椰子幼叶愈伤组织的诱导

摘要：本研究旨在研究来自幼叶外植体的椰子 cv MATAG 的体外愈伤组织诱导。来自成熟椰子的幼叶片段在补充有不同浓度的 2,4-D以及 NAA 和 BAP 组合的 Y3 培养基上培养。这些植物生长调节剂 (PGR) 中的每一种对愈伤组织形成、产生愈伤组织的外植体百分比、愈伤组织增殖百分比和愈伤组织形态都有不同的反应。一系列不同浓度用于 2,4-D (1, 5, 10, 20, 40, 60, 100 mg/L), NAA (1, 3, 5 mg/L) 和 BAP (1, 3, 5 毫克/升）分别。使用 2,4-D 治疗的愈伤组织形成天数范围为 7 - 12 个月，而 2,4-D 结合 NAA 记录在 2 - 5 个月。尽管这些植物生长调节剂用于愈伤组织形成的月份不同，但产生愈伤组织和愈伤组织增殖的外植体百分比是不同的。在 2,4-D (40 mg/mL) 观察到最高百分比的外植体产生愈伤组织 (2.9%)，其次是在 2,4-D (10.0 mg/mL) 和 NAA (1 mg/mL) 时为 2.7% . 在 100 mg/mL 的 2,4-D 浓度下，也发现了最高百分比的愈伤组织增殖。

关键词

愈伤组织诱导,椰子, NAA , 2 , 4-D

一、简介

椰子树，或学名Cocos nucifera，在过去几年中因其自身的益处而受到关注，例如其对社会的营养和健康特性。Cocos nucifera被认为起源于东南亚沿海地区，包括马来西亚、印度尼西亚和菲律宾 [ 1 ]。它在 90 多个国家/地区种植，大部分生产发生在亚洲和太平洋地区。菲律宾、印度尼西亚、印度、斯里兰卡、泰国、马来西亚和巴布亚新几内亚占全球所有椰子种植园的 80% 以上 [ 2]。椰子植物在热带地区的应用最多；植物部分用于制造食品、石油、建筑材料、能源和化妆品 [ 3 ]。

体外培养是商业部门大规模繁殖的可行替代方案。愈伤组织发育是体外过程之一。愈伤组织是由非结构化、去分化的细胞团组成的无定形组织 [ 4 ]。愈伤组织可由单个分化细胞制成，其中一些细胞是全能的，能够再生为整个植物体[ 5 ]。诱导细胞分裂、分化和细胞发育是普通植物愈伤组织发育的三个步骤 [ 4 ]。有很多植物生长调节剂，但生长素和细胞分裂素被广泛用于愈伤组织诱导[ 5]。生长素广泛用于植物组织培养中的愈伤组织诱导，其中这些植物生长调节剂参与细胞分裂、细胞伸长、维管组织分化、根际和根形成、胚胎发生和抑制腋芽生长 [ 6 ]。愈伤组织诱导常用的生长素是 2、4-D，但也使用 NAA 和 IAA [ 7 ]。本研究的目的是寻找植物生长调节剂（2,4-二氯苯氧乙酸 (2,4-D)、α-萘乙酸 (NAA) 和苄氨基嘌呤 (BAP) 诱导愈伤组织和幼叶椰子 cv MATAG 的生长。

二、材料与方法

2.1。外植体来源和灭菌

椰子幼苗样本是从马来西亚霹雳州的 MARDI Bagan Datok 农场采集的。外植体的来源是一米左右的幼椰叶（图1（a）和图1（b））。这些幼苗立即用清洁剂清洗并用自来水彻底冲洗。将长约 30-50 厘米的羽轴基部切开（图 1 (c) 和图 1 (d)），用干净的塑料包裹袋子运到实验室。灭菌实验在层流内进行。外植体用 70% 乙醇喷洒三次，约一英尺

(a)(b)(c)(d)(e)(f)(g)

图 1。用于愈伤组织诱导的外植体：约一米的椰子幼苗（（a），（b）），长约30-50厘米的轴基部（（c），（d）），较小的未成熟小叶7 - 10 厘米的碎片，（e）和 3 × 1.5 厘米大小的未成熟叶段（f）。

离开。外植体的制备包括将轴的白色部分切成 7-10 厘米的小块，由未成熟的小叶组成（图 1 (e)）。通过将外植体浸入含有几滴吐温 20 的 2.0% NaOCl 中 15 分钟，然后用无菌蒸馏水冲洗 3 次，对外植体进行表面消毒。在愈伤组织诱导培养基上培养3 × 1.5 cm 大小的未成熟叶段作为外植体（图 1 (f)）。

2.2. 初级愈伤组织诱导

设置了三个实验来研究植物生长调节剂对愈伤组织诱导的影响。实验分为 2,4-D 与 NAA 或 BAP 组合的效果。对于愈伤组织诱导，使用含有 60 g/L 蔗糖和 0.1% 活性炭的基础 Y3 培养基 (Eeuwens, 1976)。处理介质由浓度为 0、1.0、5.0、10.0、20.0、40.0、60.0 的 2,4-二氯苯氧乙酸 (2,4-D) 或与萘乙酸 (NAA) 或 6 苄基氨基嘌呤 (BAP) 的组合组成, 和 100.0 毫克/升, 分别。将介质调节至 pH 5.8，然后用 3 g/L 凝胶固化，然后在 121°C 高压灭菌 20 分钟。将培养物维持在25±2的黑暗培养室中。可以诱导初级愈伤组织的培养基被指定为生产愈伤组织培养基。

2.3. 愈伤组织的增殖

从初级愈伤组织诱导实验开始的初级愈伤组织团块被用于诱导额外的愈伤组织或促进愈伤组织增殖。愈伤组织在同一培养基上培养，以8周的间隔传代培养4-6次，直到胚胎发生愈伤组织形成18个月。愈伤组织在同一培养基上培养 18 个月，并以 8 周的间隔传代培养 4-6 次，直到 18 个月时发生胚性愈伤组织形成。以下是计算的愈伤组织增殖百分比：

增殖( %) =增殖愈伤组织的 FW -初始愈伤组织的 FW初始愈伤组织 FW× 100

3。结果与讨论

本研究旨在了解植物生长调节剂2,4-D、NAA和BAP对愈伤组织诱导、愈伤组织增殖和愈伤组织形态的影响。表 1显示了 2,4-D 对幼叶椰子 cv MATAG 愈伤组织诱导的影响。在含有不同浓度 2,4-D 植物生长调节剂（1、5、10、20、40、60、100 mg/L）的 Y3 培养基中培养长达 7 个月的愈伤组织每月观察一次。在开始的早期阶段形成的所有老茧都是透明的（图2（a）和图2（b）和图2（c）和图2(d))。培养物、环境、外植体类型以及激素和非激素调节剂可能在决定愈伤组织正确诱导、增殖和再生成小植株方面发挥协同作用，这些在愈伤组织发育中都发挥着重要作用 [ 8 ] [ 9 ]。

在 2,4-D (10, 20 mg/L) 下观察到最快的愈伤组织形成，这需要 7 - 9 个月，外植体分别产生 0.5% 和 0.7% 的愈伤组织。然而，与其他浓度的 2,4-D 相比，愈伤组织增殖的百分比 (3%) 并不好。最大愈伤组织增殖 (20%) 在

(a)(b)(c)(d)(e)(f)(g)(h)(i)(j)(k)(l)(m)(n)(o)

图 2。幼叶椰子cv MATAG的启动和愈伤组织增殖。在含有 2,4-D ((a)、(b)、(c)、(d)) 的培养 7 个月后获得的愈伤组织，在相同培养基上再培养 3-5 个月后获得易碎和淡黄色的愈伤组织只有 2,4-D ((e)、(f)、(g)、(h))、致密增殖愈伤组织 ((i)、(j)、(k)) 和在含有2,4-D 和 NAA ((l), (m), (n), (o)) 的组合。

2,4-D (100 mg/L) 尽管愈伤组织形成了大约 11 - 12 个月，其中 1.0% 的外植体产生愈伤组织。在同一培养基上继续培养 3-5 个月后，获得易碎和淡黄色的愈伤组织（图 2 (e) 和图 2 (f) 和图 2 (g) 和图 2 (h)）。随着 2,4-D 浓度的增加，愈伤组织增殖百分比呈上升趋势。大多数增殖的愈伤组织是致密的，颜色为白色（图2（i）和图2（j）和图2（k））。

植物生长调节剂

2,4-D (毫克/升)

愈伤组织形成日

（月）

外植体产生愈伤组织 (%)

愈伤组织增殖 (%)

愈伤组织形态

1

-

0

0

早期启动，所有老茧都是半透明的。

3 - 5 个月后，愈伤组织变脆并呈黄色。

5

-

0

0

10

7 - 9

0.5

3

20

7 - 9

0.7

3

40

11 - 12

2.9

5

60

11 - 12

1.5.0

8

100

11 - 12

1.0

20

表 1。2,4-D 对椰子叶愈伤组织诱导、增殖和形态的影响。

来自[ 10 ]的研究集中在韩国冷杉愈伤组织的诱导和增殖，从范围 分析结果观察到，2,4-D对愈伤组织增殖的影响最强。在 P14 在 2,4-D (3.0 mg∙L -1 )处测量的最大增殖率为 1147.6% 。根据[ 11 ]，在2和4mg L -1 2,4-D的浓度下，直到培养的第6周，叶外植体上愈伤组织的诱导百分比为100%，然后下降为81.3%。[ 12 ] 发现 2,4-D 是对积雪草的愈伤组织诱导最有效的生长素。[ 10 ]在随后的愈伤组织增殖实验中支持了另一种观点，其中 2,4-D 作为植物生长调节剂的影响比 BAP 或 NAA 更显着。

此外，然后用 2,4-D (1, 5, 10, 20, 40, 60, 100 mg/L) 和合成生长素 NAA (1, 3, 5 mg) 确定植物调节剂对愈伤组织诱导的影响/L) 在不同浓度下。从表 2可以看出，2,4-D (10.0, 20.1 mg/L) 分别与 NAA (1, 3 mg/L) 组合时，每个月的最快愈伤组织形成时间为 2-3 个月。尽管愈伤组织形成所需的时间很短，但愈伤组织增殖表现出较差的结果，导致愈伤组织没有发生增殖。2,4-D (60.0 mg/L) 和 NAA (1 mg/mL) 的组合也是如此，需要较长时间（3-5 个月）形成愈伤组织也显示出相同的结果。所有愈伤组织均致密，呈淡黄色，但有一些不定根发育（图2(l) 和图 2 (m) 和图 2 (n) 和图 2 (o))。与其他浓度组合相比，在 2,4-D (10.0 mg/mL) 和 NAA (1.0 mg/mL) 记录为最高百分比的外植体产生愈伤组织 (2.7%)。[ 5 ]的一项研究观察到，2,4-D和NAA等生长素是影响愈伤组织诱导的因素之一。

培养 5 个月后，愈伤组织变成褐变，表明 2,4-D 和 NAA 的这种组合对幼叶椰子 cv MATAG 上愈伤组织增殖的百分比没有给出良好的结果。未发生增殖的原因是5个月后愈伤组织发生褐变

植物生长调节剂 (mg/L)

愈伤组织形成日

外植体产生愈伤组织 (%)

愈伤组织增殖 (%)

愈伤组织形态

2,4-D

北美航空航天局

1.0

1

-

0

0

3

-

0

0

5

-

0

0

5.0

1

-

0

0

3

-

0

0

5

-

0

0

10.0

1

2 - 3

2.7

0

获得的所有老茧都是致密的、半透明的和淡黄色的。发育了一些不定根。培养5个月愈伤组织变褐，无增殖

3

2 - 3

1.5

0

5

-

0

0

20.1

1

2 - 3

0.7

0

3

2 - 3

0.4

0

5

-

0

0

40.1

1

2 - 3

0.5

0

3

-

0

0

5

-

0

0

60.0

1

3 - 5

0.1

3

-

0

0

5

-

0

0

100.0

1

-

0

0

3

-

0

0

5

-

0

0

表 2。2,4-D 和 NAA 对椰子叶愈伤组织诱导、增殖和形态的影响。

的文化。褐变在植物组织培养中也经常发生，限制了植物的正常生长和分化，在严重的情况下，导致植物死亡 [ 13 ] [ 14 ]。此外，由于低于标准的浓度和组合，愈伤组织褐变和坏死可能会发展 [ 5 ] [ 7 ]。

组合浓度2,4-D和BAP对椰子幼叶cv MATAG的处理产生了不同的反应。使用不同浓度的 2,4-D (1.0, 5.0, 10.0, 20.1, 40.1, 60.0, 100.0 mg/L) 与合成生长素 BAP (1, 3, 5 mg/L) 组合。这两种植物生长调节剂的组合导致愈伤组织变得紧凑、淡黄色和棕色。由于细胞分裂素的作用，愈伤组织的质地致密，在运输营养物质方面发挥作用。

根据表3，2,4-D（10.0、20.1 和 40.1 mg/mL）与 BAP（1、3 mg/mL）的愈伤组织形成范围为 3-6 个月。尽管愈伤组织形成的月份范围相同，但每种浓度产生愈伤组织的外植体是不同的。最高的外植体产生愈伤组织 (2.4%) 来自浓度为 10.0 mg/mL 的 BAP (1 mg/mL)。尽管与其他浓度相比，产生愈伤组织的外植体百分比最高，但在该浓度下也没有观察到愈伤组织增殖的不良结果，同样适用于其他浓度。与其他浓度组合相比，在 2,4-D (10.0 mg/mL) 和 BAP (1.0 mg/mL) 记录为最高百分比的外植体产生愈伤组织 (2.4%)。这一结果可以得到 [ 7] 指出 2,4-D 在愈伤组织形成方面特别有效，尤其是与细胞分裂素 (BA) 搭配使用时。

植物生长调节剂 (mg/L)

愈伤组织形成日

外植体产生愈伤组织 (%)

愈伤组织增殖 (%)

愈伤组织形态

2,4-D

BAP

1.0

1

-

0

0

3

-

0

0

5

-

0

0

5.0

1

-

0

0

3

-

0

0

5

-

0

0

10.0

1

3 - 6

2.4

0

获得的所有老茧都是致密的、结节的、淡黄色的、棕色的。培养9个月愈伤组织变褐，无增殖

3

3 - 6

0.5

0

5

-

0

0

20.1

1

3 - 6

0.8

0

3

3 - 6

0.1

0

5

-

0

0

40.1

1

3 - 6

0.4

0

3

3 - 6

0.1

0

5

-

0

0

60.0

1

-

0

0

3

-

0

0

5

-

0

0

100.0

1

-

0

0

3

-

0

0

5

-

0

0

表 3。2,4-D 和 BAP 对椰子叶愈伤组织诱导、增殖和形态的影响。

培养 9 个月后，愈伤组织变成褐变，表明 2,4-D 和 BAP 的这种组合对幼叶椰子 cv MATAG 上愈伤组织增殖的百分比没有给出良好的结果。该结果与 [ 15 ] 的一项研究相反，该研究表明，当培养基中添加 2,4-D 和 6-BA 时，红松愈伤组织得到 了很好的维持。该声明得到了 [ 10 ] 研究的支持，该研究表明 2,4-D 和 BAP 具有愈伤组织维持和增殖的潜力。

4。结论

本研究检测了结合 2,4-D、 α-萘乙酸 (NAA) 和苄氨基嘌呤 (BAP) 对幼叶椰子 cv MATAG 的愈伤组织诱导对愈伤组织形成、愈伤组织增殖百分比和愈伤组织形态的影响. 每种植物生长调节剂都有不同的反应。与 NAA 和 BAP 的组合相比，2,4-D 对愈伤组织诱导和愈伤组织增殖（20%）的效果最好。在早期启动阶段，获得的老茧是半透明的。增殖后，它们变得紧凑，颜色变白。随着NAA和BAP的组合，在培养5个月和9个月后愈伤组织出现褐变，导致没有增殖发育。因此，建议将 2,4-D 用于幼叶椰子 cv MATAG 的愈伤组织诱导。

利益冲突

作者声明与本文的发表没有利益冲突。

参考

[ 1 ] Lima, E.、Sousa, C.、Meneses, L.、Ximenes, N.、Santos Júnior, M.、Vasconcelos, G.、Lima, N.、Patrocínio, M.、Macedo, D. 和 Vasconcelos, S. (2015) Cocos nucifera (L.) (槟榔科)：植物化学和药理学综述。巴西医学和生物研究杂志，48，953-964。

[ 2 ] Pham, LJ (2016) 椰子 (Cocos nucifera) 在：McKeon, TA, Hayes, DG, Hildebrand, DF 和 Weselake, RJ, eds., Industrial Oil Crops, AOCS Press, Elsevier, 231-242。

[ 3 ] Elevitch, CR 和 Chan, E. (2006) Cocos nucifera (椰子)。在：太平洋岛屿的传统树木：文化、环境和利用，第 2 版，永久农业资源，277-303。

https://agroforestry.org/books/3-traditional-trees-of-pacific-islands

[ 4 ] George, EF, Hall, MA 和 Klerk, DG (2007) 组织培养的植物繁殖：第 1 卷。背景。第三版，施普林格，瓦赫宁根。

[ 5 ] Ikeuchi, M.、Sugimoto, K. 和 Iwase, A. (2013) 植物愈伤组织：诱导和抑制机制。植物细胞，25, 3159-3173。

[ 6 ] Chawla, H. (2011) 植物生物技术导论。第 3 版，CRC 出版社，博卡拉顿。

[ 7 ] Afshari, RT, Angoshtari, R. 和 Kalantari, S. (2011) 光和不同植物生长调节剂对油菜 (Brassica napus L.) 基因型愈伤组织生长诱导的影响。植物组学杂志，4, 60-67。

[ 8 ] Arumugam, S., Chu, FH, Wang, SY 和 Chang, ST (2009) In Vitro Plant Regeneration from In Vitro Plant Regeneration from Imature Leaflets Derived Callus of Acacia confusa Merr via Organogenesis。植物生物化学与生物技术杂志，18，197-201。

[ 9 ] Junairiah, Zuraidassanaaz, NI, Izdihar, FN 和 Manuhara, YSW (2017) 叶外植体 Piper betle L. Var Nigra 的愈伤组织诱导与植物生长调节剂 Indole-3-Acetic Acid (IAA)、Benzyl Amino Purin (BAP) 和激动素。AIP 会议论文集，1888 年，文章编号 020028。