具有缓冲和螯合能力的新型酶工程离子液体

摘要：在乙二胺四乙酸（EDTA）的基础上，设计和合成了具有缓冲和螯合能力的离子液体（ILs），用于开发缓冲的酶促IL系统，并在含重金属的水系统中进行酶促反应。溶解在羟基官能化 IL 中的南极假丝酵母脂肪酶 B的酯交换活性是缓冲液依赖性的。使用用于酯交换的缓冲酶 IL 系统获得了高活性和出色的稳定性。在含有重金属的水系统中，EDTA IL 缓冲液作为 Hg 2+螯合剂保护辣根过氧化物酶 (HRP) 免受 Hg 2+- 诱导的变性和沉淀。较高的 pH 值有利于保护，而在较低的 pH 值下，保护作用减弱。我们可以得出结论，新的 IL 具有缓冲和螯合能力。

关键词

离子 液体, EDTA ,缓冲液,螯合剂,脂肪酶,过 氧化物,重金属

一、简介

酶在不含重金属的水性环境和生理 pH 值条件下，具有极佳的选择性和立体专一性 [ 1 ] ，可催化多种反应。因此，需要合适的缓冲液来密切调节酶的可电离基团在水性和非水性介质中的电离状态。我们合成了一类具有缓冲行为的新型离子液体 (IL)，称为 IL 缓冲液，可用于控制非水介质中酶的电离状态 [ 2 ]。在烯烃加氢 [ 2 ] 和不饱和醛的选择性加氢 [ 3 ]中观察到催化活性的显着缓冲依赖性] 在有机溶剂和离子液体中。有机溶剂广泛与酶一起使用，以提高疏水反应物和/或产物的溶解度，并将反应平衡从水解转变为合成 [ 4 ] - [ 9 ]。随着离子液体的出现，使用离子液体作为一种新型的非水介质可以方便地解决溶剂排放和催化剂回收问题[ 5 ][ 9 ]-[ 22 ]。

重金属对水的污染增加促使人们进行调查，以寻找清洁环境的方法，并了解导致金属毒性的机制，其中包括酶抑制。这种抑制最常归因于金属离子与酶的半胱氨酸残基的硫醇基团的反应，导致硫醇的形成 [ 23 ] [ 24 ]。

据报道，过氧化物酶被较高浓度的重金属离子抑制[ 25 ]，Hg 2+离子被列为最有效的抑制剂[ 26 ][ 27 ]。康雅耶娃等人。据报道，像 EDTA 这样的 Hg 2+螯合剂可以保护血红蛋白免受 Hg 2+诱导的变性和沉淀 [ 28 ]。

与当今使用的大多数生物缓冲液一样，IL 缓冲液的开发仅用于保持溶液的 pH 值恒定，不能保护酶免受金属诱导的变性和沉淀。然后，我们设计并合成了具有缓冲和螯合能力的新型 IL，用于含重金属的水系统和 IL 系统中的酶促反应。

2。材料和方法

2.1。材料

南极念珠菌脂肪酶 B (CALB, 10.9 U∙mg - 1 )、辣根过氧化物酶 (HRP, 150 U∙mg - 1 )、双三丙烷 (BTP)、愈创木酚和丁酸乙酯购自 Sigma-Aldrich。丁酸乙酯和正丁醇为分析纯试剂，经干燥 3A 分子筛使用前。所有其他化学品和试剂均为分析级。1-丁基-3-甲基-咪唑氯化物 ([BMIM]Cl) 和 1-(1-羟乙基)-3-甲基-咪唑四氟硼酸盐 ([C 2 OHMIM] [BF 4 ]) 根据公开的程序合成 [ 11 ] . 检查[C 2 OHMIM] [BF 4 ] 中是否存在氯化物和酸。将离子液体通过中性氧化铝柱，在 50°C 减压干燥 18 小时以上，并在干燥 N 2下储存。

1 H NMR和13 C NMR光谱在Brüker AV-400傅里叶变换NMR光谱仪上获得。1 H NMR光谱参考CDCl 3中的四甲基硅烷。

2.2. pH 滴定程序

使用定制的自动滴定仪进行滴定。将磁力搅拌棒放入烧杯中，并将烧杯置于磁力搅拌器上。将适量的EDTA酸（1.0 mmol）溶解在20 mL水中。将电极浸入溶液中并开始搅拌。通过以1.0 mL∙min -1运行的蠕动泵（上海沪西分析仪器厂有限公司，型号HL-2）添加0.1 M [BMIM] [OH]溶液。用与计算机连接的 pH 计（ORION，828 型）记录混合物的 pH 值。

2.3. EDTA IL 缓冲液的合成

如文献 [ 2 ] [ 11 ]中所述，通过使 [BMIM]Cl 溶液通过填充有阴离子交换树脂的柱制备 1-丁基-3-甲基-咪唑鎓氢氧化物 ([BMIM]OH) 的水溶液。然后在烧杯中用EDTA酸中和[BMIM]OH水溶液并将溶液的pH调节至3.90、6.50、8.50或9.80。将溶液在 50°C 减压蒸发，得到粘稠液体，然后在 50°C 真空干燥 18 小时，得到 EDTA IL 缓冲液。EDTA IL缓冲液的NMR光谱：pH 9.80 1 H NMR (400 MHz, D 2 O) δ: 7.368 (s, 4H, im-H), 7.320 (s, 4H, im-H), 4.088 (t, 8H, -CH 2 ), 3.784 (s, 12H, im-CH 3 ), 3.447 (s, 8H, N-CH2 -COO-), 3.033 (s, 4H, N-CH 2 -CH 2 -N), 1.721 - 1.758 (m, 8H, -CH 2 ), 1.199 - 1.217 (m, 8H, -CH 2 ), 0.794 - 0.831 (t, 12H, -CH 3 ); 13 ℃ NMR（400MHz，D 2 O）δ：175.703、135.599、123.385、122.119、57.238、51.069、49.200、35.547、31.212、18.706、12.600。pH 3.90 1 H NMR (400 MHz, D 2 O) δ: 8.067 (s, 2H, im-H), 7.368 (s, 2H, im-H), 7.328 (s, 2H, im-H), 4.085 ( t, 4H, -CH 2 ), 3.796 (s, 6H, im-CH 3 ), 3.782 (s, 8H, N-CH 2 -COO-), 3.580 (s, 4H, N-CH 2 -CH 2 - N)、1.717 - 1.754 (m, 4H, -CH 2 ), 1.195 - 1.214 (m, 4H, -CH 2 ), 0.790 - 0.827 (t, 6H, -CH 3 )； 13 ℃ NMR（400 MHz，D 2 O）δ：170.500、135.822、123.4495、122.169、57.939、51.569、49.232、35.602、31.235、18.721、12.624。

2.4. IL中酶促酯交换的一般程序

在 5 mL 烧瓶中，将 CALB (1.2 mg) 溶解在 500 μL [C 2 OHMIM][BF 4 ]（在缓冲培养基的情况下添加 30 mg EDTA IL 缓冲液）中。加入 110 μL (0.83 mmol) 丁酸乙酯和 110 μL (1.21 mmol) 正丁醇和 50 μL 壬烷（内标）。将反应混合物在油浴中于 40°C 搅拌 3 小时。反应完成后，将产物从[C 2 OHMIM][BF 4 ]中倾析出来。有机相用配备 FID 和毛细管柱 (SE-30, 30米 × 0.32 毫米 × 0.25 微米）。在 40°C 下真空除去 IL 相中的残留反应物混合物超过 1 小时。通过添加新鲜底物重新开始新的循环。

2.5. 含汞水系统中的 HRP 活性

通过在 470 nm 处跟踪愈创木酚的 H 2 O 2依赖性氧化来测量 HRP 活性。通过将愈创木酚溶解在 0.1 M 缓冲液中制备愈创木酚储备溶液 (1.0 mM)。对于在 Hg 2+离子存在下进行的测定，将适量的 Hg(NO 3 ) 2储备溶液与 0.1 M 缓冲液混合，并在需要时重新调整 pH 值。每天通过适当稀释 30% H 2 O 2制备H 2 O 2储备溶液 (300 mM)在蒸馏水中。通过将酶溶解在蒸馏水中制备 HRP 溶液 (10 μg/ml)。通过将 500 μL 愈创木酚储备溶液与 15 μL HRP 溶液（最终浓度 7.8 nM）混合来进行测定，然后将混合物在 298 K 下孵育 30 分钟。通过添加 15 μL 的 300 mM H 2 O 2开始反应。愈创木酚氧化的初始速度 (v 0 ) 由吸光度与时间的线性图确定，消光系数为 2.66 × 10 4米 -1 ∙cm -1用于愈创木酚衍生的氧化产物。

所有测定均使用紫外-可见分光光度计 (Unico, UV2800) 在 298 K 下进行，该分光光度计与恒温器相连。

3。结果与讨论

3.1。EDTA 的滴定曲线

EDTA 与 [BMIM]OH 在水中的滴定曲线表示 3 个类似缓冲的区域，分别以 pH 3.90、6.50 和 8.50 为中心（图 1）。

因此，我们认为可以通过在 pH 3.90、6.50 和 8.50 下用 EDTA 水溶液中和 [BMIM]OH 水溶液来合成具有缓冲能力的新 IL，如方案 1 所示。

3.2. EDTA IL 缓冲液的合成与表征

EDTA IL 缓冲液的结构如图 1 所示。IL 缓冲液的合成如先前报道的 [ 2 ] [ 11 ] 并通过 NMR 表征。EDTA IL 在 pH 3.90 和 pH 9.80 的表征数据与预期的组成和结构一致。EDTA IL 缓冲液的 pH、稀释值和缓冲液值总结在表 1中。可以看出，合成的 ILs 具有缓冲能力，可用于控制水和非水介质中酶的电离。

图 1。在室温下滴定 0.05 mol∙L - 1 EDTA 与 0.1 mol∙L - 1 [BMIM]OH 在水中。滴定率为 1.0 mL∙min - 1。

方案 1. EDTA IL 缓冲液的合成。

缓冲

酸碱度

浓度/mol∙L-1

稀释值a)

缓冲值b)

IL- 3.90

3.90

0.025

+0.01

0.004

IL- 6.50

6.50

0.025

+0.03

0.011

IL- 8.50

8.50

0.025

+0.03

0.002

表 1。EDTA IL 缓冲液水溶液的 pH 值、缓冲液值和稀释值。

EDTA IL 缓冲区的结构， [体重指数]+n[乙二胺四乙酸]n -如图 1 所示。这些参数是在室温下测量的。a稀释值定义为用等体积的水稀释时 pH 值的变化。b缓冲值定义为将一升溶液的 pH 值改变一个单位所需的强碱摩尔数。

3.3. EDTA IL 缓冲液存在下的酶促酯交换

脂肪酶介导的酯交换是一种经济上可行的风味酯生产清洁技术 [ 29 ]。为了测试溶解形式的 CALB 脂肪酶在 ILs 中的活性，我们检测了 CALB 催化的丁酸乙酯与正丁醇的酯交换反应。在本研究中，所有反应均在相同条件下进行，即 40˚C 和 300 rpm，以消除任何温度或混合影响。结果表明，CALB 在纯 [C 2 OHMIM][BF 4 ] 中提供较低的底物转化率（8.7%）。相比之下，CALB 在缓冲的 [C 2 OHMIM][BF 4 ] 中表现出很大的酯交换活性（参见图 2），表明缓冲液是提高速率的原因。

上述结果表明，脂肪酶活性受 IL 和 IL 缓冲液的影响很大。这是因为脂肪酶的可电离基团的电离常数受溶剂影响很大[ 30 ]。托马佐等人。报道了酸性 HNTf 2在 [BMIM][NTf 2 ] 和 [BMIM][BF 4 ] 中比在水中的酸性更强

图 2。在缓冲的 IL 中，由 CALB 催化的丁酸乙酯与 1-丁醇的酯交换反应。反应条件：CALB粉末1.2mg；500 μL [C 2 OHMIM][BF 4 ]；30 mg EDTA IL 缓冲液；110 μL 丁酸乙酯（0.83 mmol）；110 μL 1-丁醇 (1.21 mmol)；50 μL 壬烷（内标）；搅拌速度 = 300 rpm；温度 = 40°C。通过丁酸乙酯计算转化率。

[ 31 ]。因此，当CALB从水中转移到[C 2 OHMIM][BF 4 ]时，脂肪酶的电离状态会发生变化，导致脂肪酶活性降低。并且添加EDTA IL缓冲液可以将脂肪酶的可电离基团的电离状态调节到适当的状态。可以得出结论，ILs 中的酶活性也与水系统中的缓冲液一样。

在上述反应条件下，可溶性 CALB 在缓冲 [C 2 OHMIM][BF 4 ] 中的再循环能力如图 2 所示. 每次反应后，通过倾析分离上层中的反应物混合物和下层中的CALB-IL。然后将 CALB-IL 相抽空以去除残留的反应混合物，并在不添加任何新酶、IL 和缓冲液的情况下进行下一步反应。在 pH 3.90 的 EDTA IL 缓冲液存在下，脂肪酶活性在循环过程中显着下降，表明脂肪酶在酸性环境中逐渐变性。然而，在 EDTA IL 缓冲液 pH 6.50 或 pH 8.50 存在下，10 次运行后丁酸乙酯的转化率仍能保持其初始值的 75%，说明上述缓冲的 [C 2 OHMIM][BF 4 ]中溶解的 CALB非常稳定。

3.4. 含汞水系统中的 HRP 活性

氧化应激导致不受控制的氧化，导致生物体内器官和系统的逐渐恶化和崩溃 [ 32 ]。过氧化物酶是重要的解毒酶，用于清除细胞中的多余物质

图 3。Hg 2+对 EDTA IL 缓冲系统中 HRP 活性的影响。[HRP] = 7.8 nM 和 [Hg 2+ ] = 6.0 mM。500 μL 愈创木酚溶液（1.0 mM）；5 μL H 2 O 2 (300 mM )；温度, 298 K. 愈创木酚氧化的初始速度 (v 0 ) 由吸光度与时间的线性图确定，消光系数为 2.66 × 10 4米 -1 ∙cm -1用于愈创木酚衍生的氧化产物。误差线代表测量的标准偏差。

图 4。比较 Hg 2+对 EDTA IL 和 BTP 缓冲系统中 HRP 活性的影响。[HRP] = 7.8 nM 和 [Hg 2+ ] = 6.0 mM。r 0和r Hg分别是无汞和含汞系统的初始速率。

H 2 O 2辣根过氧化物酶 (HRP) 是特征最好的过氧化物酶之一 [ 33 ]。Hg 2+对HRP 的影响可以通过H 2 O 2依赖性氧化的活性来容易地测定，这可以使用愈创木酚的H 2 O 2依赖性氧化在470nm处分光光度法测定。

图3显示EDTA IL缓冲液作为Hg 2+螯合剂保护HRP免受Hg 2+诱导的变性和沉淀。较高的 pH 值有利于保护，而在较低的 pH 值下，保护作用减弱。因为 EDTA 的去质子化共轭碱的浓度随着溶液 pH 值的增加而增加，其随后增加的与 Hg 2+的结合导致 HRP 保护免受 Hg 2+诱导的变性。相反，BTP缓冲体系中几乎没有Hg 2+螯合剂，从而发生Hg 2+抑制作用。这种螯合效应无疑解释了图 3和图 4的差异。

4。结论

总之，基于 EDTA 的 ILs 是通过用 EDTA 酸中和 [BMIM]OH 合成的，用于开发缓冲酶 IL 系统和在含重金属的水系统中进行酶促反应。在缓冲的 [C 2 OHMIM][BF 4 ] 中，CALB 的酯交换活性取决于缓冲液，并且 CALB 在循环过程中是稳定的。在 EDTA IL 缓冲水体系中，EDTA 作为 Hg 2+螯合剂保护 HRP 免受 Hg 2+诱导的变性和沉淀。较高的 pH 值有利于保护，而在较低的 pH 值下，保护作用减弱。我们可以得出结论，新的 IL 具有缓冲和螯合能力，可用于酶促应用。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据包含在文章中。

致谢

感谢福建省自然科学基金（2017J01635、2019J01699）、国家自然科学基金（41576085）和福建省食品微生物与酶工程重点实验室（B18097-7）的资助。

利益冲突

作者声明与本文的发表没有利益冲突。

参考

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