西班牙动物粪便、粪便改良土壤和非人类影响土壤中的抗微生物基因

摘要：抗菌素耐药性基因的环境传播可能通过农业残留物（如动物粪便）发生。我们研究了 16 个动物粪便池样本（猪粪 [n = 8] 和家禽粪便 [n = 8]）和 16 个土壤样本（粪肥改良 [n = 8] 和非粪肥改良 [n = 8] ]）。所有样本均在西班牙中部收集。检测基于 18 个选定的抗菌素耐药基因 (ARG)。动物粪便中最常检测到的基因是sul 1 (16/16)、sul 2 (16/16)、tet ( A ) (16/16)、aadA (16/16)、tet ( B ) (15/16) ) 和str (15/16)。基因bla TEM (7/8)、mecA (6/8)、vanA (5/8) 和qnrB (4/8) 在鸡粪中更常见，而猪粪样品中tet ( C ) (8/8 ) 和春节( M ) (8/8)。在根据临床相关性选择的四个基因中，三个——bla CTX-M、vanA和mecA——在动物粪便中检测到。bla CTX-M ( 1/8) 和vanA (5/8) 基因仅在鸡粪中发现。据我们所知，这是直接检测mecA的第一份报告家禽粪便和猪粪中的基因。在改良土壤中检测到 18 个 ARGs 中的 11 个，而在非人为影响土壤 (NAIS) 中仅发现基因sul 2 (3/8) 和str (2/8)，这支持了 ARGs 可以作为“人为影响”指标的假设。对环境的影响”。

关键词

抗生素 耐药, bla CTX-M , mecA ,猪浆, vanA

一、简介

对人类和家畜而言，抗菌素耐药性是全球日益严重的健康威胁 [ 1 ]。一个重要的耐药机制是通过自发突变或结合其他细菌的 ARGs 获得抗菌素耐药基因 (ARGs) [ 2 ]。ARGs 被认为是环境污染物，可以通过移动遗传元件（例如质粒、整合子、转座子和噬菌体转导）在细菌物种之间通过水平基因转移进行传播[ 3 ] [ 4 ] [ 5 ]。这些可动员基因，即“移动基因组”，包括所有可能导致抗菌素耐药性表型的基因，即“耐药基因组”[ 5 ]。

大多数抗生素是由土壤真菌或细菌产生的天然生物活性化合物开发的，是其生态系统的组成部分[ 6 ]。然而，自抗生素时代 [ 7 ] 以来，由于使用抗生素作为治疗方法和牲畜饲料补充剂（如生长促进剂），土壤中 ARGs 的组成一直在不断变化。尽管自 2006 年以来，包括西班牙在内的欧盟成员国禁止在动物生产中使用生长促进剂 [ 8 ]，但这种做法在许多其他国家仍然很活跃。兽药中使用的大量抗生素（30% 到 90% 之间）基本没有变化 [ 9] . 因此，抗生素残留物和 ARGs 可能通过农业残留物传播到环境中，例如动物粪便，可用作农业肥料 [ 10 ] [ 11 ]。环境中抗菌素耐药细菌和ARGs的发生和潜在的环境影响仍然知之甚少[ 12 ]。

我们评估了西班牙两种常用农业改良剂中选定的 ARGs 的存在；猪粪和家禽粪便，并通过比较该国猪粪改良和非人为影响土壤 (NAIS) 中 ARGs 的存在来确定这种做法的影响。

2。材料和方法

2.1。样品

2012年4月至2014年4月在西班牙中部地区共采集了32个样本；来自不同肉鸡家禽和养猪场的 16 个粪便样本（家禽粪便 [n = 8] 和猪粪 [n = 8]），以及 16 个土壤样本（用猪粪定期修正的农业土壤 [n = 8] 和来自过去五年或更长时间未修订的同一地区 [n = 8]）。32 个样本中的每一个都由六个子样本组成，这些子样本来自每个收集点。从储罐收集粪便样品。在 5-10 厘米深的地方收集土壤样品。在用猪浆改良后至少 15 天收集改良土壤样品，这是研究区域最常用的改良剂。每个未改良土壤样本均在距其余土壤约 10 公里处收集。我们比较了家禽和家禽中抗生素耐药性的存在。猪粪肥和改良土壤与 NAIS 土壤。样本量是根据物流原因确定的，选择那些允许抽样操作的肉鸡和养猪场。

2.2. ARGs 的实时 PCR 检测

高纯度模板 DNA（Roche Diagnostics，Mannheim，Germany）和 EZNA ®土壤 DNA 试剂盒（Promega，Madison，WI，USA）分别用于从家禽粪便和猪粪样品以及土壤样品中提取 DNA。使用实时 PCR (rtPCR) 测试了 16S rRNA 基因和 18 个选定的 ARGs 的存在；其中 18 个基于 SYBR® Green，1 个基于 TaqMan®探针（表 1），均在 Eco Illumina 热循环仪（Illumina，San Diego，CA，USA）中进行。

为了研究不同的概况，我们选择了与一些最初最常用的抗生素相关的基因（例如，catA1、catA2、tet(A)、tet(B)、tet(C)、tet(M)、tet(Q)、 sul1、sul2、str 和 aadA）、目前在家禽和猪生产中最常用的抗生素（qnrB、qnrS、bla TEM）和选定的临床相关抗生素（armA、bla CTX-M、mecA 和 vanA，分别对金黄色葡萄球菌中的氨基糖苷类、超广谱 β-内酰胺酶、甲氧西林和万古霉素耐药性负责）。不可能区分 strA-strB 基因或不同的 aadA 等位基因。选择先前测试为所选基因阳性的肠道微生物组样本作为阳性对照。不幸的是，有关所研究动物农场中使用的抗生素的信息是保密的。

16S rRNA 基因（存在于所有细菌中）用于检查样品的活力。当纯化 DNA 的 1/10 稀释度显示循环阈值小于 25 时，认为样品已验证。此外，该基因用于量化不同样品中所选 ARG 的存在，确定 sul2 基因的相对浓度与16S rRNA基因比较，如下：每个反应的sul2基因拷贝数/16S rDNA基因拷贝数。选择 sul2 基因对其存在进行相对定量，因为它是在 NAIS 中检测到的两个 ARG 之一。16S rRNA 基因和 sul2 基因的标准对照是基于先前测试的样本建立的。将纯化的 DNA 片段克隆到质粒载体 (pGEM ®-T，Promega，麦迪逊，威斯康星州，美国）和第二次纯化（Wizard ® Plus SV Minipreps DNA 纯化系统，Promega，麦迪逊，威斯康星州，美国）。将质粒菌落在补充有氨苄青霉素的 LB 培养基中传代培养。通过分光光度计测量总DNA。通过将 260 nm 处的吸光度值除以质粒分子量（包括特定插入片段）获得估计的拷贝数。随后，通过 rtPCR 评估 10 倍稀释的量化质粒，以确定 sul2 和 16S rRNA 基因的检测限。

2.3. 统计分析

采用卡方检验比较家禽粪便和猪粪样本以及猪粪改良土壤和NAIS样本之间ARGs的发生情况。相对的

基因

序列 (5'-3')

功能

退火温度 (°C)

扩增子大小 (bp)

参考

腺苷酸

F：GCAGGCCAATGACATCTTG

F

60

282

[35]

R: ATCCTTCGGCGCGATTTTG

R

臂A

ATTCTGCCTATCCTAATTGG

F

55

315

[36]

ACCTATACTTTATCGTCGTC

R

blaCTX-M

TTTGCGAT GTGCAGTACAGTAA

F

60

591

[37]

CGATATCGTTGGTGGTGCATA

R

透射电镜_

AAAGATGCTGAAGATCA

F

44

425

[38]

TTTGGTATGGCTTCATTC

R

猫A1

GGTGATATGGGGATAGTGTT

F

60

349

[39]

CCATCACATACTGCATGATG

R

猫A2

GATTGACCTGAATACTGGAA

F

60

567

CCATCACATACTGCATGATG

R

甲酸

CATTGATCGCAACGTTCAATTT

F

60

99

[40]

TGGTCTTTCTGCATTCCTGGA

R

TGGAAGTTAGATTGGGATCATAGCGTCAT

探测一个

qnrB

GGMATHGAAATTCGCCACTG

F

62

263

[41]

TTYGCBGYYCGCCAGTCGAA

R

qnrs

GACGTGCTAACTTGCGTGAT

F

62

118

TGGCATTGTTGGAAACTTG

R

春节(A)

GCGCTNTATGCGTTGATGCA

F

62

387

[42]

ACAGCCCGTCAGGAAATT

R

春节(B)

TACGTGAATTTATTGCTTCGG

F

60

206

[43]

ATACAGCATCCAAAGCGCAC

R

春节(C)

CTTGAGAGCCTTCAACCCAG

F

66

418

[44]

ATGGTCGTCATCTACCTGCC

R

春节(M)

ACAGAAAGCTTATTATATAAC

F

60

171

TGGCGTGTCTATGATGTTCAC

R

春节(Q)

AGAATCTGCTGTTTGCCAGTG

F

63

169

[45]

CGGAGTGTCAATGATATTGCA

R

字符串

AATGAGTTTTGGAGTGTCTCAACGTA

F

60

147

[46]

AATCAAAACCCCTATTAAAGCCAAT

R

苏尔1

CGCACCGGAAACATCGCTGCAC

F

63

163

[47]

TGAAGTTCCGCCGCAAGGCTCG

R

苏尔2

TCCGGTGGAGGCCGGTATCTGG

F

63

191

CGGGAATGCCATCTGCCTTGAG

R

范A

GAAATCAACCATGTTGATGTAGCA

F

61

572

[48]

TTTGCCGTTTCCTGTATCCGT

R

16S rDNA

ATGGCTGTCGTCAGCT

F

62

352

[49]

ACGGGCGGGTGTGTAC

R

表 1。用于对选定 ARG 进行实时 PCR 检测的引物。

TaqMan 探针：5' (6FAM) ；3'（非荧光猝灭剂）。F = 正向，R = 反向。

量化（ARG 拷贝数/16S rDNA 拷贝数）和所有四个类别中每个样本的平均基因数通过 Mann-Whitney U 检验进行评估。所有统计研究均在SPSS 15.0软件的帮助下进行。所有测试的统计显着性定义为 P < 0.05。

3。结果与讨论

结果总结在表2中。在本研究分析的 18 个 ARG 中，检测到了 16 个。armA 和 catA2 的存在低于检测限。

3.1。家禽粪便与猪泥

在样本中存在的 ARGs 平均数量方面，在家禽粪便和猪粪之间检测到了统计学上的显着差异（P = 0.013）；mecA (P = 0.012)、vanA (P = 0.007)、qnrB (P = 0.021) 和 bla TEM (P = 0.000) 基因在家禽粪便中更常见，而 tet(C) (P =

基因

家禽粪便

猪浆

改良土壤

国家信息系统

腺苷酸

8/8

8/8

4/8

0/8

臂A

0/8

0/8

0/8

0/8

blaCTX-M

1/8

0/8

0/8

0/8

透射电镜_

7/8

0/8

3/8

0/8

猫A1

3/8

1/8

0/8

0/8

猫A2

0/8

0/8

0/8

0/8

甲酸

6/8

1/8

0/8

0/8

qnrB

4/8

0/8

0/8

0/8

qnrs

6/8

3/8

3/8

0/8

字符串

8/8

7/8

4/8

2/8

苏尔1

8/8

8/8

5/8

0/8

苏尔2

8/8

8/8

8/8

3/8

sul2（相对a）

6.2 × 10-3

(1.2 × 10-6- 2.6 × 10-2)

5.1 × 10-2

(1.4 × 10-2- 8.8 × 10-2)

9.8 × 10-4

(1.7 × 10-4- 2.0 × 10-3)

0.3 × 10-4

(0.8 × 10-6- 0.7 × 10-4)

春节(A)

8/8

8/8

3/8

0/8

春节(B)

7/8

8/8

3/8

0/8

春节(C)

3/8

8/8

3/8

0/8

春节(M)

4/8

8/8

1/8

0/8

春节(Q)

7/8

7/8

5/8

0/8

范A

5/8

0/8

0/8

0/8

平均基因数/样本

11.6

(9 - 14)

9.4

(8 - 11)

5.2

(1 - 10)

0.6

(0 - 2)

表 2。通过实时 PCR 测试的选定 ARG、sul2 基因的相对量和每个样本的平均基因数。

a计算如下：每个反应的 ARG 拷贝数/16S rDNA 基因的拷贝数。

0.007) 和 tet(M) (P = 0.021) ARGs 在猪中比在家禽粪便中更常见。

动物粪便样品中最常检测到的 ARGs 是 tet(A) (16/16)、sul1 (16/16)、sul2 (16/16)、aadA (16/16)、tet(B) (15/16)和 str (15/16)，都与一些最初最常用的抗生素有关。外排泵基因——tet(A) 和 tet(B)——几乎存在于所有动物粪便样品中（猪粪样品中分别为 8/8 和 8/8，家禽粪便中分别为 8/8 和 7/8）。核糖体保护蛋白基因tet(M)和四环素外排泵基因tet(C)在猪中比在禽粪中更常见，而tet(Q)在禽粪和猪粪样本中更常见。根据我们的研究结果，猪粪可能被认为是 tet 基因的主要来源，其次是家禽粪便。我们的研究结果部分同意 Cheng 等人的观点。[ 13]，他们报告说 tet 和 sul 基因是动物粪便中最常检测到的 ARG。

在家禽粪便和猪粪中检测到能够赋予链霉素-str和aadA-[ 14 ]和壮观霉素-aadA-[ 15 ]抗性的基因。以前曾报道过家禽粪便和猪粪中大肠杆菌中存在 str 基因和 aadA [ 16 ]。

基因 catA1 存在于 16 个动物源样本中的 4 个（家禽粪便 [3/8] 和猪粪 [1/8]）。没有样品呈现 catA2 基因。有趣的是，自 1994 年以来，欧盟已禁止在食用动物中使用氯霉素 [ 17 ]。在没有氯霉素残基诱导选择压力的情况下，catA1 的存在归因于它与其他质粒介导的 ARGs 的关系 [ 18 ]。本研究未进行细菌分离；因此，我们无法确定同一分离物中是否存在不同的 ARG。然而，我们发现所有的猫阳性样本也对 sul1 和 sul2 呈阳性，这与之前发表的报告 [ 19 ] 一致。

关于喹诺酮类耐药基因，qnrS 存在于猪粪样本中（3/8），在家禽粪便中高度流行（6/8），而 qnrB 仅在禽粪样本中检测到（4/8）。禽类产品中 qnr 基因的存在有据可查，但我们的患病率远高于先前公布的：qnrB 为 3.9% 和 0.9%；qnrS 分别为 5.1% 和 8.11% [ 20 ] [ 21 ]，这可能是由于我们的方法，比以前基于文化的研究更敏感 [ 20 ] [ 21 ]。因此，qnr 基因的实际流行率可能高于预期。

在家禽粪便中检测到β-内酰胺酶基因 bla TEM和 bla CTX-M，分别为 7/8 和 1/8，但在猪粪中未检测到。这些基因与超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）有关，这是一种重要的肠杆菌科细菌对头孢菌素的耐药机制[ 22 ]。 CTX-M 型抗性基因已取代其他家族，如 TEM 和 SHV，在世界范围内出现 [ 23 ]。以前曾报道过从家禽粪便中分离出的大肠杆菌中存在 bla CTX-M基因[ 16 ]。所有猪粪样本均为阴性，尽管其他研究已从猪粪中分离出带有 bla TEM和 bla CTX的大肠杆菌[16 ]。

万古霉素抗性基因（vanA）仅在家禽粪便中检测到（5/8）。耐万古霉素肠球菌与 avoparcin 的使用有关，这是 1997 年欧盟禁止的第一种用于食用动物的生长促进剂 [ 24 ] [ 25 ]。在最初的下降之后，vanA 基因的存在似乎在家禽中持续存在 [ 26 ] [ 27 ]，并且根据我们的结果，仍然广泛存在于家禽粪便中。

mecA 基因的高流行率与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA) 相关，在鸡粪样本中值得注意 (6/8)。该基因也在一份猪粪样本（1/8）中检测到。据我们所知，这是首次在家禽粪便和猪粪中直接检测mecA基因的报道。Colomer-Lluch 等人。在屠宰场的粪便样本中发现了 mecA 基因，表明它通过噬菌体运输并将其与影响禽类和猪类物种的细菌联系起来 [ 28 ]。

3.2. 修正土壤与 NAIS

在 sul1、sul2、tet(Q) 和 aadA 的存在方面，修正和未修正土壤之间存在统计学显着差异（分别为 P = 0.007、P = 0.007、P = 0.007 和 P = 0.021）；sul2 的相对浓度 (P = 0.014)，以及每个样品的平均 ARG 数 (P = 0.009)。Pruden 等人观察到，改良土壤中 ARGs 的存在较高，sul2 的相对浓度也较高，表明这些基因可能来自人类活动。[ 29 ]。

至少一个粪肥改良土壤样品中存在 11 种不同的 ARG：所有 sul 和 tet 基因、bla TEM、qnrS、aadA 和 str 基因。另一方面，在 NAIS 中仅发现 sul2 和 str 基因（分别为 3/8 和 2/8）。没有土壤样本呈现通过其临床相关性选择的基因（armA、bla CTX-M、mecA 和 vanA）。我们的结果不同于之前在自然和人为影响的环境中检测到几种 ARGs 的研究 [ 29 ] [ 30 ]。

在猪粪改良土壤中检测到与养猪生产中常见的抗生素相关的基因bla TEM（3/8）和qnrS（3/8），但本研究未检测到qnrB基因。Binh 等人观察到在这种类型的土壤中存在 bla TEM 。[ 31 ]，而 qnrS 基因之前已在其他受人为影响的土壤中检测到，例如用废水灌溉的土壤 [ 32 ]。

我们在改良土壤和 NAIS 中扩增了 str 基因，仅在改良土壤中扩增了 aadA。在抗生素时代之前，在西伯利亚永久冻土 [ 33 ]的古土壤样本中已经检测到 str 和 aadA 这两个基因，因此这些元素可能与现代抗生素使用之外的其他因素有关。

sul2 基因在改良土壤和未改良土壤中均有发现，但在改良土壤样品中其相对浓度显着升高。农业土壤中 sul2 基因的相对浓度与之前发表的文献 [ 34 ] 处于同一数量级。值得注意的是，该基因被认为是人为/农业影响最明智的指标[ 29 ]。

我们的研究结果表明，通过使用猪粪改良农业土壤，农业活动可能显着促进 aadA、sul1、sul2 和 tet(Q) 的环境传播。虽然不显着，但其他 tet 基因、bla TEM和 qnrS 的存在似乎在那些用猪粪改良的土壤中更高。此外，修正后的土壤每个样本的平均 ARG 数高于 NAIS。

因此，尽管由于缺乏培养和随后的分离而无法确定单个细菌 ARG，但有可能根据 ARG 概况和浓度获得人为和非人为环境的特定模式。

3.3. 结论

动物粪便带有 ARGs，一些与临床相关的物质（vanA、mecA 和 bla CTX-M），可能通过使用动物粪便改良农业土壤而传播到环境中。这是在家禽粪便和猪粪中直接检测mecA的第一份报告。尽管我们研究的 ARG 的样本量和数量有限，但我们的结果通过检测几种 ARG（例如 sul1、bla TEM）显示了人为活动对环境的影响和 qnrS，在粪肥改良的农业土壤中，而相同的 ARGs 低于 NAIS 的检测限。我们的结果支持这样的假设，即 ARGs 的检测和量化可以作为对环境的“人为影响”的指标，并建议开发这些污染物的特定 ARG 配置文件以比较不同的环境情景。需要进一步研究，重点关注不同情景下人为活动对微生物种群的影响，以阐明 ARGs 的真正影响。

致谢

我们感谢 Veronica Nogal、Elena Neves 和 Ana Carolina Ewbank 的技术援助和支持。作者声明他们没有利益冲突。这项研究得到了国家农业和食品研究与技术研究所 [RTA2014-00012-C03-02 和 RTA2010-00066-C02-01] 和马德里地区政府 [CAM S2013/ABI-2747] 的支持。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

参考

[ 1 ] Bush，K.，Courvalin，P.，Dantas，G.，Davies，J.，Eisenstein，B.，Huovinen，P.，等。(2011) 解决抗生素耐药性问题。自然评论微生物学，9，894-896。

[ 2 ] Lupo, A.、Coyne, S. 和 Berendonk, TU (2012) 抗生素耐药性的起源和演变：水体中出现和传播的常见机制。微生物学前沿，3, 18.

[ 3 ] 朱，YG，约翰逊，TA，苏，JQ，乔，M.，郭，GX，Stedtfeld，RD，等。(2013) 中国养猪场抗生素耐药基因的多样性和丰富性。美国国家科学院院刊，110, 3435-3440。

[ 4 ] Davies, J. 和 Davies, D. (2010) 抗生素耐药性的起源和演变。微生物学和分子生物学评论，74，417-433。

[ 5 ] Rolain, JM, Fancello, L., Desnues, C. 和 Raoult, D. (2011) 噬菌体作为囊性纤维化中抗阻剂的载体。抗菌化疗杂志，66, 2444-2447。

[ 6 ] Blaser, MJ 和 Falkow, S. (2009) 人类微生物群消失的后果是什么？自然评论微生物学，7，887-894。

[ 7 ] Gillings, MR (2013) 抗生素用于 Resistome、Mobilome 和微生物泛基因组的进化后果。微生物学前沿，4, 4.

[ 8 ] 欧盟委员会 (2003) 欧洲议会和理事会 2003 年 9 月 22 日关于动物营养添加剂的 EC 第 1831/2003 号条例。欧盟官方公报，L268，29-43。

[ 9 ] Sarmah, AK, Meyer, MT 和 Boxall, ABA (2006) 对环境中兽用抗生素 (VA) 的使用、销售、暴露途径、发生、命运和影响的全球视角。化学球，65, 725-759。

[ 10 ] Heuer, H.、Schmitt, H. 和 Smalla, K. (2011) 农田施肥导致抗生素耐药性基因传播。微生物学当前观点，14, 236-243。

[ 11 ] Binh, CT, Heuer, H., Kaupenjohann, M. 和 Smalla, K. (2008) 用于土壤施肥的猪粪是可转移抗生素抗性质粒的储存库。FEMS 微生物学生态学，66, 25-37。

https://doi.org/10.1111/j.1574-6941.2008.00526.x

[ 12 ] Martínez, JL (2008) 自然环境中的抗生素和抗生素抗性基因。科学，321、365-367。