中显着升高 [ 20 ]。此外，哺乳动物的 L-精氨酸主要来自肾脏从头合成和饮食摄入，因此 BBB 的 CAT1 代表了向大脑供应氨基酸的唯一途径 [ 21 ]。尽管精氨酸能够通过 BBB，但其转运蛋白的能力是有限的 [22 ] 。因此，聚精氨酸肽通过 BBB 转运 L-精氨酸是一种有趣的管道，可向大脑提供更多的精氨酸及其衍生物。

我们小组之前已经表明，脑室内给予 L-精氨酸可显着改善 3xTg-AD 小鼠的空间记忆获取，而不会显着降低 β 淀粉样变性的发生率。L-精氨酸对长时程增强 (LTP) 的影响很小或没有影响，并且不能挽救 Aβ 诱导的 LTP 恶化，但是，它会诱导参与神经保护的细胞途径，包括氧化应激保护和防御反应 [ 23 ]。

根据最近发表的研究表明聚精氨酸肽有希望的神经保护特性，我们设计了一项实验，研究并扩大了这些化合物的潜在用途范围，重点是神经退行性疾病。我们测试并比较了不同聚精氨酸肽在 AD 啮齿动物模型中的活性。

行为范式已证明用聚精氨酸 R9 长期治疗的动物的记忆获得显着改善。电生理学数据支持聚精氨酸 R9 肽促进由 Aβ (25-35) 寡聚体恶化的海马 LTP 的假设。此外，我们表明用聚精氨酸 R9 治疗 3xTg-AD 小鼠调节了几个关键的生物过程。

2。材料和方法

2.1。小鼠品系

三重转基因小鼠 (3xTg-AD) 是一种广泛使用的 AD 动物模型，其中包含与家族性阿尔茨海默病相关的三个突变（APP Swedish、MAPT P301L 和 PSEN1 M146V）。小鼠表现出具有斑块和缠结病理学的突触缺陷[ 24 ]。这些动物购自 Jackson Laboratory®，并在我们的动物设施中饲养。所有实验均使用 40 只年龄匹配的 6.5 个月大的雌性小鼠，平均体重为 33 克。已知雌性 3xTg-AD 小鼠对治疗的反应优于雄性（Salvatore Oddo，个人交流）。

所有实验方案均按照以色列卫生部动物实验委员会的指示和巴伊兰大学关于在研究中使用和护理实验动物的指导方针进行，由机构动物护理和使用委员会监督。实验方案经巴伊兰大学动物实验伦理委员会批准（许可证号：3-01-2017）。

在实验之前和期间，将小鼠社会性地圈养在标准塑料笼中，在湿度（30%）和温度（22˚C）受控的房间内，进行 12 小时的反向光/暗循环。随意向动物提供水和食物。

小鼠收到一个唯一的身份号码（耳标），并被随机分配到四个实验组，每组 10 只小鼠（一个用 PBS 给药的对照组，三个实验组，用 PBS 中的各种聚-L-精氨酸溶液处理）。在整个实验过程中每周监测体重。

所有肽均购自 GL Biochem (Shanghai) Ltd.，纯度高于 95%。将肽溶解在浓度为 20 mM 的 PBS (pH 7.4) 中，然后装入 Alzet® 1004 泵胶囊，输送速度为 0.11 µL/h。本研究中使用的肽列于表 1。

2.2. 药物管理和手术程序

使用渗透性微型泵皮下施用聚-L-精氨酸肽和盐水对照溶液。首先，用 1% 异氟醚麻醉动物。用一把剪刀制作用于 Alzet® 泵胶囊的脊髓皮下袋，然后在 DDW 渗透微型泵（Alzet，1004 型，28 天交货）中预激活 24 小时，预填充 100 μl 聚 L-精氨酸（20 mM） ) 在 PBS 或 pH 值为 7.4 的 PBS 中放置在口袋中，并缝合手术切口 (AlzetAutoClip)。该物质的剂量是根据先前公布的数据计算的，其中大鼠以 100 nM/kg 和高达 1 µM 的 R18 静脉内给药，没有任何副作用（单次注射）[ 25 ]。其他研究中使用了 300 nM/kg 的剂量 [ 26] . 我们应用了缓释技术，每小时释放约 63 nM/kg，即每天 1.51 µM/kg（考虑到实验结束时动物的平均体重约为 35 gr）。实验的时间线如图 1 所示。

2.3. 行为测试

2.3.1。情境恐惧条件反射

情境恐惧条件反射是一种基本的条件反射过程，也是一种简单的联想学习形式，其中动物学会将中性刺激的存在，称为条件刺激，如光或音调，与动机显着的存在联系起来。刺激，称为无条件刺激，例如电击 [ 27 ]。在这个范式中，冻结

肽

序列

精氨酸残基/氨基酸

pH 7 时的净电荷

R7

RRRRRR

7/7

7

R9

RRRRRRRR

9/9

9

R11

RRRRRRRRRRR

11/11

11

表 1。研究中使用的聚-L-精氨酸肽。

图 1。实验设计。实验的示意时间表。

行为代表了啮齿动物的典型自然反应。容易评估的缺乏运动提供了记忆采集的读数，并反映了海马体的完整性 [ 28 ]。

使用从 Noldus® 购买的带有防震地板的两个标准腔室进行实验。每个房间有一个 17 × 17 厘米的地板，高 30 厘米，并配备了一个顶部单元，包括一个红外 LED 灯矩阵和一个红外 CCD 摄像机，高通滤波器阻挡可见光。腔室的地板包括一个不锈钢网格（杆间距 0.9 厘米），连接到由特殊软件控制的电击发生器。使用 Noldus® 提供的 EthoVision XT 10 软件进行自动跟踪。连续处理小鼠三天，每天 5 分钟。在第一天，将一只动物放在一个房间里五分钟，并暴露在白色背景噪音中。在调节会话的第二天，小鼠在 2.5、3.5 和 4 时接受了 3 次 2 秒长的 0.75 mA 足部电击。放入腔室后 5 分钟。在测试的第三天，小鼠在没有电击的情况下暴露在相同的调节环境中 5 分钟。EthoVision 软件通过用户预定义的变量控制冲击周期和振幅，以及试验时间和测试区域等实验参数。条件性冷冻被定义为除了呼吸运动之外的不动。对于数据的统计分析，已使用单向方差分析 (ANOVA) 和事后分析，使用上下文冻结的原始冻结分数比较各种治疗组。以及通过用户预定义变量的试验时间和试验区域等实验参数。条件性冷冻被定义为除了呼吸运动之外的不动。对于数据的统计分析，已使用单向方差分析 (ANOVA) 和事后分析，使用上下文冻结的原始冻结分数比较各种治疗组。以及通过用户预定义变量的试验时间和试验区域等实验参数。条件性冷冻被定义为除了呼吸运动之外的不动。对于数据的统计分析，已使用单向方差分析 (ANOVA) 和事后分析，使用上下文冻结的原始冻结分数比较各种治疗组。

2.3.2. 野外实验

开放场实验旨在测试聚精氨酸肽或载体对动物运动活动的影响。该范式是评估探索和运动的最知名的测试之一[ 29 ]。露天迷宫的尺寸为 40 厘米（长）×40 厘米（宽）×40 厘米（高），由白色高密度无孔塑料制成。测试在标准照明的房间中进行。Noldus® 的视频跟踪摄像头和 EthoVision XT 10 软件用于记录和评估鼠标移动。

在测试前让动物适应手术室至少 30 分钟。通过轻轻抓住它的尾巴，将一只老鼠从笼子里取出，放在迷宫的中间。允许它自由和不间断地移动 10 分钟。通过方差分析对迷宫中行进的总距离进行统计分析，然后在 SPSS 22.0 上进行事后 Bonferroni 检验。

带有 Ganz IR 50/50 红外面板的 Panasonic WV-CL930 相机记录了所有行为实验。记录的视频文件由对治疗计划不知情的实验者使用 Ethovision XT 10 软件 (Noldus®) 进行编码和分析。

2.4. 电生理学

为了研究突触可塑性，我们应用了电生理学技术。七只雄性 7 个月大的 C57BL/6 小鼠用异氟醚麻醉并断头。大脑被迅速取出并浸入冰冷的解剖溶液中（以 mM 为单位的浓度：124 NaCl、3 KCl、1.25 NaH 2 PO 4、26 NaHCO 3、1.3 CaCl 2、7 MgCl 2和 10 D-葡萄糖，pH 平衡， 95% O 2 - 5% CO 2 )。使用振动切片机（Leica VT1000S，德国）制备横向海马切片（350 µm 厚）。切片被随机分配到对照组和治疗组，并立即转移到记录溶液中（组成同上，除了 CaCl 2和 MgCl 2浓度，分别调整为 2.5 和 1.3 mM）。切片在水浴中加热至 36°C 40 分钟，然后保持在室温下。将淀粉样蛋白 β 肽 (25 - 35) 溶解在 mQ 水中至 1 mM 储备溶液并冷冻。实验前 24 小时，将 Aβ 肽在人工脑脊液 (ACSF) 中溶解至 50 nM，并在 +4˚C 下孵育以进行寡聚化。在转移到记录室之前，将切片与对照 ACSF、100 μM 的各种聚精氨酸肽或 50 nM Aβ (25-35) 和肽的混合物一起孵育 1 小时。在实验过程中，切片在约 33˚C 下由连续流动（约 4 毫升/分钟）的记录溶液灌注。使用 SliceMaster 系统（Scientifica，UK）进行电生理记录。使用充满记录溶液的玻璃微电极 (1-2 MΩ) 从 CA1 区域的辐射层记录场兴奋性突触后电位 (fEPSP)。基线突触反应由双极电极以 0.033 Hz 的 Schaffer 侧支间隔 50 ms 的成对脉冲刺激引起。调整测试刺激强度以诱发 fEPSP，幅度为最大值的 50%，并在整个实验过程中保持恒定。LTP 是用 4 个 100-Hz 的列车诱导的，间隔 5 分钟。数据由 Spyke 2 (Cambridge Electronic Design Ltd.) 和 SigmaPlot (Systat Software Inc.) 记录和分析。对于基线响应分析，评估了测试刺激期间的纤维齐射幅度和适当的 fEPSP 斜率。LTP 表示为基线 fEPSP 斜率的平均值 ± SEM%。

2.5. 细胞培养

大鼠嗜铬细胞瘤衍生的 PC12 细胞广泛用于神经毒性研究和细胞凋亡检测 [ 30 ]。该系列已广泛用于治疗神经退行性疾病的潜在神经保护剂的大量研究，例如亨廷顿病、帕金森病和 AD [ 31 ] [ 32 ]。

细胞系 (#88022401) 获自 Sigma®。将细胞维持在补充有 10% 胎牛血清、5% 马血清、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素的 DMEM 培养基中，在 37°C 的加湿 95% 空气/5% CO 2培养箱中。

2.6. 肽细胞毒性试验

通过将 PC-12 细胞暴露于含有各种肽浓度的培养基 48 小时来评估 R9 肽的细胞毒性。R9 肽在无菌 PBS 中制备为 1 mM 原液，然后用无血清 DMEM 将溶液稀释至所需浓度。在 MTT 测试中评估细胞毒性。

2.7. 细胞活力测定

通过测量由 MTT 减少产生的甲臜来评估细胞活力。MTT 测定是细胞正常代谢状态的灵敏测量，尤其是线粒体代谢状态，它反映了早期细胞氧化还原变化。因此，甲臜的产生量与活细胞的数量成正比。简而言之，将细胞以 1 × 10 4 个细胞/孔的密度接种在 96 孔聚-D-赖氨酸包被的培养板中，在 37°C 下用含有不同浓度聚精氨酸 R9 的培养基培养 24 小时。用 400 µM H 2 O 2处理细胞超过 24 小时。这些浓度的 Aβ 和 H 2 O 2之前已在许多研究中用于检查 PC-12 细胞的活力 [ 33 ] [ 34 ]。随后，将 MTT 试剂（终浓度，0.5 mg/mL）添加到每个孔中，并将板在 37°C 下孵育 3 小时。孵育结束时，每孔加入 100 μL DMSO。通过在酶标仪 (Infinite® M1000) 中读取 590 nm 处的吸光度来测量甲臜还原产物。细胞活力表示为对照培养物的百分比。

2.8. 免疫组织化学和图像分析

按照标准方案 [ 35 ] 用多聚甲醛溶液对 10 只动物（每组 5 只）进行全动物灌注。] . 取出大脑并在 4°C 下放入 4% 多聚甲醛（Sigma-Aldrich）中 24 小时，然后在 30% 蔗糖（Sigma-Aldrich）中进行 48 小时的低温保护处理。然后将样品速冻并用低温恒温器（徕卡）切割成 30 μm 厚的冠状切片。切片是通过对照的前部（前囟；-1.00 至 -1.46 毫米）、中部（前囟；-1.58 至 -2.30 毫米）和海马后部（前囟；-2.46 至 -3.16 毫米）（n = 5）和聚精氨酸处理的小鼠（n = 5）。用 PBS 中的 10% 正常马血清（载体）和 0.03% Triton™ X-100（Sigma-Aldrich）封闭切片一小时，并用初级单克隆小鼠 6E10 抗淀粉样蛋白 β 抗体（1:100，ENCO ) 在 5˚C 下 24 小时，然后用二抗 Alexa555 山羊抗小鼠 IgG (1:200, Invitrogen) 1 小时，Hoechst (1:5000, Sigma) 3 分钟。在带有汞弧灯和 DAPI 滤光片（激发滤光片 = 350 nm）和两个激光器（激发 = 491 nm 和 561 nm）的直立显微镜 ApoTome（Quorum Technologies）下安装和观察切片。在动物的各种相应的皮质和海马区域检查免疫标记，并用 Zen Blue 2.5 (Zeiss) 软件进行图像分析。

2.9。组织取样

对于脑组织制备，小鼠用 Zoletil (12.5 mg/kg) 深度麻醉，Rompun mix (17.5 mg/kg) 腹膜内给药并断头。他们的大脑（每组 5 个）立即在小鼠大脑切片机矩阵中被切片（500 µm 厚）。从齿状回中取出直径为 0.8 毫米的组织穿孔，并在 -80°C 下冷冻。

2.10。抗体微阵列

根据制造商规范，使用 Kinex KAM-1150E 抗体微阵列 (Kinexus Bioinformatics Corp., Vancouver, BC) 进行“命中”蛋白质表达的评估。如 Kinexus 网页 ( http://www.kinexus.ca/ ) 所述，使用聚精氨酸 R9 和 PBS 处理的小鼠的海马裂解物进行分析。）。简而言之，来自每个样品（100 µg）的裂解物蛋白用荧光染料组合进行共价标记。然后通过凝胶过滤去除游离染料分子。在封闭阵列上的非特异性结合位点后，将孵育室安装到微阵列上以允许加载 2 个样品（一个经过聚精氨酸处理（从五个大脑中汇集），一个经过载体处理（从五个大脑汇集）。孵育后，未结合的蛋白质被洗掉。扫描阵列读取器（Perkin-Elmer）为每个阵列捕获了两个 16 位图像。抗体阵列在四个不同的芯片上并行进行。阵列的输出包含平均值归一化净信号，它是根据微阵列上每种抗体可用的四个归一化净信号值确定的平均值。标准偏差表示微阵列上每种不同抗体的全局标准化信号强度值的四个单独测量值的标准偏差。标准偏差百分比是微阵列上每种不同抗体的全局标准化信号强度值的四次单独测量中的标准偏差百分比。数据显示为对照变化 (CFC%)。100% 的值对应于处理后信号强度增加 2 倍。负 CFC 值表示所选对照的信号强度降低程度。标准偏差百分比是微阵列上每种不同抗体的全局标准化信号强度值的四次单独测量中的标准偏差百分比。数据显示为对照变化 (CFC%)。100% 的值对应于处理后信号强度增加 2 倍。负 CFC 值表示所选对照的信号强度降低程度。标准偏差百分比是微阵列上每种不同抗体的全局标准化信号强度值的四次单独测量中的标准偏差百分比。数据显示为对照变化 (CFC%)。100% 的值对应于处理后信号强度增加 2 倍。负 CFC 值表示所选对照的信号强度降低程度。

每个参数都有自己的学生 T 检验 p 值，即控制样本和测试样本之间没有差异的概率 (p) 值。p 值由每组中的 N = 4 个测量值确定，这些测量值是成对的和双尾分布的。p 值 0.05 或更小被视为统计上有效的变化。

2.11。使用 DAVID 生物信息学资源对微阵列数据进行功能解释

使用 DAVID Bioinformatics Resources 网络服务器分析微阵列数据，用于基因列表的功能解释。我们使用了优先基因列表，定义为与对照相比至少有 20% 的变化和 p 值 < 0.05，以识别显着丰富的 KEGG、Reactome 和 Biocarta 途径和 GO（基因本体）。Cytoscape 和 STRING ( http://www.string-db.org ) 用于对已识别术语进行拓扑分析和网络可视化。

2.12. 蛋白质印迹

为了研究治疗对 β-淀粉样变性发生率的影响，我们检测了海马裂解物的 A11 免疫反应性。A11 是一种抗体，可检测淀粉样蛋白寡聚体的构象，无论其氨基酸序列如何 [ 36 ]。抗淀粉样蛋白抗体 A11 NN198-1 用于鉴定寡聚形式。为了研究神经可塑性的突触前成分，我们量化了与突触小泡神经元磷蛋白相关的 Synapsin 1 表达率的变化 [ 37 ]。选择抗体 NN171-2 来检测 Synapsin 异构体 1a。

使用 Bradford 测定法 (Bio-Rad, Hercules, CA) 测定蛋白质浓度。如制造商所述，通过 KinetworksTM Custom Multi-Antibody Screen KCSS-1.0 (Kinexus Bioinformatics Corporation) 分析来自五个大脑（每组）的 15 µg 混合海马裂解物。简而言之，KinetworksTM 分析涉及通过 SDS-PAGE 对单个裂解物样品的分辨率以及随后使用经过验证的抗体进行免疫印迹。使用 ECL 检测系统检测与硝酸纤维素膜上的靶抗原结合的抗体。

2.13. 统计分析

使用 Windows 的 SPSS（版本 22，IBM，Armonk，NY）进行统计分析。显着性设定为 95% 的置信度。所有结果均表示为带有标准误差的平均值。使用 Shapiro-Wilk 检验显示数据符合正态分布，并且 Levene 检验用于确认被比较组之间的相等方差。

关于行为测试，通过单向方差分析和事后 Bonferroni 测试在组之间比较平均值。通过 ANOVA 分析生存力数据，然后进行事后 Bonferroni 检验，p < 0.05 值被认为具有统计学意义。实验至少独立重复两次。在 LTP 研究中，单向方差分析用于确定组之间的显着差异，然后是 Bonferroni 的事后进行多重比较。

所有数据均以平均值表示。在整个文本和条形图中，变异性由平均值的标准误差 (SEM) 表示。

3. 结果

3.1。聚精氨酸肽部分挽救 Aβ 介导的海马 LTP 损伤

长时程增强 (LTP) 是在大脑和海马的不同区域发现的活动依赖性可塑性的一个例子。LTP 是一种有价值的助记过程模型，有助于研究学习和记忆获取的各种基质 [ 38 ]。许多研究组表明，Aβ (25 - 35) 会损害海马突触可塑性 [ 39 ]。我们应用了相同的模型并检查了 Schaffer 侧枝 CA1 突触的 LTP。我们首先证实，在我们的记录条件下，用外源 Aβ (50 nM) 处理野生型小鼠海马切片会导致 LTP 显着受损。在用 Aβ 预处理的切片中，LTP 几乎完全被阻断（图 2(a)-(c))。为了研究各种聚精氨酸肽对 LTP 和 Aβ 诱导的 LTP 失败率的影响，用 100 μM 的 R7、R9 和 R11 处理脑切片。在所有情况下，标准化的 fEPSP 斜率通过药剂处理显着降低。值得注意的是，与其他化合物相比，R11 肽对 LTP 的影响最小（仅减少约 16%）。R11 的图形在整个过程中与控制收敛（图 2 (c)）。

为了检查聚精氨酸肽对 Aβ 介导的海马 LTP 损伤的可能影响，我们测试了它们在 Aβ 存在下的影响。R7 肽处理对 LTP 率没有显着影响，而 LTP 因 Aβ 处理而恶化（图 2（a），图 3(b))。R9 和 R11 治疗的效果显着（p < 0.001），但 R9 比 R11 更有效地挽救了 LTP。为了更好地可视化效果，我们比较了聚精氨酸和 Aβ 处理的切片之间记录的 fEPSP 的距离，以及在实验 30 分钟期间从 Aβ 处理的切片记录的 LTP。对未经任何处理的对照切片记录的 LTP 进行了相同的分析。R9 和 Aβ 处理的切片显示 LTP，与 R7 和 R11 相比，它显着 (p < 0.001) 更接近于对照。分析总结显示在（图 3 (a) 和图 3 (b)）中。

R9聚精氨酸似乎具有最高级的保护特性。与其他测试化合物相比，它以更好的方式挽救了 Aβ 介导的海马 LTP 损伤。

3.2. 多聚-l-精氨酸肽 R9 的皮下慢性给药显着改善 3xTg-AD 小鼠的记忆获取，而不影响运动活动

在旷野迷宫中评估实验动物的探索性运动活动。我们没有观察到治疗对 10 分钟期间的运动速率和总运动距离的任何显着影响（数据未提供）。

应用情境恐惧条件反射来研究治疗对 3xTg-AD 小鼠学习和记忆功能速率的影响。最初的

图 2。海马 Schaffer 侧枝-CA1 LTP 记录在 (a) R7 处理的切片、(b) R9 处理的切片、(c) R11 处理的切片中。误差线是 SEM，n = 7。

第 1 天的适应期允许适应实验环境并减少定向反应。没有显着差异

图 3。在记录的 30-120 分钟内，用各种聚精氨酸肽、老化 Aβ 和控制切片 (a) 仅 Aβ 处理的切片 (b) 处理的标准化 fEPSP 斜率之间的差异。误差线反映 SEM。最后 30 分钟的统计分析显示，治疗对 Aβ 和聚精氨酸的 fEPSP 斜率之间的差异有显着影响，Aβ 处理的切片由单向方差分析确定 (F(3,236) = 1156.861, p = 0.000)。R9 肽的作用比其他测试化合物的作用显着 (p < 0.001) 大 25% - 50%。

在这一天检测到的基线冻结。训练后 24 小时测试小鼠的冷冻行为。与对照组相比，用各种聚精氨酸肽处理的动物表现出增加的冷冻时间（图 4）。然而，只有用 R9 肽处理显示出显着效果。

3.3. 聚精氨酸 R9 无毒，但对培养的 PC-12 细胞中过氧化氢诱导的细胞毒性具有保护作用

我们首先在 48 小时暴露时间后检查了 PC-12 培养物中不同浓度（5、10 和 50 µM）的 R9 肽的细胞毒性作用（图 5 (a)）。与未处理的培养物相比，暴露不会导致细胞死亡的任何显着增加。

为了研究聚精氨酸 R9 对 H 2 O 2应激培养的 PC12 细胞中细胞活力的影响，将细胞与不同浓度的肽预孵育 24 小时，并用 400 µM H 2 O 2再应激24 小时. 治疗诱导形态剂量依赖性改变，这在光学显微镜下很明显（数据未显示）。通过MTT法评估诱导细胞死亡的相对率。

如图（图 5 (b)）所示，在 24 小时内用 400 µM H 2 O 2培养细胞会导致存活率下降，而在培养基中添加 R9 肽可部分逆转这种情况。

先前在另一个体外细胞毒性模型中证明，5 µM 的 R9 提供了足够的保护作用，这与 10 µM [ 8 ] 没有显着差异。我们的研究结果与这个结果一致。

图 4。情境恐惧条件反射。对照组（n = 10）和聚精氨酸处理的小鼠（每组 n = 10）的平均冷冻水平（±SEM）。ANOVA 和事后 Bonferroni 检验用于确定对照组和实验组之间的冷冻时间是否存在差异。通过单向方差分析 (F(3,36) = 3.026, p 值 = 0.042) 确定，治疗对冷冻时间有显着影响。Bonferroni 的多重比较检验揭示了对照组和 R9 治疗组之间的显着差异 (p < 0.05)。

图 5. (a) R9 对 PC12 细胞活力的影响。将 PC12 细胞暴露于不同浓度的 R9 肽（0、5、10 和 50 μM）中 48 小时，然后使用 MTT 方法评估细胞活力。所有结果与对照值没有显着差异（表示为 100% 存活率），并且具有不同聚精氨酸浓度的实验组之间没有显着差异。(b) 聚精氨酸 R9 保护 PC12 细胞免受氧化损伤。培养 PC12 细胞并与不同浓度的 R9 肽（0、5、10 和 50 μM）预孵育 24 小时。过氧化氢 (400 µM) 用于诱导氧化损伤。在过氧化氢处理后 24 小时测量活力。没有过氧化氢的细胞的存活率被指定为100%。结果表示为平均值±SEM（每个浓度n = 48）。由单因素方差分析确定的对照组和实验组之间存在统计学上的显着差异 (F(3,188) = 22.31, p < 0.0001)。治疗组之间的差异无统计学意义。

3.4. 聚精氨酸 R9 肽的短期治疗对 3xTg-AD 小鼠细胞内 β-淀粉样变性的发生率没有显着影响

3xTg 小鼠表现出斑块和缠结病理学。Aβ 沉积的特征是早在 3 至 4 个月大时，海马、额叶皮层和杏仁核中的细胞内进行性免疫反应。细胞外 Aβ 斑块在 6-7 个月时出现 [ 24 ]。为了比较各组之间的 Aβ 免疫反应率，我们用特异性 6E10 抗体对大脑进行染色。我们观察到海马、杏仁核和 L4-L5 皮质的广泛细胞内沉积（图 6）。海马区有数个细胞外斑块。定量分析未显示对照组和实验组之间海马皮质、hili 和 CA3 区域 6E10 免疫阳性水平的显着差异。然而，我们确实注意到用 R9 聚精氨酸组治疗的免疫反应率没有显着降低约 15%（图 6 (e) 和图 6 (f)）。

图 6。6E10 抗体可显示脑 Aβ 沉积物。来自 R9 处理的小鼠的皮层 (a, b) 的代表性切片 (20 倍放大倍数) 在 III-IV 层、CA3 (c, d) 区域中具有强烈沉积。插图代表 100 倍放大倍率（用 DAPI 和 6E10 双染色）。使用 Zen Blue 2.5 (Zeiss) 在 0.02 mm 2的区域内评估荧光强度，手动设置阈值，不同脑区 Aβ 免疫反应性的平均百分比显示为条形图 (e, f)，平均值为 ± SEM ( n = 每组五只动物的 25 个部分）。

3.5. 用 R9 治疗不影响神经毒性寡聚 Aβ 的组成

抗寡聚抗体 (A11) 对 Aβ 的寡聚形式具有特异性，用于测量海马裂解物中前原纤维毒性物质的水平。肌动蛋白标准化迹线的量化分析仅检测到 Aβ 寡聚体水平轻微降低 2.34%（图S1）。

3.6. 聚精氨酸 R9 提高 Synapsin Ia 的表达率

突触素 1 亚型 Ia 是一种与突触小泡神经元磷蛋白的细胞质表面相关的一种，它通过控制突触前末端的突触小泡动力学来调节突触传递，特别是在 GABA 能突触中 [ 40 ]。秦等人。证明了其在 AD 患者的海马形成中的相对区域缺陷 [ 41 ]。我们观察到用聚精氨酸 R9 治疗的动物海马中这种蛋白质的水平显着增加了 34%（图 7）。

3.7. 聚精氨酸 R9 治疗诱导参与神经可塑性和氧化应激保护的细胞通路

使用 DAVID 对源自抗体微阵列分析的基因进行功能解释。有 65 种显着上调和下调的蛋白质表达变化超过 15%（补充表S1）。

微阵列分析（由 DAVID Bioinformatics Resources 网络服务器提供，预设阈值为 20% 变化）显示，用 R9 聚精氨酸治疗 3xTg-AD 小鼠导致了几个关键生物过程的正向调节，包括免疫系统过程、氮化合物代谢

图 7。（一个）。使用 NN171-2 抗体对 Synapsin Ia (MW ~67 kDa) 进行蛋白质印迹分析。(b) 条形图显示对照组和实验组中肌动蛋白标准化痕量突触蛋白 Ia 免疫阳性。用 R9 处理导致 3xTg 小鼠海马中 Synapsin Ia 的表达水平显着增加 34%。

过程和生物合成过程。此外，DAVID还指出了其他30条影响细胞存活和神经可塑性的通路，包括对含氧化合物的反应、TNF信号通路、催乳素信号通路和AKT信号通路（图8（a））。

在针对 Aβ 诱导的细胞毒性的保护方面，对含氧化合物途径的反应似乎非常有趣。我们证明聚精氨酸 R9 对培养的 PC-12 细胞的氧化损伤具有保护作用。生物信息学方法为我们提供了有关 13 种相互关联的蛋白质的信息，这些蛋白质的表达水平显着上调或下调，这些蛋白质参与了这一重要的生物过程。在实验组中，MAPK/ERK 双特异性激酶 6 的表达水平增加了 32%。此外，接受治疗的动物大脑中的超氧化物歧化酶 [Cu-Zn] 水平升高了 41%。这些酶在细胞对含氧化合物的反应中起关键作用。在具有 NMDA 兴奋性毒性损伤的大鼠模型中令人信服地证明了这一点，42 ] 。我们最近在用精氨酸酶抑制剂 L-正缬氨酸治疗的同一 AD 模型中获得的数据表明，超氧化物歧化酶 [Cu-Zn] 水平升高，通过

图 8。(a) 通过 David 分析确定的生物途径列表（阈值为 20% 的变化）。（ b ）被鉴定为由在 Cytoscape 中绘制的治疗途径诱导的蛋白质之间的相互作用（CFP 与对照的变化％）。突出显示的丰富术语和相关的差异表达蛋白质。显示的是具有至少 20% 阳性或阴性 CFC 且 p 值 < 0.05 的差异表达蛋白质。STRING 用于在 Cytoscape 中构建物理和功能性蛋白质-蛋白质关联网络。

大约 20%，在接受治疗的动物的大脑中。L-norvaline 通过降低精氨酸酶的利用率来提高 L-精氨酸的生物利用度。为动物提供聚精氨酸，我们也提高了精氨酸的生物利用度。因此，机制可能是相同的。

前列腺素 G/H 合酶 2 是另一种酶，它在 AD 脑中表现出降低的表达水平 [ 43 ]，但在用聚精氨酸 R9 治疗后表现出 18% 的升高。此外，NF-kappa-B α 抑制剂在实验组中表现出增加（25%）。宋 S. 等人。已经表明，NF-kappa-B 的抑制显着降低了 AD 小鼠的淀粉样蛋白病理学 [ 44 ]，因此我们的治疗可能通过这些机制起作用。

有六种表达水平显着上调/下调的蛋白质代表催乳素信号通路。一般来说，催乳素通过激活各种细胞机制和途径具有神经保护特性 [ 45 ]。我们观察到磷脂酰肌醇 3-激酶调节亚基 α 的表达率显着（p 值等于 0.007）升高了 28%。于等人。证实这种激酶在防止 H 2 O 2诱导的神经元退化中发挥作用[ 46 ]。此外，p44 MAP 激酶水平降低了 34%。默里等人。证明在癫痫发作活动的细胞培养模型中，抑制这种激酶可以保护海马神经元 [ 47 ]。

为了可视化分子相互作用网络和生物途径，应用了 Cytoscape ( http://www.cytoscape.org )。我们建立了一个功能图，将蛋白质表达的差异变化和网络连接性的变化与生物通路联系起来（图 8（b））。

值得注意的是，与载体处理的小鼠相比，17 种调节蛋白在聚精氨酸处理的动物中表现出非常显着和显着的表达水平变化（范围从 30% 到 65%）（补充表S1）。几种显着上调的蛋白质与神经可塑性高度相关，并且公开了 Aβ 保护。例如，钙网蛋白的表达水平在聚精氨酸处理组中增加了 42%。这种多功能蛋白在内质网的腔中充当主要的 Ca 2+结合蛋白。钙网蛋白通过与细胞表面的 γ-切割位点结合而与 APP 相互作用，影响 γ-分泌酶对 APP 的切割，从而减少 Aβ 的产生 [ 48 ]。

此外，有几个直接参与突触传递和可塑性蛋白，它们显示出通过治疗水平的表达显着上调。特别是，代谢型谷氨酸受体 V 水平升高了 29%。另一种谷氨酸受体 NMDA 1 增加了 21%，NMDA 2A 增加了 16%。

此外，促进突触可塑性、神经元分化、避免程序性细胞死亡的 BDNF/NT-3 生长因子受体和神经生长因子 NGF 受体-酪氨酸激酶在聚精氨酸处理的小鼠中显示出升高了约 15% 的水平. 值得注意的是，这些因素显示了 AD 患者的减少 [ 49 ]。

4。讨论

本研究继续并扩展了最近的发现，详细说明了各种聚精氨酸肽的神经保护特性。我们的研究结果首次证明了聚精氨酸在 AD 小鼠模型中的体内显着治疗效果。特别是，我们报告在 3xTg-AD 小鼠中用 R9 肽皮下治疗 4 周后记忆获得显着改善。在用 R7 和 R11 治疗的小鼠中，这种效果并不明显。

在促进神经可塑性方面，我们还证明聚精氨酸肽在老年 Aβ (25 - 35) 存在下具有升级海马 LTP 的能力。我们的比较研究使用了 R7、R9 和 R11 肽。我们证明，在 AD 的离体模型中，聚精氨酸 R9 具有独特的神经保护特性。它以比其他测试药物更好的速度拯救被 Aβ 恶化的海马 LTP。

我们在体外细胞毒性模型中测试 R9，结果表明该物质无毒。此外，我们证明 PC12 细胞与 5 μM 的 R9 预孵育可显着减轻过氧化物诱导的细胞毒性。

尽管对介导 Aβ 诱导的突触传递障碍的精确分子机制缺乏共识，但最近有几项发现表明 Aβ 寡聚体干扰突触前末端的囊泡运输 [ 50 ]。值得注意的是，有强有力的数据表明 Synapsin I 参与了 Aβ 诱导的突触缺陷 [ 51 ]。

一般来说，突触蛋白是突触小泡动力学的关键调节因子 [ 40 ]。Synapsin I 是一种突触前蛋白，它调节从 GABA 能神经元末端释放的突触小泡的可用性和准备情况，尤其是 [ 52 ]。我们的 WB 结果表明，用 R9 肽处理可使小鼠海马中 Synapsin Ia 的表达水平提高 34%。值得注意的是，通过更敏感的抗体阵列获得的数据证实了这种增长，然而，显示相同蛋白质的表达水平增加了 21%，p 值为 0.005。因此，我们推测该药物通过突触前机制促进突触可塑性。

此外，抗体微阵列分析表明，用聚精氨酸 R9 处理会导致几个重要的生物过程上调，包括免疫系统过程、氮化合物代谢过程和生物合成过程。此外，我们还公开了 30 条其他与细胞存活和神经可塑性有关的生物通路，包括对含氧化合物的反应、TNF 信号通路、催乳素信号通路和 AKT 信号通路。

我们的测定提供了有关 18 种调节蛋白的信息，与载体处理的小鼠相比，它们表明聚精氨酸处理组的表达水平发生了充分的变化（范围从 30% 到 65%）。特别是，我们强调钙网蛋白表达水平的增加（增加 43%），它通过 γ-分泌酶对 APP 的切割产生负调节作用，从而减少 Aβ 的产生 [ 48 ]。潜在地，观察到的这种Ca 2+结合蛋白表达水平的放大可能导致治疗动物海马中Aβ寡聚形式的减少。我们试图通过用 A11 抗体对海马裂解物进行蛋白质印迹来证实这一点。然而，仅检测到轻微的 2.34% 减少。

根据目前的文献，在AD进展过程中，神经元维持氧化还原平衡的能力严重下降，导致线粒体功能障碍、自由基积累和神经元损伤[ 53 ]。同样，在 AD 的转基因小鼠模型和离体实验中，使用取自 AD 患者的死后脑组织，Aβ 沉积物与自由基的产生直接相关 [ 54 ]。

在讨论自由基在 AD 发病机制中的作用的背景下，我们指出实验组中超氧化物歧化酶 [Cu-Zn] 水平显着增加。这种酶通过催化超氧化物自由基的歧化，在细胞对含氧化合物的反应中起关键作用。它胜过超氧离子的有害影响，并保护神经元免受超氧毒性 [ 55 ]。我们表明，在接受治疗的动物的海马体中，这种酶的水平升高了 41%。佩鲁夫等人。证明这种酶的过表达会导致神经保护并改善功能结果 [ 42] . 我们最近在用精氨酸酶抑制剂 L-正缬氨酸治疗的同一 AD 模型中获得的数据表明，接受治疗的动物大脑中的超氧化物歧化酶 [Cu-Zn] 水平升高了约 20% [ 56 ]。L-norvaline 通过降低精氨酸酶的利用率来提高 L-精氨酸的生物利用度。为动物提供聚精氨酸，我们也提高了精氨酸的生物利用度。因此，机制可能是相同的。因此，我们认为观察到的用聚精氨酸治疗的动物的表型可能部分由超氧化物歧化酶表达水平的升高来解释。

以前的研究假设聚精氨酸肽具有高度的神经保护作用，其功效与精氨酸含量的增加有关 [ 8 ]。梅洛尼等人。建议，为了在缺血性中风啮齿动物模型中获得最大的神经保护，大约需要 15 个精氨酸残基。此外，梅洛尼等人。已经证明，聚精氨酸肽和其他富含精氨酸的肽在谷氨酸暴露前给药时会降低细胞内神经元钙水平 [ 7 ] [ 8 ]。

Ferrer-Montiel 等人提供的进一步证据。支持聚精氨酸通过靶向细胞表面离子通道和 NMDA 受体来干扰钙动力学的假设，特别是 [ 9 ]。此外，Marshal 等人。证明聚精氨酸 R7 及其衍生物能够阻断 NMDA 诱导的半胱天冬酶活化，进而导致细胞凋亡率降低 [ 10 ]。因此，聚精氨酸肽减少毒性神经元钙内流的能力可能会减轻细胞内钙升高的下游破坏作用，例如半胱天冬酶活化和线粒体和氧化应激。

我们验证了用 R9 聚精氨酸肽治疗 3xTg-AD 小鼠导致动物海马中 caspase-6 水平显着（p 值 = 0.032）降低 15%。这种酶在神经退行性过程中起着至关重要的作用。它负责 APP 的替代非分泌酶处理，并在 AD 的早期阶段被激活 [ 57 ] [ 58 ]。因此，近年来，caspase-6被指出为治疗AD的新靶点[ 59 ]。

麦克杜格尔等人。已经证明，聚精氨酸 R12 肽的应用会降低谷氨酸受体亚基 NR2B 在神经元细胞表面的表达 [ 15] . 我们的结果支持这样的假设，即聚精氨酸肽的作用与神经元兴奋率和细胞内钙动力学的精细调节密切相关。最初设计的电生理实验证实聚精氨酸肽能够诱导 LTP 损伤。然而，他们部分挽救了被 Aβ 降低的 LTP。此外，抗体微阵列分析表明聚精氨酸会干扰各种离子通道的表达速率。它将电压依赖性钙通道 gamma-2 亚基的水平降低 12%，并将谷氨酸离子型受体 NMDA（亚基 epsilon-1 和 zeta-1）的表达水平提高约 20%。另一种谷氨酸受体-代谢型谷氨酸受体 5 (mGluR5) 的表达水平显着提高了 30%。需要进一步的研究来破译聚精氨酸调节它们的确切机制。

作为对多聚精氨酸肽的神经保护作用潜在机制的深入了解，我们假设它们是 L-精氨酸本身的额外来源。精氨酸缺乏与 AD 的神经退行性进展有关。此外，它的给药显着降低了中风样症状的频率和严重程度 [ 17 ]，并且在老年性痴呆患者的饮食中补充它可以提高认知功能 [ 18 ]。

大脑中有几种活跃的胰蛋白酶样蛋白酶，它们能够处理聚精氨酸。例如，神经蛋白酶已被充分表征并显示水解细胞外基质成分并调节健康大脑的学习和记忆[ 60 ]。因此，我们认为，聚精氨酸为大脑提供了额外数量的氨基酸，这可能是至关重要的，因为其转运蛋白的能力有限。

总之，我们强调带正电荷的富含聚精氨酸的化合物能够与各种带负电荷的生物活性分子相互作用。例如，它们与极负性蛋白聚糖结合，这在 AD 的发展中发挥作用 [ 61 ]。雪等人。证明了在神经炎斑块中存在硫酸乙酰肝素蛋白聚糖 [ 62 ]。因此有人提出，抑制淀粉样蛋白和蛋白多糖之间的相互作用可以防止 AD 发展 [ 63 ]。我们提出干扰 Aβ-蛋白多糖相互作用可能是 R9 介导的 AD 发病机制调节的可能机制。

5. 结论

尽管我们的研究存在一些局限性，但本研究推进了对各种含聚精氨酸的化合物的神经保护特性的认识，尤其是神经退行性疾病和 AD。我们指出，聚精氨酸肽代表了一组有前途的神经保护分子，具有多种潜在的生物学特性，可用于治疗一系列神经退行性疾病。需要进行额外的研究以发现该物质的最佳浓度，以提供最佳的神经保护。同样，其他 AD 模型可用于验证结果、阐明和确认精确的神经保护机制。

致谢

这项研究得到了 Marie Curie CIG 赠款 322113、Leir 基金会赠款、Ginzburg 家庭基金会赠款和 Katz 基金会对 AOS 的赠款的支持。电生理实验得到了俄罗斯科学基金会 (RSF; 授权号 14-25-00072) 的支持。我们非常感谢 Basem Hijazi 先生在统计分析中提出的宝贵建议。

补充

#

带别名的目标名称

完整的目标蛋白名称

% 氟氯化碳

p值

1

p38a MAPK（MAPK14；CSBP；MXI2；SAPK2a）

丝裂原活化蛋白丝氨酸激酶 p38 α

65.44

0.007

2

EPM2A (LAFPTP酶)

拉福林

57.01

0.044

3

Hsc70（HSPA8；Hsc70；HSP73；HSPA10）

热休克同源 71 kDa 蛋白

50.76

0.011

4

PKCq (PRKCQ; PKC-θ)

蛋白丝氨酸激酶 C theta

46.24

0.013

5

NFkappaB p50

NF-kappa-B p50 核转录因子

44.90

0.015

6

REEP2 (SGC32445)

受体表达增强蛋白2

42.89

0.024

7

钙网蛋白（CALR；钙调蛋白；grp60；HACBP）

钙网蛋白

42.81

0.002

8

SOD1 (hSod1)

超氧化物歧化酶 [Cu-Zn]

41.05

0.004

9

LGI1（表观蛋白-1）

富含亮氨酸的胶质瘤灭活蛋白 1

36.63

0.010

10

PANX2

Pannexin-2

32.00

0.003

11

MKK6（MAP2K6；MEK6）

MAPK/ERK 双特异性激酶 6

31.71

0.035

12

AHSA1 (AHA1)

90 kDa 热休克蛋白 ATPase 同源物 1 的激活剂

30.61

0.008

13

PKCH (PRKCH)

蛋白激酶 C eta 型

30.27

0.012

14

CDC25C

双特异性蛋白磷酸酶25C

29.78

0.015

15

mGluR5（GRM5；GPRC1E；MGLUR5）

代谢型谷氨酸受体5

29.12

0.006

16

PP2A/Ca (PPP2CA)/'PP2A/Cb (PPP2CB)

蛋白丝氨酸磷酸酶 2A 催化亚基 α 和 β 亚型

28.89

0.019

17

PIK3R1 (PI3K p85)

磷脂酰肌醇 3-激酶调节亚基 α

27.76

0.007

18

MKNK2 (MKNK2)

MAP激酶相互作用的丝氨酸-苏氨酸激酶2

27.47

0.015

19

HSP40（DNAJB1；DNAJ1；HDJ1；HSPF1）

DnaJ 同源亚家族 B 成员 1

26.60

0.039

20

伊克巴

NF-kappa-B α (MAD3) 抑制剂

24.56

0.022

21

PTP1D（PTPN11；PTP2C；SHP2；SHPTP2；Syp）

蛋白酪氨酸磷酸酶，受体 1D

22.95

0.041

22

STAT5A

信号转导和转录激活因子 5A

22.73

0.022

23

突触素 1

突触素 1 亚型 Ia

20.89

0.005

24

GRIN1 (NMDAR1)

谷氨酸受体离子型，NMDA 1

20.63

0.036

25

SGK3

血清/糖皮质激素调节激酶 3

19.49

0.038

26

NPM1 (B23)

核磷蛋白

18.97

0.006

27

mTOR (FRAP)

哺乳动物雷帕霉素靶点

18.90

0.011

28

Raf1 (c-Raf)

Raf1原癌基因编码的蛋白丝氨酸激酶

18.26

0.026

29

KHS1（MAP4K5；KHS）

与 SPS1/STE20 同源的激酶

17.98

0.038

30

ATAD1 ATP酶

ATPase 家族 AAA 结构域蛋白 1

17.81

0.039

31

Mat1 (MNAT1)

CDK激活激酶组装因子MAT1

17.81

0.039

32

COX2

前列腺素 G/H 合酶 2

17.59

0.020

表 S1。用 KAM-1150E 抗体微阵列数据分析的样品信号强度的全局标准化值。与载体处理的小鼠相比，显示聚精氨酸处理的动物的表达水平发生显着（p 值 < 0.05）变化（≤ 或 ≥15%）的蛋白质列表。CFC 代表对照变化百分比（处理与对照）。最后一列显示学生 T 检验 p 值。

图S1。(a) 用对 Aβ 寡聚体 (MW ~50 kDa) 特异的 A11 抗体表示蛋白质印迹，(b) 用 β-肌动蛋白 (MW ~41 kDa) 进行对照印迹，(c) 条形图显示 A11 的肌动蛋白标准化痕量对照组和实验组的免疫阳性。

笔记

*这些作者同等贡献这项工作。

利益冲突

作者声明与本文的发表没有利益冲突。

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