HT22质膜胆固醇与β-淀粉样蛋白相互作用的实验分析

摘要：已知肽β-淀粉样蛋白 ( β - A) 是导致阿尔茨海默病神经变性的主要因素之一。因此，人们想知道会增加或减少大脑中β-淀粉样蛋白毒性的因素。文献中争论的因素之一是胆固醇，目前尚不清楚调节胆固醇水平是否会影响β-淀粉样蛋白对大脑神经元细胞的毒性程度。为了研究这个问题，收集并分析了三种实验的数据： 1）胆固醇和甲基-β-环糊精（M β CD) 测量；2) 相对荧光单位 (RFU) 相对于 M β CD 浓度的测量（有/无β -A）；3) 关于β -A 浓度的 RFU 测量（有/没有 M β CD）。用猴病毒SV-40大T抗原质粒载体永生化的HT22海马神经元进行实验。Mito-ID 膜潜在细胞毒性被用作线粒体电位变化的量度。所呈现的实验结果的统计分析表明，胆固醇对β-淀粉样蛋白的毒性程度没有统计学上的显着影响。

关键词

阿尔茨海默病, β-淀粉样蛋白,胆固醇

一、简介

阿尔茨海默病 (AD) 是老年人中最普遍的神经退行性疾病。仅今年，与阿尔茨海默病相关的医疗保健费用估计为 2260 亿美元。据估计，到 2050 年，支出将增加并达到 1.1 万亿美元。治疗阿尔茨海默氏症的研究资金相当不足。目前，美国政府每年花费约 10 亿美元用于研究——远低于医疗保健成本（来源：http://curealz.org）。尽管社会成本和 AD 的高患病率，几十年的研究已经成功地推进了我们对 AD 病理学机制的认识（从其潜在的遗传学，到分子生物学和临床病理学，例如，[ 1])。为了记录 AD 研究的发展，我们对 Google Scholar 进行了一项调查，以查找从 1967 年到 2017 年年中的过去 50 年中标题中与 AD 相关的论文。图 1展示了这项调查的结果，其中我们确定了 140,000 篇涉及 AD 的论文，其发表率自 1985 年以来呈指数增长。

已知肽 β-淀粉样蛋白 (β-A) 是导致 AD 神经变性的主要因素之一。通常，AD 与细胞内环境中的 β-A 细胞外斑块和神经原纤维缠结一起出现。关于影响 β-A 与细胞表面相互作用方式的神经元质膜的特性有几种理论。我们可以观察到 β-A 导致氧化应激的增加，但诱导该应激的途径尚不清楚。关于离子平衡破坏背后的机制存在三种主要理论 [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ]：1) β-A 以其寡聚形式插入质膜，产生破坏离子平衡的离子特异性孔（钙破坏） [ 5 ] [ 6] ; 2) 膜表面的聚集会破坏结构的稳定性并损害阻止不需要的和非特异性离子流过膜的能力 [ 7 ] [ 8 ]；3) β-A 作为膜的去污剂并去除脂质，从而影响膜结构和流动性，结果与第二个理论[ 4 ]相同。虽然关于机制的想法不同，但所有三种理论都同意将肽引入细胞会导致氧化应激。

图 1。(a) 过去 50 年（1967-2017 年）在 Google Scholar 中收录的标题中包含 AD 的论文数量。拟合曲线（蓝色虚线）显示了这些研究在 1985 年之后的指数增长。特别是，论文数量 N 遵循以下关系 ñ( t ) =ñ1967年⋅ exp [ + λ ( t − 1967 ) ]率 λ ≅( 3.5 ± 0.2 ) %和常数 ñ1967年≅344 ± 10. (b) 这些论文中与 AD 和 Cholesterol 相关并在其标题中包含这两个关键字的部分。

细胞的质膜高度功能化用于细胞信号传导。许多不同的标记存在于细胞表面，并定期与细胞外分子相互作用。细胞信号传导不与生物标志物分离；它还与膜的流动性程度有关。微环境中的流动性可以通过改变细胞信号化合物的扩散和转移来影响细胞通讯。这种流动性由构成膜的脂质类型的比例决定。生理温度下胆固醇含量的增加会降低膜的流动性 [ 9] . 这种流动性降低可能对细胞外分子与细胞表面相互作用和质膜内横向运动的能力产生重大影响。细胞膜的特定区域富含胆固醇、鞘磷脂和鞘脂。这些区域被认为专门从事细胞间相互作用和信号传导，被称为脂筏[ 10 ]。这些脂筏区域的流动性降低可能会增加细胞外分子与膜之间相互作用的机会。

模拟和建模表明，β-A 倾向于沿着这些富含脂质的结构域的周边聚集（例如，参见 [ 11 ]）。破坏这些特殊膜筏的结构可能会影响 β-A 与神经元膜的相互作用。去除胆固醇会增加该区域的流动性，从而有效地溶解脂筏。如果脂筏确实在 β-A 与神经元质膜的相互作用中发挥重要作用，那么这种去除应该会影响 β-A 能够在神经元中诱导的氧化应激水平。

在过去的二十年里，胆固醇在 AD 出现中的作用得到了特别的研究（图 1（b））。事实上，前 100 篇被引用的胆固醇论文 [ 12 ] 表明，过去 10 年见证了描述胆固醇在阿尔茨海默氏症等非心血管疾病中作用的研究的出现（第二个参考文献编号为 76 和 94）。正如 Vance 等人在一篇评论文章中指出的那样。[ 13 ]，几项研究提供了关于血浆胆固醇水平与痴呆症发展之间关联的相互矛盾的结果 [ 14 ] [ 15 ] [ 16 ] [ 17 ] [ 18] . 争论的焦点是调节胆固醇水平将如何影响 β-A 对细胞的毒性程度。关于胆固醇水平有三种理论： 1) 胆固醇的存在是有益的，它的去除会增加氧化应激水平 [ 19 ] [ 20 ]；2) 胆固醇对细胞产生负面影响，它的去除会降低氧化应激水平 [ 21 ]；3) 胆固醇不会影响与 β-A 毒性相关的细胞健康。

为了详细说明第一个理论，如果我们将其与 β-A 沿脂筏周边聚集的理论联系起来，那么去除胆固醇可能是负面的。如果从质膜中去除胆固醇，脂筏将首先开始分裂成更小的岛屿。这些较小的脂筏将具有比其起源的原始脂筏更大的总周长。因此，根据模拟表明沿着脂筏边界聚集 [ 11 ]，β-A 在导致更高水平的氧化应激时会有更多的聚集区域。这也证实了随着大脑年龄的增长，星形胶质细胞在神经元膜中替代了更少的胆固醇 [ 22] . 由于胆固醇的更新保持不变，老化大脑中的总体胆固醇水平会下降。第二个理论表明，较少的胆固醇将是有益的。去除胆固醇会产生更少的脂筏，这可能会降低质膜与 β-A 相互作用的机会。最后一个理论简单地指出，胆固醇可能在 β-A 对神经元的毒性中起关键作用。

在文献中，对所有三种理论都有实质性的支持，这只会增加 β-A 与神经元质膜相互作用的模糊性以及进一步探索这个问题的必要性。尽管文献报道了混合的结果，但由于所使用的细胞类型以及用于测量氧化应激、细胞活力或 β-A 肽对神经元细胞毒性作用的其他指标的测定类型的不同，这种混合可能存在.

众所周知，血浆总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平会随着人类和啮齿动物的正常衰老而增加，而在人类和啮齿动物中，低密度脂蛋白的血浆清除率会随着年龄的增长而降低（见 [ 23 ] 和其中的参考文献） . 虽然随着年龄的增长，在膜中发现的胆固醇量会减少（例如，参见 [ 24 ] [ 25 ]），但分析还报告了胆固醇水平随年龄增长而增加的证据（例如，参见 [ 26 ] [ 27 ]])。随着年龄的增长，AD 的发生率增加，这使我们相信胆固醇水平的这些相关性紊乱可能是 AD 的部分原因。事实上，关于调节胆固醇水平如何影响 β-淀粉样蛋白对大脑神经元细胞的毒性程度一直存在争议。

本文的目的是研究胆固醇是否对β-淀粉样蛋白的毒性程度有影响。在第 2 节中，我们提供了有关我们实验中使用的材料和试剂的信息。在第 3 节中，我们详细描述了三个实验的方法、过程和收集的数据集。甲基-β-环糊精 (MβCD) 用于消耗胆固醇，而在实验 1 中，我们发现了它们之间的确切对应关系；实验 2 测量不同 MβCD 浓度值的相对荧光单位 (RFU)（有/无 β-A）；实验 3 测量各种 β-A 浓度值的 RFU（有/无 MβCD）。在第 4 节中，我们提供了三个实验的结果，得出的结论是，β-A（RFU）的反应与质膜胆固醇含量的变化没有统计学上的显着差异。最后，在第 5 节中，我们讨论结果并简要总结结论。

2. 材料和试剂

用猴病毒SV-40大T抗原质粒载体[ 28 ]永生化的HT22海马神经元进行实验。在目前的研究中，我们使用未分化细胞来模拟成熟神经元的病理学。在 37˚C 和 5% CO 2下，将细胞在含有 1% 青霉素-链霉素和 1% L-谷氨酰胺的 5% 胎牛血清 (FBS) 补充的 DMEM-F12 培养基中培养. 96 孔 Costar 黑色透明底板用于测定。我们使用来自 Anaspec 的 Aggresure (1 - 42) β-淀粉样蛋白 (β-A) 用于我们的 AD 模型。使用甲基-β-环糊精 (MβCD) 去除胆固醇，MβCD 是一种环状分子，具有适合从质膜表面提取胆固醇分子的结构；使用 Amplex Red 胆固醇定量试剂盒对去除的量进行定量。Mito-ID 膜电位细胞毒性试剂盒被用作在我们的测定中诱导的线粒体电位变化的量度（参见产品详情：Enzo Life Science，http://www.enzolifesciences.com）。

我们修改了方案和试剂混合物，但对 Mito-ID 检测线粒体电位变化的功效没有影响。（435 uL ddH 2 O + 50 uL 10X 缓冲液 + 10 uL 50X 缓冲液 + 5 uL Mito-ID MP 检测试剂；每孔加入 50 uL，总体积为 100 uL；在 50 uL 0% FBS DMEM-F12 中稀释; 在获取基线读数之前，允许染料孵育 90 分钟，而不是建议的 30 分钟孵育时间）。Molecular Devices 的荧光酶标仪用于收集读数（激发波长 485 nm，发射波长 530 和 590 nm）。

3. 方法

3.1。程序说明

在测定开始前约24小时将细胞铺板到96孔透明底黑色组织培养板中，以使细胞完全粘附到组织培养板上。在测定开始时，细胞被证实为 70-80% 汇合。吸出培养基并用补充有 1% pen-strep 和 1% Glutamax 的 100 uL 0% FBS DMEM-F12 培养基冲洗细胞。细胞接受 100 µL 0% FBS DMEM-F12 培养基溶液，浓度为 0 至 2.5 mM MβCD。将细胞放回培养箱中，在 37°C 下放置 60 分钟。60 分钟后，除去含有 MβCD 的培养基，加入 50 µL 0% FBS DMEM-F12 1% ps 和 1% L-Gln。加入 50 µL 我们的 Mito-ID 混合物，让细胞孵育 90 分钟。90分钟后，基线读数是在 485 nm 的激发和 530 和 590 nm 的发射读数下获得的。在基线读数的 5 分钟内，将不同量的 β-A (1-42) 肽添加到细胞中。在最终加入 β-A 后 15 分钟进行第一次读数。在前 60 分钟，每 15 分钟读取一次读数。此后，每 30 分钟读取一次读数，直至基线读数后 8 小时。

相对荧光单位 (RFU) 代表线粒体激活。Mito-ID 是一种荧光染料，可测量线粒体膜电位的波动。它使用一种阳离子双发射染料，当它处于单体形式时会发出绿色荧光（530 nm），当它形成 J 聚集体时会发出橙色（590 nm）荧光，因为线粒体内浓度增加（例如，[ 29 ]）。当细胞健康时，Mito-ID 会发出绿色荧光，因为阳离子在胞质溶胶中；然而，当细胞经历氧化应激时，它的线粒体会吸收 Mito-ID，而 Mito-ID 又会聚合它并将荧光变为橙色。

在本文中，我们将使用 RFU 来测量神经元细胞的细胞变异性。数据被标准化为 100%，因此健康神经元的基线开始于 100% RFU 单位。RFU(t) 响应值被归一化为初始 RFU(t = 0)，即

归一化 RFU ( t ) = ( 1 00 %) ⋅ RFU ( t ) / RFU ( t = 0 )。(1)

因此，相对荧光单位的增加代表线粒体活化的增加。

3.2. 收集的数据集

我们进行了三种类型的实验：1）胆固醇和 MβCD 测量；2) 关于 MβCD 浓度的 RFU 测量（有/无 β-A）；3) β-A 浓度的 RFU 测量（有/无 MβCD）。

所有实验都已重复多次，以估计样本平均值和不确定性。在实验 (1) 中，对于每个 MβCD 浓度，我们测量了六次 RFU 和胆固醇。在实验 (2) 和 (3) 中，在每个 t [min] = 0, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 250, 270（或，对于 (b) 为 1060），对于 MβCD 和 β-A 的所有浓度，我们测量了 3 次 RFU。

・ 在实验 1 中，我们首先制作胆固醇 [μg] (x) 和归一化 RFU (y) 之间的参考曲线，即 y = 41,224x + 559.23。MβCD[μM]和归一化RFU的平均值/标准偏差如表1所示。然后，使用生成的参考曲线，我们提取胆固醇 [μg] 的值，也显示在表 1中。

・ 在实验 2 中，MβCD [μM] 的归一化 RFU(t)（对于所有 t）的平均值和标准偏差：0、0.5、1、1.5、2、2.5 和 0 β 的两种情况-A 和 2.5 β-A，如表 2所示。

・在实验3中，归一化RFU（t）的平均值和标准偏差（对于所有t），对于β-A：0、1、2、2.5、3、4、5、7、10、15， MβCD[μM]的三种情况：0、1、2.5β-A，见表3。

4. 结果

4.1。实验一：胆固醇测定

使用表 1，我们绘制了相对于 MβCD [μM] 的胆固醇 [μg]。放大器-

MβCD [μM]

RFU 归一化

胆固醇 [微克]

0

11,160 ± 290

0.260 ± 0.007

0.5

10,000 ± 300

0.227 ± 0.008

1

6800±300

0.150 ± 0.008

1.5

4500±600

0.090 ± 0.014

2

3500±600

0.070 ± 0.015

2.5

3200±700

0.060 ± 0.017

表 1。每个 MβCD 的胆固醇和标准化 RFU 的测量值。

t [分钟] = 15

t [分钟] = 30

MβCD [μM]

0 β-A

2.5 β-A

0 β-A

2.5 β-A

0

111.5±0.8

150±30

118.2±1.5

150±30

0.5

110.5±2.4

195±14

114.8±2.0

206±9

1

112±4

174±16

115±6

175±14

1.5

111.4±1.0

182±4

116.5±1.0

192±7

2

111.7±1.0

176±22

117.7±2.2

182±26

2.5

119±8

168±15

122±8

178±20

t [分钟] = 45

t [分钟] = 60

MβCD [μM]

0 β-A

2.5 β-A

0 β-A

2.5 β-A

0

121.8±1.1

160±30

129.1±1.6

170±30

0.5

119.9±2.4

220±9

125.0±2.9

234±12

1

123±6

182±16

128±8

194±20

1.5

123.1±0.7

199±9

129.3±1.4

209±10

2

122.3±2.5

183±23

129±4

200±30

2.5

131±8

192±26

138±9

200±30

t [分钟] = 90

t [分钟] = 120

MβCD[μM]

0 β-A

2.5 β-A

0 β-A

2.5 β-A

0

121.1±1.8

150±30

112.5±2.5

141±28

0.5

120.4±2.4

217±10

108.1±0.9

203±9

1

122±7

187±16

112±5

168±16

1.5

124±4

203±7

112±4

185±6

2

122±4

217±23

108±4

167±18

2.5

131±8

196±20

108±5

175±23

t [分钟] = 150

t [分钟] = 180

MβCD [μM]

0 β-A

2.5 β-A

0 β-A

2.5 β-A

0

111.1±2.7

170±30

108±3

143±23

0.5

105.5±1.4

193±8

101.8±0.8

183±7

1

108±5

162±15

103.5±3.2

158±12

1.5

109±3

177±7

104±4

167±8

2

104±3

165±24

99±4

155±19

2.5

107±8

168±22

101±6

158±19

t [分钟] = 210

t [分钟] = 240

MβCD [μM]

0 β-A

2.5 β-A

0 β-A

2.5 β-A

0

107±4

140±23

116±4

155±26

0.5

99.5±1.5

178±8

107.9±2.0

197±8

表 2。在每个时间 t 测量每个 MβCD 的归一化 RFU，有/没有 β-A。

t [分钟] = 15

t [分钟] = 30

β-A

0 MβCD

1 MβCD

2.5 MβCD

0 MβCD

1 MβCD

2.5 MβCD

0

108.0±1.9

107.8±1.5

105.7±1.3

111.1±1.5

111.5±1.2

107.7±2.7

1

108.4±2.0

106.1±2.7

110±6

111.4±1.5

110.7±2.4

114±7

2

133±15

170±50

180±30

133±15

170±50

180±30

2.5

112±5

111±6

122±16

122.6±2.3

117±9

125±16

3

185±24

200±60

190±50

187±27

200±60

200±60

4

212±34

190±50

210±80

208±29

210±70

210±70

5

201±30

200±50

200±50

194±25

200±40

200±50

7

166±25

157±21

144±16

172±24

172±22

162±27

10

410±120

450±150

340±110

420±120

450±140

350±100

15

310±30

250±50

202±16

330±30

260±50

208±16

t [分钟] = 45

t [分钟] = 60

β-A

0 MβCD

1 MβCD

2.5 MβCD

0 MβCD

1 MβCD

2.5 MβCD

0

112.5±1.6

113.4±2.3

111.0±2.9

117±3

117.2±1.6

116±5

1

113.5±2.4

117±6

117±8

117.0±2.6

121±6

121±10

2

140±19

170±50

173±30

144±18

180±50

180±29

2.5

123±3

118±10

127.1±17

124.3±1.8

118±11

129±19

3

210±40

200±60

190±50

220±50

210±70

210±50

4

209±27

220±70

210±70

210±30

230±80

220±70

5

194±24

210±40

200±40

198±27

210±50

200±50

7

180±30

176±25

163±29

180±30

181±29

170±30

10

430±120

460±140

360±110

450±130

470±150

370±120

表 3。在每个时间 t 测量每个 β-A 的标准化 RFU，有/没有 MβCD。

图 2。胆固醇浓度 [μg] 与 [mM] 中 MβCD 的浓度。MβCD 以 0 到 2.5 的浓度添加到 HT22 海马细胞中。Amplex red 检测会随着可用胆固醇的量发出荧光。

lex Red 胆固醇测定显示，根据 MβCD 浓度，胆固醇呈剂量依赖性降低，如图 2所示所示。对 MβCD 进行 2.5 mM 处理可提取约 75% 的神经元胆固醇。1 到 1.5 mM 的 MβCD 导致大约 50% 的胆固醇提取。在更高浓度的 MβCD 下，细胞死亡。

4.2. 实验 2：MβCD 的变化

图 3显示了相对于 MβCD 绘制的归一化 RFU，对于 (a) 0 β-A 和 (b) 2.5 β-A（数据显示在表 2中）。

在接下来的统计测试中，我们使用 RFU 归一化值来确定统计总体是否相对于 MβCD 浓度的变化是不变的。为了执行此检查，统计检验适用于以下零假设：

图 3。对于时间 t [min] = 0, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 250, 1060，针对 (a) 0 β-A 绘制相对于 MβCD [mM] 的归一化 RFU 值(b) 2.5 β-A。

- H 0 : 响应 RFU 在 MβCD 的变化下是不变的。

接下来，我们应用标准统计分析（例如，[ 30 ] [ 31 ]）来显示假设是否可以被接受或拒绝。特别是，使用统计方法测试无效假设以评估所涉及的拟合的优度。数据与常数的良好拟合有利于 H 0。使用三种统计方法来评估拟合的优劣，i) “减少的卡方”，ii) “极值的 p 值”，以及 iii) “T 值”，即转换后的p 值；（统计检验的类似应用可以在不同学科的示例中找到，例如 [ 32 ] [ 33 ] [ 34 ] [ 35 ] [ 36 ]）。

- 对于卡方方法，拟合优度通过降低的卡方值来估计， χ2红色的=1米χ2美东时间, 其中 M 是自由度。这

的意思 χ2红色的是的一部分 χ2对应于每个自由度，并且必须为~1才能很好地拟合。因此，拟合被描述为“良好”，当 χ2红色的~ 1, 否则高估, ( χ2红色的< 1)，或低估，( χ2红色的> 1), 的错误。

对于 p 值方法，通过比较估计的卡方值来评估拟合优度， χ2美东时间，以及卡方分布，

磷(χ2; 米) =[2米2Γ(米2) ]− 1e-12χ2(χ2)米2− 1,(2a)

也就是说，所有可能的分布 χ2值（由自由度 M 参数化）。拥有一个的可能性 χ2值，等于或大于估计值 χ2美东时间, 由互补累积分布给出。获得结果的概率 χ2, 大于估计值 χ2美东时间, 定义等于的 p 值

磷(χ2美东时间≤χ2< ∞ ) =∫∞χ2美东时间磷(χ2; 米) dχ2.(2b)

p 值越大，拟合越好：p 值大于 0.5 对应于 χ2美东时间< M 或 χ2红色的< 1. 较大的 p 值，直到 p = 1，对应于较小的卡方，直到 χ2红色的~ 0。因此，p 值增加超过 0.5 的阈值不会导致更好的拟合。相反，它会导致更差的拟合，类似于递减 χ2红色的< 1. 因此，使用“极值的 p 值”。根据这种方法，得到结果的概率 χ2，这比观察值更极端 χ2美东时间, 定义等于两个概率之间最小值的 p 值， 磷( 0 ≤χ2≤χ2美东时间)及其互补， 磷(χ2美东时间≤χ2< ∞ ). 与小于显着性水平约 0.05 的 p 值相关的零假设通常会被拒绝。

如表 4所示，所有估计的 p 值均高于 5% 置信水平，这是接受假设所必需的。我们还使用 T 值（修改后的 p 值）来更详细地描述似然性。这是由

（吨+ 1 ) /2=( 2页)日志2.(3)

图 4绘制了所有估计的 (a) p 值和 (b) T 值的直方图，对于 β-A = 0（上图）、β-A = 2.5（中图）或所有情况（下面板）。我们观察到所有 β-A = 2.5 的情况的 p 值都大于 0.05，这表明在 MβCD 的变化下 RFU 不变的假设可以被保密地接受。此外，T 值显示 β-A = 2.5 的三个案例被表征为“可能”，而其中大多数被表征为“极可能”。

最后，在图 5中，我们绘制了标准化的 RFU，对所有 MβCD 进行平均（数据来自表 4）。我们观察到标准化 RFU 的最大值出现在 t ~ 1 小时。我们还表明，对于任何 t，β-A = 0 和 β-A = 2.5 之间的 RFU 差异是一个恒定值，即 72 ± 3（p 值 = 0.49；极有可能）。这表明不同数量的 β-A 的响应 RFU(t) 差异很大

β-A = 0

β-A = 2.5

t [分钟]

RFU

χ2红色的χ红色的2

p 值

T值

RFU

χ2红色的χ红色的2

p 值

T值

15

111.5±0.6

0.2

0.04

-0.06

181±6

0.62

0.32

0.75

30

116.8±0.9

0.55

0.26

0.64

192±8

1.25

0.28

0.68

45

122.6±0.8

0.68

0.36

0.81

203±9

1.6

0.15

0.39

60

128.9±1.3

0.57

0.27

0.66

213±11

1.26

0.28

0.68

SS90

121.8±1.5

0.52

0.24

0.60

204±8

1.27

0.28

0.68

120

108.8±1.3

0.84

0.48

0.98

186±8

1.85

0.1

0.23

150

106.6±1.6

0.84

0.48

0.98

180±7

1.08

0.37

0.83

180

102.1±1.2

0.85

0.49

0.99

170±7

1.35

0.24

0.60

210

100±1.8

1.13

0.34

0.78

165±6

0.96

0.44

0.92

240

110±2.1

0.98

0.43

0.91

182±8

1.31

0.26

0.64

1060

95±3

6.81

2.3E-06

-0.95

148±10

2.08

0.06

0.06

表 4。每个时间 t 的归一化 RFU 常数值，有/没有 β-A。

图 4。表征 RFU 值在 MβCD 变化下不变的统计假设。(a) p 值的直方图显示所有 β-A = 2.5 的情况都接受了假设（拒绝的是 p 值小于 0.05 的情况）；(b) T 值的直方图显示β-A = 2.5 的大多数情况具有“极有可能”的特征。

图 5。表征 RFU 值在 MβCD 变化下不变的统计假设。(a) p 值的直方图显示所有 β-A = 2.5 的情况都接受了假设；(b) T 值的直方图显示β-A = 2.5 的大多数情况具有“极有可能”的特征。

在缩放中。换句话说，β-A = 2.5 时的 RFU(t) 图是 β-A = 0 时 RFU(t) 图的按比例复制的图。这两个图在增长期间似乎都具有线性行为，而它们在达到 t ~ 60 分钟的最大 RFU 后呈指数衰减。因此，RFU(t) 的图可以用相同的模型来描述，即

RFU ( t ) = {RFU0+b林⋅ t , t ≤吨最大限度RFU∞+b经验⋅e− λ ⋅| 吨-吨最大限度|γ, t ≥吨最大限度,(4)

其中 t max = 60 min, λ = 0.00075, γ = 1.7 对于 β-A = 0 和 β-A = 2.5 两种情况；对于 β-A = 0 和 β- ，RFU 0、b lin、RFU ∞和 b exp = RFU max - RFU ∞的值分别由 105.5、0.38、99、29.5 和 170.5、0.72、165、48.5 给出A = 2.5。

4.3. 实验 3：β-A 的变化

我们观察到β-淀粉样蛋白的添加增加了线粒体的活化。60分钟后，线粒体活化达到峰值，但此后继续波动（图6）。β 淀粉样蛋白 1-42 聚集体的浓度与氧化应激的增加直接相关。

为了证明RFU(β-A)对MβCD的独立性，我们进行如下：首先，我们推导出RFU(β-A)的所有图的线性拟合，即对于三个不同的MβCD量i=0 , 1, 2.5 mM，并且所有时间 t [min] = 0, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270（图 7）。线性模型 a + b·[β-A] 拟合响应的对数 log(RFU)，其中我们推导出拟合参数 a 和 b 的最佳值。在每个时间 t，我们有三组派生值 a i ± δa i和 b i ± δb i，三个不同的 MβCD 浓度中的每一个， i = 0, 1, 2.5 mM。

然后，我们对三个最优值 a i和 b i进行平均，对于 i = 1、2、3。平均值 a ± δa 和 b ± δb 如表 5所示，并绘制在图 8 (a) 中，

图 6。不同量的β淀粉样蛋白和甲基-β-环糊精后HT22海马细胞的线粒体活化。由于添加mito-ID，线粒体应激荧光590处的相对荧光单位。对于每组 0、1​​、5 µM 的 β-A 和 MβCD n = 12 孔，对于每组 β-淀粉样蛋白 2、2.5、3、4、7、10 和 15 µM 的 β-A 和 MβCD对于每组 β-A 和 MβCD，n = 6 个孔。

图 7。(a) t = 15 分钟的剂量反应 RFU 用于 HT22 海马细胞的线粒体激活，其中 0 mM（蓝色）、1 mM（绿色）和 2.5 mM（红色）的 MβCD，以及各种 β-淀粉样蛋白浓度 [μM] . (b) 相同的图，但 RFU 以对数标度描绘，我们共同绘制线性拟合 y = (a ± δa) + (b ± δb)·x。特别是，我们应用了线性拟合 y j = a + b·x j，其中 y ≡ log(RFU) 和 x ≡ [β-A]，从中我们找到 a ± δa 和 b ± δb，并且 co-绘制 y = (a + δa) + (b + δb)・x（情况“+”）和 y = (a - δa) + (b -δb)・x（情况“？”）的情况。

β-A = 0

β-A = 2.5

t [分钟]

一个

p 值

T值

b

p 值

T值

15

2.014 ± 0.007

0.08

0.14

0.024 ± 0.005

0.27

0.66

30

2.038 ± 0.008

0.28

0.68

0.024 ± 0.004

0.44

0.93

45

2.047 ± 0.009

0.22

0.55

0.024 ± 0.005

0.24

0.59

60

2.061 ± 0.014

0.20

0.51

0.023 ± 0.005

0.22

0.57

90

2.018 ± 0.008

0.11

0.28

0.030 ± 0.004

0.46

0.95

120

2.002 ± 0.011

0.21

0.53

0.031 ± 0.003

0.41

0.88

150

1.994 ± 0.012

0.31

0.74

0.0309 ± 0.0029

0.36

0.81

180

2.023 ± 0.014

0.47

0.97

0.030 ± 0.003

0.27

0.66

210

2.025 ± 0.014

0.32

0.75

0.030 ± 0.003

0.18

0.48

240

2.026 ± 0.019

0.40

0.87

0.029 ± 0.003

0.22

0.56

270

2.017 ± 0.022

0.38

0.85

0.029 ± 0.003

0.25

0.62

表 5。平均拟合参数 a 和 b。

笔记。拟合参数 a 和 b，对它们的三个值 a i和 b i求平均值也显示。

图 8 (b) 相对于 t。对于每个平均值，我们陈述以下统计假设：

- H 0：三个线性拟合相同，即 a 1 = a 2 = a 3和 b 1 = b 2 = b 3。

要接受或拒绝这个假设，必须检查拟合的 p 值，如实验 2 中所示。估计的 p 值以及导出的 T 值也显示在表 5中，并相对于 t 绘制在图 8(c)-(f) 中。

我们观察到所有 p 值都证实了统计假设，即对于实验的所有时间，log(RFU) 与 β-A 的线性行为与 MβCD 的量无关。特别是，所有 p 值都大于置信水平 0.05 (图 8 (c)，图 8 (d)）。它们都对应于大的 T 值，这些值被表征为非常可能，除了三种情况（两种用于截距 a，一种用于斜率 a）被表征为可能（图 8（e），图 8（f））。因此，结果没有显示出质膜胆固醇含量变化的任何差异。

5. 讨论与结论

收集并统计分析了三种类型实验的数据，即胆固醇对β-淀粉样蛋白的影响。三个实验如下： 1）胆固醇和甲基-β-环糊精（MβCD）测量之间的对应关系；2) 相对荧光单位 (RFU) 相对于 MβCD 浓度的测量（有/无 β-A）；3) β-A 浓度的 RFU 测量（有/无 MβCD）。所呈现的实验数据集的统计分析证实胆固醇

图 8。(a) 截距 a 和 (b) 斜率 b 的平均值相对于时间 t 绘制。平均 a 的统计 p 值和 T 值平均 a i和 b i（针对三种不同的 MβCD 量 i = 0、1、2.5 mM 得出）绘制在 ((c)、(e)) 和 ((d) ，（f）），分别。

对β-淀粉样蛋白的毒性程度没有统计学意义的影响。这也证实了 Dayeh 等人的结论。[ 37 ]，作者表明过氧化氢改变胆固醇对细胞毒性没有显着影响。

我们确实观察到随着 β-A 浓度的增加线粒体活化增加，如如图 7中的数据所示。线粒体活化的增加是细胞经历的氧化应激的指标。因此，添加小寡聚体 β-A 似乎确实在 HT22 细胞中诱导了一些应激反应。7 μM 和 15 μM 的反应下降可能是由于对 β-A 肽的非特异性反应。然而，我们没有观察到质膜胆固醇含量变化的统计学显着差异（图 8）。用 1 mM MβCD 处理细胞导致细胞总胆固醇含量减少 44%，而 2.5 mM MβCD 导致减少 74%。质膜含有细胞中大约一半的胆固醇，这意味着总胆固醇降低 74% 时，理论上仅质膜就降低了 37%。我们认为这是胆固醇的重要组成部分，这种减少会导致脂筏结构的改变。

随着时间的推移，我们没有看到由于 β-A 的毒性而导致线粒体活性在统计学上显着下降。随着时间的推移，阴性对照的线粒体活性也有波动。线粒体激活没有崩溃表明细胞没有凋亡。我们使用了经过猿病毒处理的 HT22 海马细胞，使它们成为肿瘤细胞。由于这些海马细胞会复制，β-A 的作用可能会因我们使用的测定而受到影响。Mito-ID 仅提供有关一般细胞群的信息。由于 HT22 细胞之间的异质反应，该测定法不够灵敏，无法检测细胞水平对 β-A 和胆固醇含量变化的反应差异。这些细胞还分泌保护它们免受氧化应激的生长因子。

胆固醇在细胞功能中具有许多重要作用。它为神经元膜提供结构，并在细胞信号传导中发挥重要作用。我们最初的假设是脂质膜中的胆固醇将对氧化应激起保护作用。使用这种特殊模型，脂质层中的胆固醇含量似乎在调节 β 淀粉样蛋白对氧化应激反应的影响方面没有任何可检测的作用。

・ 我们观察到随着β淀粉样蛋白浓度的增加，线粒体活化增加。剂量反应显示相对线粒体活化增加。

・我们没有发现质膜胆固醇含量的变化具有统计学意义的差异。在相同的β淀粉样蛋白浓度下，具有不同胆固醇含量的细胞之间的线粒体活化没有统计学上的显着差异。

・我们确实检查了膜的胆固醇含量随着 MβCD 处理浓度的增加而降低。质膜含有大约 50% 的细胞胆固醇，因此减少 50% 或 75% 的总胆固醇会显着降低质膜胆固醇含量。

・我们观察到随着时间的推移线粒体电位没有崩溃。可能，分裂细胞保护自己免受β淀粉样蛋白的侵害。

・ 胆固醇含量似乎在调节 β 淀粉样蛋白对氧化应激反应的影响方面没有显着作用。

・用人β-淀粉样蛋白（1-40）处理的HT22神经元表现出氧化应激。

我们总结了下一步改进和扩展所提出的分析。其他调查可能涉及膜胆固醇变化的其他影响。例如，Nicholson 和合作者提出，膜胆固醇的年龄依赖性变化可能至少部分调节海马神经元对 Aβ 诱导的 Ca 2+流入、钙蛋白酶激活以及随后 NMDA 受体中的 Tau 毒性的敏感性。依赖方式[ 26 ]。其他方法可以测试不同的寡聚体制剂（小或高分子量的寡聚体直至原纤维）或不同淀粉样肽（例如淀粉样蛋白-β40、淀粉样蛋白-β42）的作用。此外，分化的 HT22 神经元代表了比未分化细胞更好的海马神经元模型（例如，[ 38])。已知成熟的神经元是有丝分裂后细胞，并且与它们的有丝分裂前体细胞相比具有不同的细胞特性。与未分化细胞和已分化细胞相比，HT22 细胞对毒性诱导剂的敏感性发生显着变化。分化对于永生化细胞系以呈现有丝分裂后的神经元特性很重要。然后，用分化的 HT22 神经元进行实验（如 [ 39]）可以排除结果主要反映未成熟海马神经元前体细胞的细胞特性而不是有丝分裂后海马神经元的可能性。此外，脂质调节 β-分泌酶 β 位点 APP 裂解酶 1 (BACE1)。γ-分泌酶具有胆固醇依赖性活性，其将富含胆固醇的脂筏与 APP 的淀粉样蛋白形成过程之间的相互关系联系起来。未来的工作还可能确定 BACE1 和 γ-分泌酶的活性以及线粒体膜电位（例如，[ 40 ]），以便更好地了解细胞毒性事件。

致谢

这项工作得到了南非国王阿卜杜勒阿齐兹大学的资助

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

参考

[ 1 ] Edland, SD, Slager, S. 和 Farrer, M. (2004) 阿尔茨海默病研究中的遗传关联研究：挑战和机遇。医学统计，23，169-178。

[ 2 ] Pollard, HB, Arispe, N. 和 Rojas, E. (1995) 阿尔茨海默病淀粉样肽神经毒性的离子通道假说。细胞和分子神经生物学，15, 513-526。

[ 3 ] Butterfield, SM 和 Lashuel, HA (2010) Amyloidogenic Protein-Membrane Interactions: Mechanistic Insight from Model Systems。Angewandte Chemie 国际版，49, 5628-5654。

[ 4 ] Williams, TL 和 Serpell, LC (2011) 阿尔茨海默氏症 β-A 肽的膜和表面相互作用 - 深入了解细胞毒性机制。FEBS 杂志，278，3905-3917。

[ 5 ] Quist, A.、Doudevski, I.、Lin, H.、Azimova, R.、Ng, D.、Frangione, B.、Kagan, B.、Ghiso, J. 和 Lal, R. (2005) 淀粉样蛋白离子通道: 蛋白质错误折叠疾病的常见结构链接。美国国家科学院院刊，102、10427-10432。

[ 6 ] Connelly, L., Arc, FT, Jang, H., Capone, R., Kotler, S., Ramachsaandran, S., Kagan, B., Nussinov, R. 和 Lal, R. (2012) 原子力显微镜和MD 模拟揭示了阿尔茨海默病 β-淀粉样肽的全 D-对映异构体的孔样结构：与 AD 病理学的离子通道机制的相关性。物理化学杂志 B, 116, 1728-1735。

[ 7 ] Kayed, R., Head, E., Thompson, JL, McIntire, TM, Milton, SC, Cotman, CW 和 Glabe, CG (2003) 可溶性淀粉样蛋白低聚物的共同结构意味着发病机制的共同机制。科学，300，486-489。

[ 8 ] Demuro, A., Mina, E., Kayed, R., Milton, SC, Parker, I. 和 Glabe, CG (2005) 钙失调和膜破坏作为可溶性淀粉样蛋白低聚物的普遍神经毒性机制。生物化学杂志，280, 17294-17300。

[ 9 ] Van Meer, G.、Voelker, DR 和 Feigenson, GW (2008) 膜脂质：它们在哪里以及它们如何表现。自然评论分子细胞生物学，9，112-124。

[ 10 ] Simons, M., Keller, P., Destrooper, B., Beyreuther, K., Dotti, CG 和 Simons, K. (1998) Cholesterol Depletion Inhibits the generation of Beta-Amyloid in Hippocampal Neurons。美国国家科学院院刊，95, 6460-6464。