肠道微生物群的高脂肪饮食改变会影响小鼠的学习、记忆和焦虑反应

长期摄入高脂肪饮食 (HFD) 有可能导致许多代谢紊乱。理论上它也参与了肠道微生物群的扰动。众所周知，大麻二酚 (CBD) 和欧米茄 3 具有许多药用价值。它们在实验干预中的组​​合使用非常有限。共有 15 只小鼠用于这项研究，分为三组，每组 5 只动物。第 1 组给予水和正常食物随意进食。第 2 组有 HFD 和随意饮水. 第 3 组有 HFD 加 CBD（10 毫克/公斤）和欧米茄 3（200 毫克/公斤），总共 12 周。他们在高架十字迷宫 (EPM) 上进行了测试，并记录了平均进入封闭臂的时间。他们还在 Y 形迷宫上进行了测试，并测量了自发交替。此后处死动物并将盲肠中的粪便内容物收集在无菌瓶中并培养用于大肠杆菌计数。结果发现，与对照组 (80 ± 1.5) 和 CBD + omega 3 组 (78 ± 2.0) 相比，p 值 < 0.05 的 HFD 组的闭臂进入时间 (22.5 ± 2.5) 显着缩短。与对照组 (30 ± 2.8) 和第 2 组 (28 ± 2.5) 相比，第 3 组的交替百分比显着更高 (40 ± 3.3)。第 2 组的大肠杆菌数量显着增加（2.4 × 10 6± 4.5) 与第 1 组 (1.4 × 10 6 ± 5.6) 和第 3 组 (1.42 × 10 6 ± 6.3) 相比。研究结果表明，HFD 增强了肠道大肠杆菌过度生长，而 CBD 和 Omega 3 减少了这种过度生长。CBD 和 omega 3 也显着改善了 HFD 引起的记忆障碍和焦虑诱导。已知与痴呆诱导有关的大肠杆菌被抑制通过干预。提出的可能机制是 CBD 和 omega 3 对 CB1、TRVP 和 5HT 受体在减轻焦虑方面的作用及其抗氧化/抗炎作用在减轻 HFD 的神经炎症作用和通过肠脑轴对大肠杆菌的免疫过度刺激方面的作用。

关键词

HFD ,学习,记忆, CBD , Omega 3 ,焦虑, EPM

一、简介

人类和小鼠的各种系统被数十亿微生物定殖。大多数这些微生物（细菌、病毒和真菌）存在于胃肠道 (GI) 中，它们统称为肠道微生物群 [ 1 ] [ 2 ]。通过肠-脑轴 [ 3 ]在神经和胃肠系统之间建立了密切的关系。肠脑轴 (GBA) 是肠道和大脑之间高度复杂的交互网络，由内分泌、免疫和神经介质组成 [ 4 ]。双向肠道-大脑微生物群相互作用中的插管与某些神经行为障碍（如自闭症、抑郁症、痴呆症、帕金森病和精神分裂症）的病理生理学有关。5 ] [ 6 ]。肠道菌群还能够影响迷走神经活动、调节应激反应、氨基酸代谢和免疫功能控制。已发现肠道微生物群的失调会诱导非典型的免疫信号传导；宿主体内平衡的破坏和各种脑部疾病 [ 2 ] [ 7 ]。微生物组在肠道的早期定植是大脑正常功能的必要条件，例如血脑屏障的完整性和突触可塑性 [ 8 ]。

饮食对肠道微生物组的平衡非常重要。啮齿动物的慢性高脂肪饮食已被证明会改变肠道微生物群的遗传组成和代谢活动 [ 9 ]。最近的研究表明，高脂肪饮食会导致肠道菌群失调、肠道炎症、抗菌肽表达减少、粘液层耗竭、屏障破坏和细菌颗粒进入血流并激活继发性免疫反应，从而导致代谢并发症 [ 10 ]。同样在最近，人们假设肠道微生物群会导致痴呆症，例如阿尔茨海默病 [ 11 ]。

现有文献中关于高脂饮食对肠道微生物组的影响存在不一致之处，这可能是由于微生物组的不同适应造成的[ 12 ]。我们寻求增加关于高脂肪饮食如何影响肠道微生物相对于大脑功能的知识体系。

2。材料和方法

2.1。动物

从马库尔迪贝努埃州立大学健康科学学院动物屋获得总共 15 只体重在 18-25 克（5-6 周）之间的瑞士白化病小鼠。它们被安置在健康科学学院生理学系侧面实验室的聚丙烯笼子中，并分为三组，每组 5 只动物。对照组喂食正常食物和随意饮水，为期12周。第二组也被喂食HFD和随意饮水12周。第三组喂食 HFD 和 Omega-3（200 mg/kg）加上 CBD（10 mg/kg）。

2.2. 高脂肪饮食 (HFD) 成分

如 Julia等人所述，HFD 是自制的。（2018 年）稍作修改，用牛油代替猪油 [ 13 ]。基础饲料、牛脂和豆油的使用率分别为 60%、25% 和 15%。最终饲料的总能量：为5340 kcal/kg，日粮中脂肪百分比为68.7%。

2.3. 标本采集和制备

12周后，在密闭室中用氯仿麻醉后处死动物。取出肠（盲肠）标本并储存在无菌瓶中用于培养。使用选择性培养基（沙门氏菌-志贺氏菌琼脂）分离肠道细菌和粪便标本。将 5.7 g 培养基溶解在 100 ml 蒸馏水中并加热而不沸腾。将其冷却至 50°C - 55°C，然后混合并无菌分配到培养皿中并使其干燥。将肠内容物接种以获得谨慎的菌落。24小时后，将菌落在单独的培养皿中继代培养，以获得另外24小时的纯培养物。在干净的载玻片上制备测试生物培养物的涂片并加热固定。用结晶紫溶液染色 60 秒，然后用流水洗涤。然后用碘溶液冲洗 30 秒，然后逐滴加入酒精脱色。然后将其用番红复染 2 分钟，再次用水冲洗并风干。然后在油浸物镜（×100）下检查载玻片。革兰氏阴性菌呈红色，而革兰氏阴性菌呈紫色 [14 ]。

2.4. 吲哚试验

根据 Cheesbrough (2006) [ 15 ] 进行吲哚测试。将测试生物体接种在装有 3 ml 无菌蛋白胨水的 binjou 瓶中。然后在 35°C - 37°C 下孵育 48 小时。通过添加 0.5 ml Kovac's 试剂测试是否存在吲哚。10 分钟内表面呈红色为阳性结果。

2.5. 三重糖铁测试

三糖琼脂是一种差异培养基，含有蔗糖、乳糖、葡萄糖、硫酸亚铁和酚红。如果有机体发酵所有三种糖，则培养基变黄。如果它只发酵葡萄糖，它会在该区域周围变红。将接种物在琼脂斜面上划线，并使用无菌线环刺入，并在 37°C 下孵育 24 小时。注意到糖发酵和硫化氢产生的证据。后者将沿着倾斜的底部连接处变黑。像大肠杆菌这样的发酵罐会发酵所有的糖。鼠伤寒沙门氏菌会发酵葡萄糖并减少硫 [ 16 ]。

完成细菌菌落的总活菌计数并以每毫升菌落形成单位 (cfu/ml) 表示。

2.6. Y-迷宫

Y迷宫是一种用于评估实验动物工作和空间记忆的工具。它基于动物对新奇事物的天生偏好。具有完整工作记忆和功能性前额叶皮层的小鼠会记住以前访问过的手臂，并显示出进入以前未进入过的手臂的趋势。完整的空间参考记忆和功能性海马体，也可以通过 Y 迷宫进行测试 [ 17 ] [ 18 ] [ 19]。迷宫由木制材料制成，三个相同的臂相互成 120° 角。在实验开始时，用木制百叶窗关闭其中一个臂，并将鼠标置于迷宫中心以探索两个张开的臂5分钟。然后在第二次试验前让动物休息 30 分钟；这一次，所有手臂都张开，动物再探索所有三个手臂 5 分钟。在两次试验之间，迷宫用 70% 乙醇擦拭以消除所有嗅觉线索。测量了最大自发交替（即输入的臂总数负 2）和实际交替（即ABC、ACB、BAC、BCA、CAB 或 CBA）。然后计算百分比交替：

百分比交替=实际交替最大交替× 100

百分比交替与内存指数成正比。

2.7. 统计分析

从研究中获得的数据表示为平均值±SEM。通过单因素方差分析 (ANOVA) 分析组间的差异，然后使用 SPSS 统计工具版本 20 进行事后 Tukey 检验。p < 0.05 的值被认为是显着的。

3. 讨论

这项研究表明，HFD 显着促进了肠道大肠杆菌的生长；CBD 和 omega 3 改善了这种情况（图 1）。与对照组相比，还发现 HFD 在 Y 迷宫实验中抑制学习和视觉空间记忆（图 2）。CBD 和 Omega 3（有效的抗氧化剂和抗炎剂）显着改善了由 HFD 引起的记忆障碍。这些发现表明，HFD 可能通过诱导神经炎症和氧化应激导致记忆障碍，这一点已得到证实

图 1。与其他组相比， HFD 组的肠道大肠杆菌浓度显着升高。*表示统计显着性（p < 0.05）。

图 2。与 HFD 和对照组相比，HFD + CBD + 0 mega 3 组在 Y 迷宫中的自发交替百分比具有统计学意义。*表示统计显着性（p < 0.05）。

由一些文献 [ 20 ] [ 21 ] [ 22 ] [ 23 ]。CBD 和 Omega 3 已分别用于学习和记忆实验，并且已知在某些情况下有效 [ 24 ] [ 25 ] [ 26 ]。通过直接产生淀粉样蛋白斑块或通过沉淀淀粉​​样蛋白前体蛋白 [ 27 ] ，肠道中的大肠杆菌过度生长与痴呆的病因有关。它还被发现通过免疫过度刺激引起肠道炎症，从而使毒素通过 GBA [ 28 ] [ 29 ] 到达大脑]。这也意味着 HFD 通过大肠杆菌过度生长途径在大脑中沉积淀粉样蛋白斑对学习和记忆产生间接不利影响。该实验首次证明 CBD 和 Omega 3 的组合降低了 HFD 的神经毒性，也改善了它引起的记忆障碍。

同样，HFD 增加了这种动物的焦虑水平，与其他组相比，在张开臂上花费的时间显着缩短（图 3）。通过观察光厌恶反应和焦虑动物对迷宫的封闭较暗臂的偏好增加，使用 EPM 实验证明了焦虑。Dutheil等人的研究。(2016) 证实了我们的研究结果，证明高脂肪饮食会导致大鼠快感缺乏和焦虑水平升高 [ 30]。在我们的实验中，CBD 和欧米茄 3 组合显着降低了 HFD 喂养小鼠的焦虑水平。欧米茄 3 已被证明可维持代谢平衡并上调肉毒碱-棕榈酰转移酶 1 基因，并显着改善去卵巢大鼠的焦虑 [ 31 ]。研究也将 CBD 描述为一种潜在的抗焦虑剂，因为它可能对 CB1、5HT 和 TRPV 受体起作用。因此，协同作用的 CBD 和欧米茄 3 具有更有效的抗焦虑作用，优于传统的抗焦虑药物。

图 3。与对照组和 HFD + CBD + Omega 3 组相比，HFD 显着缩短了 EPM 测试中开放臂的时间 *表示统计学显着性 (p < 0.05)。

4。结论

该研究结果首次证明了CBD和欧米茄3在改善HFD引起的焦虑和记忆障碍方面的协同作用。肠道大肠杆菌过度生长是由高脂肪饮食引起的，这可能是导致认知障碍的原因。与慢性 HFD 消耗相关的神经炎症和氧化应激可能被 CBD 和 omega 3 的抗炎和抗氧化作用所抵消。此外，这种干预可能通过上调肉毒碱-棕榈酰转移酶来缓解 HFD 引起的焦虑并通过作用于 CB1、5HT 和 TRVP。需要更多的研究来建立这些发现背后的分子机制。

利益冲突

作者声明与本文的发表没有利益冲突。

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