膳食碳水化合物型瘤胃发酵调节乙酸丙酸比机制的研究

摘要：我们团队的研究方向是反刍动物的营养与生理，包括日粮营养代谢和瘤胃微生物。以前的研究表明瘤胃乙酸丙酸比与日粮利用效率有关。目前认为影响瘤胃乙酸丙酸比的主要因素是日粮降解率和瘤胃微生物结构，但主要机制尚不清楚。本研究发现，瘤胃乙酸-丙酸比的影响不受发酵底物浓度的影响，但受瘤胃微生物群结构的影响。我们认为瘤胃微生物区系结构的变化是调节瘤胃乙酸-丙酸比的主要机制。这将有助于人们进一步了解瘤胃生理，从而逐步提高饲料转化效率，降低生产成本。抽象的：为了探索日粮调节乙酸与丙酸摩尔比（A:P 比）的机制，我们通过改变日粮浓缩物与粗饲料的比例和丙酮酸钙输液比较了对瘤胃发酵参数和微生物组的影响。 . 试验动物为崂山奶山羊，通过自动喂食器连续喂食。给试验组喂食低浓缩物的基础饮食，并在瘤胃内注入两种浓度的丙酮酸钙。输注浓度来源于高浓度和低浓度日粮碳水化合物降解率的差异，人为设定高浓度输注组的输注浓度是低浓度输注组的两倍。对照组饲喂高精饲料 （6:4）和低浓缩（3:7）饮食，分别。通过测量瘤胃发酵参数和微生物组成，得到以下结果：高精饲料组瘤胃A：P比显着低于低精饲料组（P < 0.05）。低浓度丙酮酸钙灌注对瘤胃A:P比无显着影响（P > 0.05），而高浓度丙酮酸钙灌注显着提高瘤胃A:P比（P < 0.05）。相对于饲喂低浓缩日粮的山羊，饲喂高浓缩日粮的山羊具有更多与丙酸盐生产相关的微生物，而与纤维降解相关的微生物丰度降低。丙酮酸输注无显着性 瘤胃微生物结构的影响。上述结果表明，在不影响菌群组成的情况下增加发酵底物的浓度不会降低 A:P 的比例。微生物学结果表明，A:P比与瘤胃微生物区系结构的关系更为密切。因此，认为瘤胃菌群结构是调节瘤胃发酵中A:P比的主要机制。

关键词

.瘤胃 乙酸 丙酸 比例,丙酮酸 钙,瘤胃 微生物 组,挥发性 脂肪酸;

一、简介

降低瘤胃乙酸丙酸比（A:P比）可以提高日粮能量利用效率。早期研究发现瘤胃 A:P 比例与膳食结构有关 [ 1 ] [ 2 ]。但大量研究也表明，在相同的日粮结构下，瘤胃A:P的比例会随着日粮降解率的变化而变化[ 3 ][ 4 ]。如果日粮降解率的变化也影响瘤胃微生物组成，那么日粮调节瘤胃发酵 A:P 比的主要机制是什么？

在碳水化合物变成挥发性脂肪酸 (VFA) 之前，它必须转化为丙酮酸 [ 5]。丙酮酸分子很小，很容易穿过细胞膜，很容易被瘤胃中的大多数微生物利用。与碳水化合物的其他水解产物相比，丙酮酸在微生物中分布更均匀。在这项研究中，通过瘤胃输注高浓度和低浓度丙酮酸钙模拟不同的碳水化合物降解率，并调整丙酮酸水平，使动物具有相似的丙酮酸水平，而不管它们的日粮精粗比如何。通过比较不同精粗比和不同浓度丙酮酸钙日粮对瘤胃VFA和菌群结构的影响，探讨日粮调节瘤胃A:P比的主要机制。

2。材料和方法

2.1。动物

选择8只崂山奶山羊，健康状况良好，产奶量相似（2.00±0.4 kg），体重相似（45±2 kg），经产未妊娠。其中四人安装了永久性瘤胃瘘管。

2.2. 试验饮食

试验日粮是根据英国 AFRC (1993) 准备的。高精饲料含有6份精饲料和4份粗饲料，而低精饲料含有3份精饲料和7份粗饲料。日粮用制粒机制粒（表 1）。

2.3. 饲养管理

山羊被单独饲养在单只动物笼子中，每4小时通过自动喂食器喂食350克，并可以自由饮水。山羊是

治疗

H

大号

成分 (% DM)

集中

60

30

粗饲料

40

70

玉米

27.5

10

豆粕

15

15

麸

15

5

花生藤

10

42.5

苜蓿干草

30

25

碳酸钙4

0.1

1

石灰石

0.9

0

氯化钠

0.5

0.5

预混料1

1

1

营养水平 (%)

NEL/(Mcal/kg)

1.49

1.28

DM

91.36

92.22

OM

81.15

80.99

CP

16.58

15.21

NDF

30.60

35.18

ADF

20.25

27.26

NFC2

31.04

29.09

EE

2.93

1.51

日常活动

3.22

6.48

表 1。饮食的成分和化学成分。

1 个预混料：VA 1000 KIU/​​kg；VD 3250 KIU/​​kg，VE 2400 mg/kg，烟酸 2000 mg/kg，Fe 2000 mg/kg；Mn 3000 mg/kg、Cu 3000 mg/kg、Zn 14,000 mg/kg、Se 100 mg/kg、I 180 mg/kg 和 Co 40 mg/kg。2 NFC = 100 - (% NDF + % CP + % EE + % 灰分)。NFC 和 NEL 是计算值，其他是通过实验确定的。H是高浓缩饮食。L 是低浓度饮食。

在进入各自的笼子之前，按照常规管理程序进行驱虫和蹄蹄。给造瘘的动物30天从瘤胃手术中恢复。在恢复的第一周，提供了高质量的干草。随后饲喂量增加，并给予少量饮水。在恢复的后期，山羊可以免费使用甘薯藤。

2.4. 实验设计

两种日粮的瘤胃有效降解率（用尼龙袋法测定）在高精料组和低精料组中分别为33.48%和33.42%（表2和表3）。根据分子式和纯度计算，两种日粮在瘤胃中可发酵碳水化合物降解的差异计算为 5.27 g/d，相当于 6.47 g/d 粗丙酮酸。因此，低浓度组通过恒流泵注入 6.47 g/d 丙酮酸钙。在饮食成分方面，高浓度饮食组注入的丙酮酸钙是低浓度饮食组的两倍。

计算出的高浓度和低浓度日粮之间的可发酵碳水化合物差异相当于 6.46 g/d 丙酮酸。

时间

降解率 %

扫描电镜

磷

H

大号

1小时

18.84

20.52

1.586

1.000

2小时

21.84

21.75

1.656

1.000

4小时

20.67

24.59

1.584

0.495

8 小时

26.81

26.35

1.584

1.000

16 小时

28.86

30.56

1.742

1.000

24 小时

35.84

38.72

1.463

0.837

36 小时

34.35

37.89

1.625

0.709

48 小时

40.09

41.23

1.573

1.000

表 2。瘤胃实时降解率。

H是高浓缩饮食。L 是低浓度饮食。

H

大号

一个

19.5350

19.1614

b

24.7006

24.1493

C

0.0441

0.0490

ķ

0.0340

0.0340

ED

33.4841

33.4230

表 3。有效降解率参数。

H是高浓缩饮食。L 是低浓度饮食。

瘤胃丙酮酸钙输注试验采用 2 × 2 交互设计。该测试有两个治疗组。每组包含两只瘘管山羊，它们只喂低浓度的饮食。通过瘤胃瘘管通过恒流泵全天以恒定速率注入不同浓度的丙酮酸钙溶液。其余4只无瘘管山羊随机分为2个对照组，按照2×2交互设计饲喂高精料和低精料。每个试验期持续20天，预饲期16天，采样期4天。在每次试验结束时，将动物转移到下一次试验。

2.5. 样品采集

在每个取样期间，在早晨喂食后通过瘤胃瘘管收集瘤胃食糜。通过 2 层纱布加压过滤获得瘤胃液样品。收集瘤胃液后立即用pH计测量pH。然后将收集的瘤胃液样品作为 4 mL 等分试样储存在 5 mL 冷冻管中。其中两个用于-20˚C 测定挥发性脂肪酸。一份在液氮中冷冻，然后储存在-80˚C 用于微生物测定，其余部分冷冻在-80˚C 备用。

2.6. 样品测量

日粮干物质（DM）按GB 6435-86测定。粗蛋白（CP）按GB/T 6432-94测定。木质素（ADL）和中性洗涤纤维（NDF）的测定按GB/T 20806-2006进行。如NY/T 1459-2007中所述测定酸性洗涤纤维(ADF)。粗灰分（Ash）按GB/T 6438-86测定。粗脂肪（EE）按GB/T 6433-2006测定。通过气相色谱法测定瘤胃液 VFA。使用 MiSeq 高通量测序技术确定瘤胃液微生物群落组成。

微生物测序和otu图谱工作委托山东开元基因科技有限公司完成，对原始数据进行过滤，消除接头污染和低质量reads，获得干净的序列。根据 phred 算法，在 30 bp 滑动窗口上平均质量低于 20 的序列读取被截断，并且修剪后的读取长度小于其原始长度的 75%，以及其配对读取被删除。然后，使用 FLASH 将具有重叠的双端读取合并到标签中。通过软件 USEARCH 的脚本，标签以 97% 的序列相似性聚集到 OTU。维恩图和软件 R (v3.0.3) 的软件包“ade4”分别用于维恩图和 OTU PCA 分析。每个分类等级的标签号（门、类、目、科、属、和物种）或不同样品中的 OTU 汇总在一个分析表中。对于所有样本，丰度低于 0.5% 的物种被归入其他等级的“其他”。

2.7. 数据分析

瘤胃pH、VFA等数据采用SAS 9.1软件MIXED过程进行方差分析。统计模型为：

是我j k= μ +α一世+βj+γķ+e我j k

其中 μ = 总体平均值；α i = 第 i 个实验期的固定效应；β j = 丙酮酸钙剂量的连续效应；γ k = 第 k 个动物的随机效应；e ijk = 随机误差。最初测试了丙酮酸钙剂量的线性和次要效应。当发现次要效应不显着时，将它们从模型中删除。执行了人的相关性测试程序。在 P < 0.05 时该效应被认为是显着的，在 0.05 < P < 0.1 时被认为是有影响的趋势。

3. 结果

3.1。日粮浓缩比和丙酮酸钙输液对瘤胃发酵VFA含量的影响

表 4显示了不同日粮浓缩比和不同丙酮酸钙注入浓度对瘤胃 pH 值和瘤胃挥发性脂肪酸（VFA）浓度的影响。如表所示，饲喂不同浓缩物水平的饲料的动物之间的平均瘤胃 pH 值存在显着差异。高精饲料组瘤胃平均pH值显着低于低精饲料组（P < 0.01）。丙酮酸钙的注入增加了瘤胃的平均 pH 值，尽管这并不显着。处理间总 VFA 差异不显着（P > 0.05），

治疗1

磷

H

大号

二

左旋

平均Ph

6.27±0.21

6.72b± 0.07

6.96b± 0.07

6.87b± 0.04

<0.01

TVFA 毫摩尔/升

81.65 ± 10.48

77.73 ± 7.52

87.96 ± 6.35

98.96 ± 8.97

0.35

乙酸 mmol/L

38.56 ± 2.23

44.37 ± 3.01

41.09 ± 1.86

42.97 ± 1.98

0.37

丙酸 mmol/L

25.17±3.66

21.00抗体± 2.69

17.49b± 1.14

16.14b± 0.72

0.02

丁酸盐 mmol/L

23.25 ± 2.07

22.58 ± 4.30

24.05 ± 1.33

24.73 ± 1.18

0.94

异丁酸 mmol/L

1.27±0.45

1.33±0.31

2.22±0.28

2.03±0.13

0.12

戊酸 mmol/L

3.66±0.17

3.73±0.28

3.97±0.20

3.65±0.21

0.76

异戊酸 mmol/L

2.13±0.75

2.10 ± 0.49

3.32±0.64

3.04±0.19

0.28

己酸 mmol/L

1.29±0.16

1.19±0.05

0.79b± 0.17

0.61b± 0.05

<0.01

A：P比

1.47±0.29

1.90抗体± 0.15

2.08抗体± 0.13

2.36b± 0.17

0.047

表 4。瘤胃发酵参数。

H表示高浓度饮食组；L表示低浓度饮食组；LL表示低浓度日粮输注低浓度丙酮酸钙组；LH表示低浓度日粮输注高浓度丙酮酸钙组。同行同上标或不带上标差异不显着（P > 0.05），不同上标差异显着（P < 0.05）。

瘤胃乙酸浓度无显着差异（P > 0.05）。从数值上看，高精饲料组的乙酸浓度低于低精饲料组。丙酮酸钙的灌注对瘤胃乙酸浓度影响不大。低精饲料组的丙酸盐显着低于高精饲料组（P < 0.05）。瘤胃内注入丙酮酸钙后，瘤胃丙酸浓度进一步降低；因此，高浓度的丙酮酸钙显着降低了瘤胃中丙酸的浓度。丙酮酸钙输注后瘤胃丁酸浓度升高，但各处理组丁酸浓度差异不显着（P > 0. 05)。处理间异丁酸浓度差异不显着（P > 0.05），戊酸浓度差异也不显着（P > 0.05）。输注丙酮酸钙增加异戊酸浓度，但差异不显着（P>0.05）。日粮浓缩比对瘤胃己酸浓度的影响不显着。然而，随着丙酮酸钙输注浓度的增加，己酸浓度显着降低（P < 0.01）。相对于低精饲料组，高精饲料组瘤胃A：P比显着降低（P < 0.05），但丙酮酸钙输注后该比值增加。然而，瘤胃A没有显着差异：表 4）。

3.2. 日粮浓缩比和丙酮酸钙输液对瘤胃菌群结构的影响

3.2.1。OTU 聚类和丰度

通过聚类分析获得每个样本中每个操作分类单元（OTU）的丰度。OTU丰度初步说明了样本的物种丰富度。为了获得每个OTU对应的物种分类信息，使用RDP分类器贝叶斯算法对OTU代表序列进行97%相似度的分类，并在每个分类级别计算每个样本的群落组成：域、王国、门、纲、目、科、属和种。高浓缩饮食组平均有 3309 个 OTU，低浓缩饮食组平均有 3032 个 OTU。低浓度丙酮酸输注组平均有3412个OTU，而高丙酮酸输注组平均有3479个OTU。图1）不同处理和不同个体的OTU富集曲线不同。还可以看出，高浓缩日粮组的高丰度OTUs主要集中在顶部，而高丙酮酸钙输注组的高丰度OTUs主要集中在底部。

图 1。前 100 个丰富 OTU 的热图。H表示高浓缩饮食组。L 表示低浓度饮食组。LL表示低浓度日粮输注低浓度丙酮酸组。LH表示低浓度日粮输注高浓度丙酮酸钙组。

总体而言，高浓度日粮的瘤胃微生物组成与低浓度日粮和丙酮酸钙注入组的瘤胃微生物组成显着不同。

3.2.2. 社区分析

测序结果显示，瘤胃液样本共涵盖细菌28门62纲114目185科414属752种。贡献超过 1% 微生物组的属包括普氏菌属（Prevotella_1，Prevotellaaceae_unclassified，Prevotellaaceae_UCG-001，Prevotellaceae_UCG-003，Prevotellaceae_Ga6A1_group，Prevotellaceae_YAB2003_group），norank，弧菌（Succinivibrionaceae_UCG-002，Succikenniclasticum，Succinivibrio）， _RC9_gut_group), Veillonella (Veillonellaceae_unclassified, Veillonellaceae_UCG−001), Streptococcus, Methanobrevibacter, Selenomonas (Selenomonas_1, Selenomonas_3), Treponema (Treponema_2), Ruminococcus (Rumincoccaceae_NK4A214_group, Ruminococcaceae_UCG−014, Ruminococcus_1, Ruminococcaceae_UCG−002, Ruminococcaceae _V9D2013_group, Ruminococcus_2), Megasphaera, Christensenella (Christensenellaceae_R−7_group), Roseburia, Lachnospira (Laxnospiraceae_NK3A20_group, Lachnospiraceae_unclassifi Ed, Lachnospiraceae_ND3007_group), Fibrobacter, Butyrivibrio (Butyrivibrio_2), Quinella, Bacteroides (Bacteroidales_unclassified, Bacteroidetes_unclassified), uncultured, Anaerovibrio (Anaerovibrio, Anaeroplasma), Moryella, Erysipelas ( Erysipelotrichaceae_UCG-004)、Phocaeicola、Tyzzerella_3、Ruminiclostridium_6、[Eubacterium]_coprostanoligenes_group 和 Methanimicrococcus。每个样品中瘤胃菌群的分布如图所示 Bacteroidetes_unclassified）、未培养、厌氧弧菌（厌氧弧菌、厌氧原体）、Moryella、丹毒（Erysipelotrichaceae_UCG-004）、Phocaeicola、Tyzzerella_3、Ruminiclostridium_6、[Eubacterium]_coprostanoligenes_group 和 Methanimicrococcus。每个样品中瘤胃菌群的分布如图所示 Bacteroidetes_unclassified）、未培养、厌氧弧菌（厌氧弧菌、厌氧原体）、Moryella、丹毒（Erysipelotrichaceae_UCG-004）、Phocaeicola、Tyzzerella_3、Ruminiclostridium_6、[Eubacterium]_coprostanoligenes_group 和 Methanimicrococcus。每个样品中瘤胃菌群的分布如图所示图 2。

3.2.3。物种多样性的差异

各组瘤胃微生物多样性指标见表5。组间瘤胃微生物多样性指数差异无统计学意义（P > 0.05）。因此，这些差异未在表中标出。但丙酮酸钙输注后各组的总读数增加（P=0.076），说明丙酮酸钙输注有增加细菌总数的趋势；然而，这些差异并不显着。根据香农指数和辛普森指数可以看出，低精饲料组的物种多样性高于高精饲料组。瘤胃灌注丙酮酸钙后瘤胃微生物多样性进一步增加。然而，各组之间的差异并不显着。

3.2.4。治疗之间差异的显着分析

表6显示了治疗组之间属水平的Wilcoxon秩和检验的结果。它侧重于丰度大于 1% 且差异显着的物种。总体而言，差异主要集中在

治疗

读取

0.97

OTU

高手

超

覆盖范围

香农

辛普森

H

493,204

13,237

13,237

(13,237, 13,237)

13,237

(13,237, 13,237)

1.000000

5.22

(5.21, 5.23)

0.026

(0.0258, 0.0262)

大号

417,465

12,126

12,142

(12,136,12,152)

12,126

(12,126, 12,128)

0.999907

5.54

(5.53, 5.55)

0.0194

(0.0192, 0.0196)

二

507,798

13,646

13,646

(13,646, 13,646)

13,646

(13,646, 13,646)

1.000000

5.66

(5.64, 5.67)

0.0144

(0.0143, 0.0145)

左旋

541,018

13,919

13,919

(13,919, 13,919)

13,919

(13,919, 13,919)

1.000000

5.56

(5.55, 5.57)

0.0135

(0.0134, 0.0136)

表 5.瘤胃微生物多样性指数。

H表示高浓缩饮食组。L 表示低浓度饮食组。LL表示低精饲料低浓度丙酮酸输注组，LH表示低精饲料高浓度丙酮酸钙输注组。

图 2。每个治疗组的分类和物种组成。H表示高浓缩饮食组。L 表示低浓度饮食组。LL表示低精饲料低浓度丙酮酸输注组，LH表示低精饲料高浓度丙酮酸钙输注组。 上、中、下面板分别是门级、目级和属级。仅显示丰度超过 1% 的分类群。

属1

平均值2(H)

标准差3(H)

平均值 (L)

标准差 (L)

p 值4

[真细菌]_coprostanoligenes_group*

0.0003

0.0002

0.0046

0.0068

0.0304

纤维杆菌*

0.0276

0.0115

0.0046

0.0063

0.0304

普雷沃氏菌_1

0.3732

0.1072

0.2352

0.1359

0.1939

普氏菌科_Ga6A1_group

0.0114

0.0152

0.0008

0.0007

0.665

普氏菌科_UCG-001

0.062

0.0658

0.03

0.0217

1

普氏菌科_YAB2003_group*

0.0093

0.0092

0.0005

0.0004

0.0304

Rikenellaceae_RC9_gut_group

0.0162

0.0113

0.075

0.0798

0.1124

罗斯布里亚*

0.0308

0.0206

0.0026

0.0041

0.0304

瘤胃球菌科_UCG-002*

0.0001

0.0001

0.0082

0.0075

0.0304

瘤胃球菌科_UCG-014

0.0384

0.0278

0.0113

0.0135

0.1939

瘤胃球菌科_V9D2013_group*

0

0

0.0074

0.0096

0.0211

硒单胞菌_1

0.0108

0.006

0.0233

0.0284

1

丁二烯

0.031

0.027

0.0363

0.0316

0.8852

琥珀弧菌

0.0179

0.0183

0.0079

0.0108

0.4705

琥珀弧菌科_UCG-002

0.1966

0.2011

0.0693

0.1385

0.1939

密螺旋体_2

0.0453

0.0406

0.0281

0.0431

0.1939

平均值 (H)

标准差 (H)

平均值 (LL)

标准差 (LL)

p 值

[真细菌]_coprostanoligenes_group*

0.0003

0.0002

0.0016

0.0008

0.0304

无形体*

0.0025

0.0014

0.0111

0.0046

0.0304

Butyrivibrio_2*

0.0012

0.0013

0.0255

0.0096

0.0304

纤维杆菌*

0.0276

0.0115

0.0045

0.0045

0.0304

毛螺菌科_ND3007_group*

0.0006

0.0006

0.015

0.0032

0.0304

大球体*

0.001

0.0005

0

0

0.0265

普雷沃氏菌_1

0.3732

0.1072

0.3142

0.1266

0.8852

普氏菌科_Ga6A1_group

0.0114

0.0152

0.0008

0.0007

0.4705

普氏菌科_UCG-001

0.062

0.0658

0.0703

0.0962

0.665

普氏菌科_UCG-003*

0.0057

0.0017

0.0502

0.0254

0.0304

普氏菌科_YAB2003_group*

0.0093

0.0092

0.0003

0.0003

0.0304

Rikenellaceae_RC9_gut_group*

0.0162

0.0113

0.082

0.0237

0.0304

罗斯布里亚*

0.0308

0.0206

0.0044

0.0034

0.0304

瘤胃球菌科_UCG-002

0.0001

0.0001

0.0173

0.0213

0.0304

瘤胃球菌科_UCG-014

0.0384

0.0278

0.009

0.0065

0.0606

瘤胃球菌科_V9D2013_group*

0

0

0.008

0.0111

0.0211

瘤胃球菌_2*

0.0017

0.0002

0.0006

0.0004

0.0304

硒单胞菌_1

0.0108

0.006

0.0325

0.0312

0.4705

硒单胞菌_3*

0

0

0.0066

0.0051

0.0265

丁二烯

0

0

0

0

0.4533

琥珀弧菌

0.0179

0.0183

0.0048

0.0039

0.4705

表 6。Wilcoxon 测试结果。

H表示高浓缩饮食组。L 表示低浓度饮食组。LL表示低精饲料低浓度丙酮酸输注组，LH表示低精饲料高浓度丙酮酸钙输注组。1属：属级；2平均值：样本组中物种的平均相对丰度；3 Sd：样本组中物种相对丰度的标准差；4 p 值：假设在两组检验中为真的概率。在 p < 0.05 时差异被认为是显着的，用 * 表示，在 p < 0.01 时认为差异非常显着，用 ** 表示。

高浓缩饮食组与其他三组的比较。绝大多数在低浓缩饮食组和丙酮酸钙输注组之间没有显着差异。在四组样本中，丰度始终大于1%的分别为普氏菌属（Prevotella_1和Prevotellaaceae_UCG-001）、Rikenellaceae_RC9_gut_group、Selenomonas_1和Succiniclasticum，除Rikenonella外，这些属的组间差异不显着。Prevotella_1 的丰度在四个处理组之间没有显着差异，并且始终是瘤胃中最丰富的。在四组样本中，Prevotella_1 的丰度始终在 23% 以上。

如表6所示, 高精饲料组真杆菌属 (coprostanoligenes_group) 和瘤胃球菌属 (Ruminococcaceae_UCG-002 和瘤胃球菌科_V9D2013_group) 含量显着低于低精饲料组, 纤维杆菌、普雷沃菌科_YAB2003_group 和 Roseburia 含量显着升高。与低浓度丙酮酸输注组相比，高浓度日粮组的coprostanoligenes_group、Anaeroplasma、Butyrivibrio_2、Lachnospiraceae_ND3007_group、Prevotellaceae_UCG-003、Rikenellaceae_RC9_gut_group、Ruminococcaceae_UCG-002、Ruminococcaceae_V9D2013_group、Selenomonas_3、Tyzzellaaceae_UCG-001、Veillone的含量显着降低。 Fibrobacter、Megasphaera、Prevotellaceae_YAB2003_group、Ruminococcus_2、Roseburia 和琥珀弧菌科_UCG-002。与高浓度丙酮酸输注组相比，高浓度日粮组coprostanoligenes_group、Butyrivibrio_2、Lachnospiraceae_ND3007_group、Prevotellaceae_UCG-003、Rikenellaceae_RC9_gut_group、Ruminococcaceae_UCG-002、Ruminococcaceae_V9D2013_group、Selenomonas_01、Veillonellaceae_UCG-01的含量显着降低。 Fibrobacter、Mesphaera、Prevotellaceae_YAB2003_group、Ruminococcaceae_UCG-014、Ruminococcus_2、Succinivibrionaceae_UCG-002 和 Treponema_2。

两个丙酮酸钙输注组和低浓缩饮食组之间没有显着差异，只有低浓缩饮食组的Christensenellaceae_R-7_group显着低于低浓度丙酮酸输注组。低精饲料组和丙酮酸钙输液组的瘤胃球菌科_UCG-002和瘤胃球菌科_V9D2013_组)和真杆菌属_组的含量显着高于高精饲料组，低精饲料组普氏菌属普氏菌属_YAB2003_组和纤维杆菌的含量显着降低。浓缩饮食组和丙酮酸钙输注组高于高浓缩饮食组。

4。讨论

4.1。丙酮酸输液对瘤胃 A:P 比值的影响

膳食 NDF 水平的增加会降低 DMI。其主要原因是过量摄入NDF会增加瘤胃食糜体积，增加饱腹感，从而降低DMI。阿雷洛维奇等人。总结了一些研究表明，如果奶牛的 NDF 含量在 22.5% 和 45% 之间变化，DMI 和 NDF 含量之间存在显着的负相关 [ 6 ]。除了影响采食量外，日粮 NDF 水平还会影响摄食行为和养分消化率 [ 7]。增加的采食量可能会在我们的研究中引入其他因素，例如喂食时间、咀嚼时间、流涎等。饲料的加工方式也是一个影响因素。虽然江的研究发现粗饲料粒度对流涎的影响不大[ 8]，我们知道改变粗饲料颗粒的大小会影响降解率。因此，为排除采食量、挑食行为和日粮加工方法等可能影响试验的因素的干扰，本试验采用连续饲喂，尽可能保持瘤胃环境稳定；每只试验动物喂食相同数量的饲料，并以相同的方式加工。结果表明，两种日粮对可发酵碳水化合物的有效降解率无显着差异。这可能与饮食的加工方式有关。粉碎造粒增加了膳食纤维与瘤胃微生物的接触面积，促进了膳食纤维的降解。9]。因此，低精饲料在瘤胃中的有效降解率并不比高精饲料差多少。虽然两种日粮的有效降解率差异不显着，但高浓缩日粮中可发酵碳水化合物含量的差异显着高于低浓缩日粮。因此，高精饲料单位时间内产生的发酵底物浓度明显高于低精饲料。我们的瘤胃发酵结果与大多数研究的结果相同。日粮浓缩物比例的增加伴随着瘤胃 A:P 比例的降低。对于低浓度日粮，低浓度丙酮酸的瘤胃灌注没有显着改变瘤胃 A:P 比，而高浓度丙酮酸的输注确实发生了 A:P 比率的显着增加。陈等人。还发现丙酮酸的添加增加了瘤胃 A:P 的比例 [10 ]。

低精饲料组瘤胃灌注丙酮酸钙后，瘤胃丙酸比例显着降低，瘤胃醋酸丙烯比显着升高，己酸比例显着降低。同时，虽然总挥发性脂肪酸浓度增加，但瘤胃 pH 值的差异不显着。在产生 VFA 的过程中，碳水化合物首先被微生物细胞降解为丙酮酸。注入丙酮酸钙相当于增加发酵的底物浓度。在本实验中输注丙酮酸钙后，低精饲料组的底物水平达到了与高精饲料组一样高的水平。根据以往的研究结果，11 ] [ 12 ] [ 13 ] [ 14]。然而，与之前的研究结果相比，高浓度饮食组在输注丙酮酸钙后 A:P 比率的变化趋势相反。丙酮酸钙的瘤胃输液可能无法模拟真实的丙酮酸分布，这可能会导致差异。由于丙酮酸主要存在于微生物细胞中，因此在瘤胃液中可检测到的丙酮酸浓度非常低。在高浓缩饮食中，NFC 水平很高。NFC降解产生的寡糖和单糖只能被一些微生物利用。例如，瘤胃黄色瘤胃球菌不能利用葡萄糖，而瘤胃瘤胃球菌优先利用纤维二糖。结果，发酵底物在瘤胃中的分布不同，这会影响微生物群落的组成。在高精饲料组中，与NFC降解相关的微生物大量繁殖，NFC降解产生的单糖或寡糖被这些微生物迅速捕获和利用。这类微生物往往与丙酸盐的形成密切相关，如淀粉降解菌和乳酸产生菌。在弱酸性瘤胃环境中，丙酮酸变成丙酮酸。作为发酵的底物，丙酮酸可以被广泛的微生物均匀地或略微不均匀地分布、吸收和利用。对于低浓度日粮，瘤胃发酵主要以乙酸类型发生。因此，在丙酮酸输液后，丙酮酸钙被大量与醋酸生产有关的微生物所利用，促进了这组微生物的生长。随后，瘤胃 A:P 比不降低，而是增加。瘤胃 VFA 的结果不支持之前的假设之一。碳水化合物发酵的速率可能不是调节 A:P 比例的主要因素。因此，人们对这一假设持怀疑态度，因为丙酮酸输液并不能真实地模拟不同降解速率下丙酮酸在瘤胃微生物中的真实分布。碳水化合物发酵的速率可能不是调节 A:P 比例的主要因素。因此，人们对这一假设持怀疑态度，因为丙酮酸输液并不能真实地模拟不同降解速率下丙酮酸在瘤胃微生物中的真实分布。碳水化合物发酵的速率可能不是调节 A:P 比例的主要因素。因此，人们对这一假设持怀疑态度，因为丙酮酸输液并不能真实地模拟不同降解速率下丙酮酸在瘤胃微生物中的真实分布。

4.2. 瘤胃微生物对瘤胃发酵的影响

4.2.1。高浓度和低浓度日粮瘤胃液微生物区系差异

瘤胃液样品中含量最多的三个门是拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门，这一结果与之前的研究结果一致 [ 15]。低浓度饮食组的厚壁菌门明显多于高浓度饮食组。相反，低浓度饮食组的变形菌和拟杆菌属显着低于高浓度饮食组。在属水平上，高精饲料组的真杆菌属(coprostanoligenes_group)和瘤胃球菌属(Ruminococcaceae_UCG-002和瘤胃球菌科_V9D2013_group)显着低于低精饲料组，而纤维杆菌属、普氏菌属(Prevotellaceae_YAB2003_group)和Roseburia显着高于低精饲料组高精饲料组比低精饲料组高。瘤胃球菌是厚壁菌门梭状芽孢杆菌中数量最多的一种，是瘤胃中主要的纤维降解菌。它们能产生大量的纤维素和半纤维素，一般不产生丙酸。纤维杆菌属是纤维降解细菌的唯一属。它也被称为Fibrobacter succinogenes，发酵产物通常是琥珀酸。酸利用细菌利用琥珀酸通过琥珀酸途径产生丙酸，这增加了瘤胃中丙酸盐的比例。Roseburia 属是一种可以发酵葡萄糖和麦芽糖的放线菌。葡萄糖发酵后，Roseburia 主要产生乳酸和少量乙酸、甲酸和琥珀酸。普氏菌是瘤胃中含量最多的细菌。虽然它是一种淀粉降解菌，它是有效的，可以降解并利用淀粉和植物细胞壁多糖，如木聚糖和果胶。它还可以降解蛋白质，但不能降解纤维素。其发酵产物主要为乙酸、丁二酸和丙酸。通过比较，我们发现低浓度饮食组比高浓度饮食组具有更丰富的纤维降解相关菌群。与低浓度饮食相比，高浓度饮食组与高产丙酸细菌有关。这可能是不同浓缩物的日粮 A:P 比例不同的原因。我们发现低浓度饮食组的纤维降解相关菌群比高浓度饮食组丰富。与低浓度饮食相比，高浓度饮食组与高产丙酸细菌有关。这可能是不同浓缩物的日粮 A:P 比例不同的原因。我们发现低浓度饮食组的纤维降解相关菌群比高浓度饮食组丰富。与低浓度饮食相比，高浓度饮食组与高产丙酸细菌有关。这可能是不同浓缩物的日粮 A:P 比例不同的原因。

4.2.2. 不同浓度丙酮酸钙输注后瘤胃菌群变化

瘤胃灌输不同浓度丙酮酸钙后，变形杆菌的含量显着低于高浓缩组和低浓缩组。在两个丙酮酸钙输注组中，拟杆菌门最常见，其次是厚壁菌门。这两组中Euryarcheaota的含量也显着高于高浓缩饮食组。Euryarcheaota 是一个主要类别，也称为古细菌，在瘤胃中包括许多产甲烷菌。在属水平上，Wilcoxon秩和检验表明，丙酮酸输液组瘤胃微生物与低精饲料组差异不显着，与高精饲料组差异显着。很可能与不同类型的膳食碳水化合物相比，

高浓度饮食组的巨球菌、琥珀弧菌（Succinivibrionaceae_UCG-002）、瘤胃球菌（Ruminococcus_2）、普氏菌属（Prevotellaceae_YAB2003_group）和纤维杆菌的含量显着高于两个丙酮酸输注组。Megasphaera elsdenii 是在饲喂高谷物饮食的幼年和成年动物瘤胃中发现的常见 Megasphaera 物种。作为一种利用乳酸的细菌，其主要作用是发酵D型和L型乳酸，发酵产物主要为丙酸、丁酸等。先前的一项研究发现，膳食 NFC/NDF 的增加显着增加了 M. eldenii 的数量 [ 16]。琥珀弧菌科_UCG-002 是一种半纤维素降解菌。琥珀弧菌的发酵产物主要是乙酸和琥珀酸。R. John Wallace 等人的一项研究。发现低甲烷产量牛的瘤胃中琥珀弧菌含量是高甲烷产量牛的四倍 [ 17]。基于这一观察，一个合理的假设是，琥珀弧菌可能有助于减少物种间的氢转移并减少甲烷的产生。在门水平上，我们发现高浓度饮食组中的 Euryarcheaota 确实不如低浓度饮食组丰富。这意味着高浓缩饮食组将比丙酮酸输注组产生更少的甲烷。这也为高浓度饮食组的 A:P 比低于丙酮酸注入组提供了解释。

两个丙酮酸输注组硒单胞菌_3、丁酸弧菌_2、红球菌(瘤胃球菌科_UCG-002、瘤胃球菌科_V9D2013_group)、Lacnospiraceae_ND3007_group、Prevotellaceae_UCG-003、Rikenellaceae_RC9_gut_group和Veillonellaceae_UCG-001的含量显着高于高浓缩饮食组，但与高浓缩饮食组无显着差异，低浓度组。硒单胞菌是淀粉降解菌；所有硒单胞菌菌株都能发酵淀粉并产生乙酸和丙酸，不能发酵结构碳水化合物；它们可以有效地利用结构碳水化合物的降解产物，例如纤维二糖。此外，硒单胞菌还可以利用乳酸。然而，与 M. elsdenii 不同的是，它们发酵乳酸的能力受到可溶性糖增加的抑制。毛螺菌属半纤维素降解菌，其发酵产物主要为甲酸、乙酸、乳酸等。其他研究表明，Lachnospira 可以产生丁酸 [18 ]。目前认为，理克氏菌属细菌广泛分布于动物的消化道中。它们还产生短链脂肪酸，主要包括乙酸和丙酸。张克等。发现陕北白绒山羊瘤胃中Rikenellaceae_RC9_gut_group的比例从28日龄开始增加，这被认为与纤维素的消化有关[ 19]。Veillonella是不能发酵糖类的利用乳酸的细菌，但可以发酵乳酸、丙酮酸、富马酸、L-苹果酸等。这些细菌在瘤胃中的数量较少，并且不像 M. elsdenii 那样发挥作用。在这个测试中，韦永氏菌的差异可能是由于丙酮酸钙的注入增加了发酵底物，有利于这些细菌的繁殖。

4.3. 瘤胃微生物和丙酮酸浸液浓度对A:P比的影响比较

通过比较可以看出，丙酮酸钙输液对瘤胃微生物没有显着影响。然而，高浓缩饮食组中与丙酸产生相关的菌群明显高于两个丙酮酸输注组，这可能导致高浓缩饮食组的 A:P 比显着高于两个丙酮酸组。输液组。高浓度日粮组的发酵底物浓度低于其他组，特别是高浓度丙酮酸钙输注组。然而，更多与丙酸生产相关的微生物与较低的瘤胃 A:P 比率相关。相比之下，当比较两个丙酮酸钙输注组与低浓度组时，丙酮酸钙输注并未导致 A:P 比值的预期下降，而高浓度组的 A:P 比值显着增加。该结果不支持碳水化合物发酵速率是调节 A:P 比例的主要机制的观点，但微生物组成结果支持 A:P 比例受微生物调节的假设。

这与以往研究的结论不同，以往的研究大多表明提高膳食 NFC 水平或促进碳水化合物发酵可以降低 A:P 比率 [ 8 ] [ 20 ]。这可能是由于通过增加 NFC 水平而改变了瘤胃菌群结构。然而，一些研究发现，日粮 NFC 水平的降低不会导致 A：P 比率发生变化，甚至不会导致瘤胃 A：P 比率升高 [ 21 ] [ 22 ]。原因可能是由于瘤胃微生物功能的冗余和瘤胃微生物的强弹性和复原力，NFC变化幅度不足以引起相关微生物结构的变化[ 23]。碳水化合物发酵速率可能对瘤胃微生物有更大的影响，而不是本实验中丙酮酸钙的微不足道的影响。这可能是该测试结果与其他研究结果不同的原因，其他研究结果通过改变饲料来源和加工工艺降低了 A:P 比率。可以看出，瘤胃A:P比的变化与瘤胃菌群结构的变化有更密切的关系。

5. 结论

结果表明，瘤胃A:P的主要调控机制与瘤胃菌群结构的关系更为密切，不支持碳水化合物降解速率调节瘤胃A:P比的假设。

作者贡献

概念化，林雪燕和王中华；方法论，林雪燕和程冠文；软件，胡志勇和王云；验证，侯秋玲和严振贵；形式分析，Guanwen Cheng 和 Kerong Shi；调查，冠文成；资源，胡志勇；data curation, Guanwen Cheng 和 Shizhe Zhang；写作——原稿准备，程冠文；写作——评论与编辑，林雪燕和张世哲；可视化，王中华；监督，王中华；项目管理，王中华、林雪艳；资金收购，王中华和林雪艳。

资金

该研究得到了国家重点研发计划（2017YFD0500502）、中国现代农业产业技术研究系统（CARS-36）、山东省畜牧业技术研究系统（SDAIT- 09-06），国家自然科学基金（31572427）（31372340），山东省重点研发项目（2016GNC110013），泰山学者项目。

笔记

*作者对这项工作做出了同样的贡献。

利益冲突

作者声明与本文的发表没有利益冲突。

参考

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