二十二碳六烯酸（DHA，C22:6，n-3）与阿尔茨海默病致淀粉样肽Aβ1-42的计算分析确保了其治疗效用

时间：2022-08-07　|　作者：给予迩温柔

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摘要：阿尔茨海默病 (AD) 患者大脑中淀粉样蛋白 β 肽1-42 (A β 1-42 ) 团块的积累与神经元丢失和记忆缺陷有关。我们之前曾报道，口服二十二碳六烯酸（DHA，C22：6，n-3）可显着降低 AD 模型大鼠大脑中的 Aβ 负荷，并且DHA 与 A β 1-42直接体外孵育可抑制淀粉样蛋白纤颤。在目前的计算机研究中，我们研究了 DHA 是否在计算上与淀粉样肽结合。A β 1-42的核磁共振溶液结构从蛋白质数据库下载（PDB ID：1Z0Q 和 2BEG）。DHA 与 Aβ 肽的结合通过使用灵活和刚性对接系统的分子对接来评估。硫黄素 T (ThT) 用作阳性对照。使用 PRODRUG 对 ThT 和 DHA 的化学结构进行建模并转换为 PDB 格式。通过 ADME（吸收、分布、代谢和排泄）评估 DHA 的药物样特性。发现 DHA 与 A β 1-42成功对接。通过对接研究评估的 DHA 与 A β 1-42结合的计算分析进一步证实了 DHA 对体外 A β 1-42的抑制作用纤维发生，并可能解释在我们之前的研究中证明的在 DHA 给药的 AD 模型大鼠大脑中观察到的淀粉样蛋白负荷的体内减少。这些计算数据表明 DHA 作为 Aβ 诱导的神经退行性疾病（包括 AD）的预防药物的潜在用途。

关键词

二十二碳六烯酸,阿尔茨海默病, β淀粉样肽,分子对接,计算机,药物设计,蛋白质数据库

一、简介

阿尔茨海默病 (AD) 是一种进行性神经退行性疾病，是导致老年人痴呆的最常见原因 [ 1 ] [ 2 ]。临床上表现为记忆力减退、无法学习新事物、语言功能丧失、空间感知障碍、无法计算等多种表现[ 3 ]。在 AD 中，脑组织整体收缩，而在显微镜下，其特征是细胞外（神经炎斑）和/或细胞内（神经原纤维缠结）沉积不溶性β淀粉样肽 (Aβ) [ 4] . Aβ 是一种具有 42 或 43 个氨基酸的肽，构成较大的淀粉样前体蛋白 (APP) 的跨膜结构域的一部分，APP 是一种在神经元和其他脑细胞中表达的跨膜蛋白，来源于 β-和 γ-分泌酶 [ 5 ] - [ 7 ]。APP 异常切割和其他机制导致 Aβ 的清除缺陷导致其积累 [ 8 ] [ 9 ]。Aβ 单体最初聚合成可溶性低聚物，随后聚合成较大的不溶性片段，沉淀为淀粉样蛋白原纤维 [ 10] . β淀粉样蛋白假说认为AD是由Aβ在脑组织斑块中的沉积引起的，是AD防治新方法的基础[ 11 ]。事实上，AD 动物模型可以通过脑室输注 Aβ 1-42 [ 12 ] [ 13 ] 产生。此外，Aβ 的其他片段，如 Aβ 1-40 [ 14 ] - [ 16 ] 和 Aβ 25-35 [ 17 ]，也已显示在体外组装成淀粉样蛋白纤维 [ 16 ] [ 18 ]] 并已被注入大鼠脑室以创建 AD 动物模型。由于 AD 已被证明与降低的二十二碳六烯酸 (DHA) 水平有关 [ 19 ] [ 20 ]，目前正在进行大量人体试验以确定 DHA 是否有效治疗和/或延缓 AD [ 21 ] [ 22 ] 。我们还报告说，DHA 可降低注入 Aβ 的模型大鼠大脑中的淀粉样蛋白负荷 [ 14 ] [ 15 ] 并抑制体外淀粉样蛋白纤颤 [ 16 ] [ 18 ]。这些研究强调了 DHA 作为抗 Aβ 诱导的神经退行性疾病（包括 AD）的优秀治疗剂的潜力。

此前，我们发现 DHA 可抑制 Aβ 原纤维的形成 [ 10 ] [ 14 ] - [ 16 ] [ 18 ]。在这项研究中，我们研究了 DHA 与 Aβ 肽的计算结合，以进一步支持 DHA 的抗 Aβ 纤颤作用。由于无法获得 Aβ 的 X 射线晶体结构，因此在本研究中使用了 NMR 结构。我们进行了分子对接研究，这对于鉴定能够抑制负责疾病病理学的蛋白质并探索它们可能的结合模式的试剂很有用。我们使用硫代黄素-T (ThT) 作为阳性对照，因为它目前被用作在体内和体外选择性结合、染色和鉴定淀粉样蛋白原纤维的“标准”[ 23] . 我们将 DHA 和 ThT（作为配体）与 Aβ 1-42（作为受体）对接，并比较了它们的结合模式。我们旨在确认我们之前研究的结果，显示 DHA 的改善作用及其作为 AD 治疗的潜力，在此计算分析中 [ 10 ] [ 13 ] - [ 16 ] [ 18 ]。

2. 方法和材料

2.1。硫黄素 T 和二十二碳六烯酸模型的制备

DHA (CID: 445580) 和 ThT (CID: 16953) 以 sdf 格式从 PubChem 数据库下载。sdf 文件被提交到 PRODRG 服务器 [ 24 ] 以给出配体的能量最小化结构。执行能量最小化以帮助对接程序从局部最小值中识别生物活性构象异构体。配体的二维结构在图 1中显示为球和棒。

2.2. 配体类药物性质的分析

药物设计主要侧重于优化配体与其靶标的结合相互作用。然而，具有最佳结合相互作用的化合物不一定是最好的药物，因为还涉及其他因素。例如，一种临床上有用的药物必须穿过身体才能到达其目标。如果没有机会达到其目标，那么完善具有良好药物-靶标相互作用的化合物是无关紧要的。影响因素

图 1。配体分子硫代黄素 T (ThT) 和二十二碳六烯酸 (DHA, C22:6, n-3)。

确定一种药物是否会在体内达到其目标被称为药代动力学或 ADME（吸收、分布、代谢和排泄）特性。我们使用了免费的 ADME/tox 过滤工具（FAF-Drugs 3），它可以通过应用几个过滤规则来预测化合物的物理化学性质是否可接受，包括著名的 Lipinski 的五规则（即分子量 > 500， logP 或辛醇/水分配系数 < 5，H 键供体数量 < 5，H 键受体数量 < 10) [Lipinski et al., 2001] [ 25 ]。FAF-Drugs 3 计算的主要属性是刚性和柔性键的数量，根据 Ertl 等人的拓扑极性表面积 (TPSA) 值。(2000) [ 26]、系统环的数量和最大尺寸，以及是否存在不需要的化学物质或化学亚结构（使用 SMARTS 搜索）[ 27 ]。

2.3. Aβ1-42和交叉 β 聚集中的淀粉样蛋白生成区域分析

基于序列的计算方法，即 FoldAmyloid [ 28 ]、AGGRESCAN [ 29 ] 和 ProA [ 30 ]，用于预测 Aβ 1-42中的淀粉样蛋白形成区域。此外，通过对 Aβ 1-42的一级氨基酸序列进行TANGO 算法 [ 31 ] - [ 33 ] 来分析 Aβ 1-42的 β 聚集倾向，该算法旨在预测交叉β 聚集。肽。

2.4. Aβ1-42受体模型的制备

从 RCSB 蛋白质数据库 (PDB) ( http://www.rcsb.org/ ) 下载 Aβ 1-42 (PDB IDs: 2BEG 和 1Z0Q)的三维溶液结构 (3D NMR)作为 ThT 的受体和 DHA 对接。2BEG是同五聚体，即由Aβ 1-42的A、B、C、D和E单体组成。2BEG 的每个单体（A、B、C、D 和 E）包含 10 个坐标模型 [ 9] . 将 A 单体 (A1) 的模型 1、B 单体 (B1) 的模型 1 和 C 单体 (C1) 的模型 1 的坐标加载到 Molegro 虚拟泊坞窗 (MVD) 中并从复合 2BEG PDB 中拆分出来文件。因此，1Z0Q 是由 30 个单体 (A) 组成的均 30 聚体，每个单体都包含一个单独的坐标模型。A1 单体是从复合 1Z0Q PDB 文件中分离出来的。至少需要两个淀粉样蛋白分子才能实现原丝原纤维的重复结构。因此，二聚体（图 2）或三聚体（图 6）模型由 RossettaDock [ 34 ] 生成，如前所述 [ 35] . 随后，生成的二聚体 (A1B1) 或三聚体 (A1B1C1) 用于 ThT 和 DHA 对接（柔性和刚性对接）。

2.5. Aβ 1-42二聚体或三聚体中结合位点的计算分析

二聚体 (A1B1) 和三聚体 (A1B1C1) 的结合位点或口袋由 GHECOM 确定，它检测蛋白质表面/内部的基于网格的口袋/结合位点 [ 36 ]。该程序生成基于残基的“口袋”图，并使用 3D 分子查看器 Jmol [ 37 ] 可视化结合位点的存在。

2.6. Aβ 1-42二聚体 (A1B1)的表面相互作用位点分析

通过将 A1B1 二聚体馈送到 cons-PPISP 服务器 [ 38 ] 来分析蛋白质-蛋白质（单体 - 单体 A1B1 二聚体）表面间相互作用位点，该服务器预测可能形成相邻蛋白质结合位点的残基。沿蛋白质-蛋白质界面的能量分布不均匀；

图 2。Aβ 1-42的单体结构文件是从其父复合 PDB 文件（2BEG 和 1Z0Q）中制备的。随后，形成 Aβ 1-42二聚体以对接配体（ThT 和 DHA）。(a)、(b) 单体；(c), (d) 二聚体。

某些残基对结合自由能的贡献更大，称为“热点”。热点服务器使用经验模型预测蛋白质界面中的热点，该模型包含一些简单的规则，包括溶剂的遮挡和基于总知识的残基对电位 [ 39 ]。为了进一步验证二聚体界面绑定触点上表面间热点的存在，二聚体被馈送到热点预测服务器，包括基于知识的 FADE 和联系人 (KFC2) [ 40 ]。

2.7. ThT 和 DHA 在 Aβ 1-42二聚体上的分子对接模拟

分子对接模拟使用 MVD [ 41 ] 和 PatchDock [ 42 ] 进行。

2.7.1。Molegro 虚拟 Docker (MVD)

MVD 4.3.0 版（免费学术版）及其图形用户界面（MVD 工具）用于生成网格、计算停靠分数和评估构象。从受体文件中去除非极性氢原子，并将它们的部分电荷添加到相应的碳原子上。按照 MVD 用户手册 [ 41 ]中的步骤进行对接。在对接期间计算配体的 MolDock 分数。MVD 执行灵活的配体对接，并在对接过程中优化配体几何形状。因此，配体的键角、键长和扭转角在受体-配体复合物生成阶段被改变。

2.7.2. 补丁坞

PatchDock 是一种基于形状互补/几何的分子对接算法。它旨在寻找产生良好分子形状互补性的对接转换。这种转变会导致宽界面区域和少量空间冲突。确保宽界面包括具有互补特征的对接分子的几个匹配的局部特征。PatchDock 的输出是受体和配体分子之间的候选复合物列表。该列表根据几何形状互补性得分、受体-配体复合物的近似界面面积、配体和受体之间的原子接触能 (ACE) 以及 3D 变换进行排序。最后，服务器提供了以 PDB 格式下载配体-受体复合物的选项。43 ] 。

3. 结果

由 FAF-Drug 3 评估的 DHA 和 ThT 的预测物理 (ADME) 特性如表 1所示. DHA 和 ThT 的性质之间的主要区别在于 LogP（辛醇-水分配系数）值，DHA > 5，但 ThT < 5。因此，DHA 违反了 Lipinski 的五法则，这可能与 DHA 中的酰基链比 ThT 中的更疏水有关。分配系数表示药物在体内的分布。具有高辛醇/水分配系数的疏水性药物主要分布在细胞的脂质双层等疏水区域。可旋转柔性键的数量有助于分子采用具有更大柔韧性的3D结构，而刚性键的数量则相反。分子极性表面积 (PSA) 是预测药物转运特性的非常有用的参数。极性表面积定义为分子中极性原子（通常是氧、氮和连接的氢）的表面总和。该参数用于与人体肠道吸收、单层渗透性和血脑屏障渗透密切相关。通常，极性表面积大于 120 - 140 Å 的分子2往往难以渗透细胞膜。基于水中溶解度(Sw)的口服生物利用度评分为2.29 × 10 -5和2.14 × 10 -5分别用于 DHA 和 ThT。这两个值的对数，即Sw，分别为-4.64 和-4.67。这表明这两种化合物的水溶性相当。由于 Lipinski 规则 (LR) 是基于药物生理效应的物理化学标准（主要是 ADME），但不排除在细胞环境之外分子和蛋白质之间可能的直接相互作用。此外，LRs 受到许多药物或生理相关分子的破坏。值得注意的是，LR 是一组物理化学性质，用于评估一种物质成为有效药物的可能性。但是，可以从对接练习中得出的结论是有限的。如果对接良好且配体获得良好分数，这仅表明该化合物可能对给定靶标具有活性。

Aβ 1-42肽的聚集倾向分析显示在表2中。FoldAmyloid [ 28 ]、AGGRESCAN [ 29 ] 和 ProA [ 30 ]的热点分析表明，从 Val24 到 Lys28/Gly29 以及从 Val39 到 Ala42 的氨基酸残基最容易发生淀粉样蛋白生成。

β-聚集倾向分析还显示，从Lys16到Asp23的氨基酸残基以及从Lys28到Ala42的氨基酸残基表现出最高的β-聚集趋势（图3）。这两个区域（Lys16-Asp23 和 Lys28-Ala42）可能采用 β-折叠二级结构，因此在纤颤过程中具有较高的 β-聚集倾向。

当蛋白质分子与另一种生物聚合物（蛋白质）结合形成复合物时，界面中占蛋白质结合自由能大部分的残基子集称为结合热点。所以，

特性

DHA

THT

分子量（分子量）

330.50

283.41

LogP（辛醇-水分配系数）

5.84

4.66

LogSw（基于水中溶解度的口服生物利用度评分）

−4.64

−4.67

tPSA（拓扑极性表面积，Å2）

40.46

31.78

可旋转债券的数量

刚性键数

灵活性

0.70

0.11

氢键供体 (HBD)

氢键受体 (HBA)

重原子数

碳原子数

杂原子数

*lipinski 违规次数

溶解度

3178.13

2665.28

表 1。使用 FAF-Drugs 3 属性在计算机上预测 DHA 和 ThT 的 ADME 属性。

FAF-Drugs 3 评估了 ThT 和 DHA 的药物样特性。FAF-Drugs 3 是一个用于在计算机建模研究之前过滤大型化合物库的程序。该工具可以对一些 ADME-tox 特性（吸附、分布、代谢、排泄和毒性）进行计算预测，并提供免费的在线服务来计算重要的分子特性（LogP、极性表面积、氢键供体的数量和数量）氢键受体），以及对最重要药物靶点的生物活性评分的预测。

氨基酸序列

亮氨酸

瓦尔

苯丙氨酸

翼

谷氨酸

天冬氨酸

瓦尔

甘氨酸

塞尔

砷化镓

赖氨酸

甘氨酸

翼

伊莱

甘氨酸

亮氨酸

遇见

瓦尔

甘氨酸

瓦尔

伊莱

翼

1 -------------- 6

折叠淀粉样蛋白1

灰

侵略扫描2

橙

亲A3

绿

表 2。分析 Aβ 1 - 42肽序列中易聚集的氨基酸残基

1个折叠淀粉样蛋白[ 28 ]、2 个AGGRESCAN [ 29 ] 和3 个ProA [ 30 ] 服务器采用算法从蛋白质氨基酸序列中预测淀粉样蛋白区域。分析基于对蛋白质聚集至关重要的氨基酸物理化学性质。颜色块表示容易聚集的“常见”氨基酸残基，由1,2,3 不同的服务器分析。

图 3。Aβ 1 -42的β-聚集倾向分析。红线表示诱导β聚集的氨基酸序列区域（显示为单字母带）。

我们分析了 A1B1 二聚体的蛋白质-蛋白质界面相互作用位点。由于淀粉样蛋白纤颤始于至少两条 β 链之间的相互作用，因此识别这些相互作用位点对于了解这些位点的性质、DHA 是否影响它们以及随后的纤颤至关重要。A1单体的Phe19和Phe20与B1单体的Phe19和Phe20相互作用。“热点”服务器主要考虑界面残留物的溶剂可及性和总接触潜力。输出文件将界面残基与突出显示的热点及其特征制成表格。潜力最高的“热点”位于 2BEG 的 B1 链上的 Leu34。KFC2显示相互作用位点在A1和B1的Phe19和Phe19。表 3。

口袋性是一个重要参数，有助于确定配体与其受体的结合位点。2BEG 二聚体或三聚体显示约 5 或 6 个口袋，而 1Z0Q 二聚体显示 4 个口袋（图 4）。

MVD 执行的对接提供了五个最佳姿势，我们获得了相应的 MolDock 得分值和其他热力学计算值。最佳评分对接的 3D 结构如图 5(a)-(c) 所示。ThT 和 DHA 与 Aβ 1-42（受体）的空间相互作用也用 MVD 进行了评估。ThT 与 2BEG 二聚体 (A1B1) 的氨基酸残基的相互作用图如图 5 (a1) 所示。DHA与二聚体Aβ1-42（2BEG的A1B1和1Z0Q的A1A2）的对接及其相互作用图如图5（b）、图5（b1）和图5（c）、图5所示（c1），分别。使用 MVD，当 DHA 与 2BEG 和 1Z0Q 二聚体对接时，DHA 的 MolDock 分数分别为 -122.40 Kcal/mol 和 -140.40 Kcal/mol。当与 2BEG 二聚体对接时，ThT 参考分子的 MolDock 分数为 -130.37 Kcal/mol。因此，DHA 与 2BEG 二聚体的结合与 ThT 的结合相当，如相似的结合能所示（图 5（b））。

参与 DHA 与 Aβ 1-42二聚体 (2BEG, A1B1) 和 Aβ 1-42三聚体 (1Z0Q, A1A2) 对接的氨基酸通过 DHA 原子与淀粉样蛋白氨基酸之间相互作用的接触图进行可视化

氨基酸序列

亮氨酸

瓦尔

苯丙氨酸

翼

谷氨酸

天冬氨酸

瓦尔

甘氨酸

塞尔

砷化镓

赖氨酸

甘氨酸

翼

伊莱

甘氨酸

亮氨酸

遇见

瓦尔

甘氨酸

瓦尔

伊莱

翼

1 ------------------- 6

PPISP1

蓝

葛

热点2

黄

肯德基3

紫

黄

紫

表 3。分析 Aβ 1-42二聚体 (A1-B1)的单体 (A1) -单体 (B1) 表面间相互作用位点。

1 Cons-PPISP 是一种用于预测蛋白质-蛋白质相互作用位点的共识神经网络方法。鉴于蛋白质的结构，cons-PPISP 将预测可能形成另一种蛋白质结合位点的残基。神经网络的输入包括每个残基及其空间邻居的特定位置序列谱和溶剂可及性。神经网络在蛋白质-蛋白质复合物的已知结构上进行训练 [ 38 ]。2 Hotpoint：Hotpoint，使用经验模型预测蛋白质界面中的热点。经验模型结合了一些规则，包括溶剂的遮挡和基于知识的残基对势 [ 39 ]。3KFC2（基于知识的 FADE 和接触）服务器通过识别指示重要结合接触的结构特征来预测蛋白质-蛋白质界面内的结合“热点”。服务器分析界面残留物周围的几种化学和物理特征，并使用基于先前实验数据训练的模型预测残留物的分类。颜色块表示作用于表面相互作用位点的“常见”氨基酸残基，因为 Aβ 1-42由不同的服务器分析。

图 4。Aβ 1-42的结合位点（口袋）分析。预测配体结合位点的最简单方法之一是识别蛋白质表面的口袋状区域。结合位点或口袋被定义为小探针可以进入但大探针不能进入的空间。口袋本质上具有两个任意属性，大小和深度。GHECOM 使用探针球分析这些口袋。假设探针球的半径对应于口袋的大小和深度。这些值可以根据单个推定的配体分子进行调整。二聚体 (A1B1) 和三聚体 (A1B1C1) 的结合位点或口袋由 GHECOM 确定，它检测蛋白质表面/内部基于网格的口袋/结合位点 [ 36] . 结合位点的存在使用 3D 分子查看器 Jmol [ 37 ] 进行可视化。该程序还生成基于残基的“口袋”图（右图）。(a1)、(b1)、(c1) 左图 (a)、(b) 和 (c) 的每个口袋中涉及的氨基酸数量和位置（表示为一级序列上的线）。详情请参阅参考文献[ 36 ]。单独的颜色表示存在不同的口袋。

图 5。ThT 和 DHA 与MVD受体 (Aβ 1-42 )的最佳对接姿势(a) ThT 停靠在 2BEG A1B1 二聚体上。(b) DHA 停靠在 2BEG A1B1 二聚体上。(c) DHA 停靠在 1Z0Q A1A2 二聚体上。还显示了相互作用（结合）能量（ΔG）。ThT/DHA 的原子与 2BEG/1Z0Q 二聚体的氨基酸残基之间相互作用的接触（结合）图显示在右图 (a1) (b1) 和 (c1) 中。接触图由 MVD 的“配体图”模块可视化。

使用 MVD 的残基（图 5 (b1) &图 5 (c1) 和表 4）。发现与 ThT 空间相互作用的 A1B1 二聚体的氨基酸残基是 A1 的 Ile32、Gly33 和 Leu34 以及 B1 的 Ile31、Ile32、Gly33 和 Leu34。

我们还使用 PatchDock 对 ThT 和 DHA 进行了分子对接，以确认 DHA 结合 2BEG A1B1 二聚体和 2BEG A1B1C1 三聚体的能力（图 6）。PatchDock 中使用的算法执行刚性对接，表面可变性/灵活性通过自由分子间渗透隐式解决。当与二聚体对接时，DHA 和 ThT 的几何形状互补性得分相似（得分：ThT = 3742；DHA = 3732）。然而，当 DHA 与三聚体对接时，形状互补性更高（得分：ThT = 3632；DHA = 4326）。DHA 的近似复杂界面区域（受体-配体）也较高。在对接二聚体时，ThT 和 DHA 的 ACE 几乎相似。然而，当对接到三聚体时，ThT 略高（表 5）。这些数据表明 DHA 和 ThT 具有相似的结合亲和力。

对接（受体与配体）

分数

区域

高手

A1B1 二聚体与 ThT

3742

445.40

−248.98

A1B1 二聚体与 DHA

3732

496.70

−241.07

A1B1C1 三聚体与 ThT

3632

4.33.6

−219.71

A1B1C1 三聚体与 DHA

4326

542.10

−198.30

表 4。ThT 和 DHA 与 2BEG 淀粉样蛋白二聚体 (A1B1) 和三聚体 (A1B1C1) 的补丁对接。

缩写：Score，几何形状互补性得分；面积，复合物（受体-配体）的近似界面面积；ACE，原子接触能；A1B1 二聚体，通过将 2BEG 的 A1 和 B1 模型 1 馈送到 Rosetta Server 生成；A1B1C1三聚体，将2BEG的A1、B1、C1坐标模型1馈送到Rosetta Server生成；ThT，硫代黄素 T；DHA，二十二碳六烯酸。

氨基酸序列

亮氨酸

瓦尔

苯丙氨酸

翼

谷氨酸

天冬氨酸

瓦尔

甘氨酸

塞尔

砷化镓

赖氨酸

甘氨酸

翼

伊莱

甘氨酸

亮氨酸

遇见

瓦尔

甘氨酸

瓦尔

伊莱

翼

1 ---------- 6

DHA

2BEG

红

1Z0Q

黄

THT

2BEG

蓝

表 5。DHA 和 ThT 与 Aβ 1-42二聚体结构（ 2BEG的 A1B1 和 1Z0Q 的 A1A2）的NMR结构的对接总结。

当 DHA 和 ThT 对接到 2BEG 二聚体时，它们在 A1 肽的 Ile31 处共享一个共同的结合位点。2BEG 和 1Z0Q pdb 在 A1 的 Ala21 和 B1 肽的 Glu21 处具有共同的结合位点。（序列的）给定位置的颜色块表示配体的共同结合位点。

图 6。使用 A1B1 二聚体 (a) (b) 和 A1B1C1 三聚体 (c) (d) 的 ThT (a)-(c) 和 DHA (b)-(d) 的 Patch Dock 的最佳评分结果。配体（ThT 和 DHA）以绿色棒表示，受体（二聚体和三聚体）显示为 β-折叠带，氨基酸侧链以棒表示。

从 PatchDock 获得的配体对接受体使用 PyMOL 进行可视化，如图 6所示。ThT 与二聚体和三聚体的内部区域结合（图 6（a）和图 6（c）），而 DHA 被发现包裹在二聚体的 β-折叠周围（图 6（b）和图 6（ d))。

4。讨论

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是世界范围内最常见的慢性痴呆相关疾病之一，AD患者的数量每年都在增加。目前，只有两种药物（胆碱酯酶抑制剂和 NMDA 受体拮抗剂）被美国食品和药物管理局 [ 44 ] 批准用于治疗 AD 的认知症状（记忆丧失和混乱）。然而，这些药物不能治愈 AD 或阻止其进展。维生素或其他补充剂，如 omega-3 脂肪酸 [ 45]，并且各种草药混合物也被广泛推广为可能支持认知健康或预防或延迟 AD 的制剂。NIH 小组得出的结论是，有一些更强有力的数据——但没有确凿的证据——表明鱼油中的 omega-3 脂肪酸可能有助于防止认知能力下降。这种结论的基础可能与 AD 患者大脑中 omega-3 多不饱和二十二碳六烯酸（DHA、C22:6、n-3）的浓度显着降低有关的事实 [ 21 ] [ 22 ]。我们还报告了膳食 omega-3 多不饱和脂肪酸补充剂对日本老年轻度痴呆患者与年龄相关的认知能力下降的有益影响 [ 46] . 因此，DHA 补充剂可能会减缓 AD 的认知症状。

我们之前表明，长期服用 DHA 可显着降低 AD 模型大鼠大脑中的淀粉样蛋白负荷 [ 14 ]。DHA 还抑制 Aβ 1-40 [ 16 ]、Aβ 1-42 [ 10 ] 和 Aβ 25-35 [ 18 ]的体外淀粉样蛋白纤颤，表明由这些淀粉样蛋白引起的神经毒性会被 DHA 抑制。此外，我们发现 DHA 降低了 Aβ 1-42诱导的 SH-S5Y5 细胞毒性 [ 10]，我们之前的透射电子显微镜、激光扫描荧光显微镜和硫代黄素 T 荧光光谱研究清楚地表明，DHA 通过一些未知的机制来抵抗原纤维生成 [ 10 ] [ 16 ] [ 18 ]。尽管有强有力的证据表明 Aβ 的可溶形式对突触有毒，但有毒物质的确切形式仍有待确定。有证据表明 Aβ 的低分子量二聚体和三聚体都具有毒性 [ 47 ] - [ 50 ]。使用蛋白质印迹分析和/或聚丙烯酰胺凝胶电泳，我们还表明 DHA 抑制二聚体/三聚体和寡聚体 Aβ 的原纤维化 [ 10] ; 因此，它最终会减少淀粉样蛋白原纤维化的伸长过程，从而导致纤维成熟。最后，在 DHA 处理的细胞培养物中，Aβ 诱导的细胞凋亡和神经变性 [ 10 ]的减少进一步支持了 DHA 的抗 Aβ 纤颤作用。这些体内/体外实验数据强烈表明，DHA 可防止淀粉样肽形成有毒物质，最终恶化 AD 患者的记忆力和其他行为方面。

这些发现还表明，Aβ 肽是重要的药物靶点，设计破坏 Aβ-Aβ 表面间相互作用位点形成的药物对于防止 Aβ 纤维形成尤为重要。因此，我们进行了计算机研究，以支持实验证明 DHA 对 Aβ-纤颤的改善作用。因此，我们对 DHA 的 3D 结构进行了建模，并使用对接模拟来确定 DHA 是否与 Aβ 肽结合并预测配体 (DHA) 和受体 (Aβ) 之间的亲和力。在使用 MVD 和 PatchDock 进行对接模拟期间，我们使用 ThT 作为阳性对照来验证对接是否会在与 Aβ 肽结合时产生类似于 DHA 的配体几何形状。

使用 MVD，DHA 在 2BEG 下的 MolDock 得分为 -122.4 Kcal/mol，在 1Z0Q 下为 -140.40 Kcal/mol，而 ThT 的 MolDock 得分为 -130.37 Kcal/mol。这些结果表明 DHA 与二聚体 Aβ 1-42分子有相当大的结合。这可能解释了在给予 DHA 的 AD 模型大鼠的大脑中观察到的淀粉样蛋白负荷减少 [ 16 ] 以及同时抑制体外原纤维形成 [ 10 ]。单体-单体表面相互作用位点分析表明，Phe19 (A1) 和 Phe19 (B1) 是常见的氨基酸残基，它们作为单体-单体表面间相互作用位点（表 3）。其他氨基酸残基，包括 Phe20 (A1)、Phe20 (B1)、Ala21 (A1)、Asp23 (A1)、Gly25 (A1)、Lys28 (B1)、Ile32 (B1)、Gly33 (A1)、Leu34 (B1) 、Met (A1)、Val36 (A1)、Val36 (B1)、Gly37 (A1)、Gly37 (B1)、Gly38 (A1)、Val39 (B1)、Val 40 (A1) 和 Ile41 (B1) 也充当表面间相互作用位点（表 3）。这些表面间相互作用位点可能已被 DHA 靶向，正如 DHA 与这些氨基酸区域的相互作用所表明的那样，特别是 Phe19、Ala21、Asp23 和 Leu34 的那些。值得注意的是，DHA 还与 1Z0Q 的 Ala21、Glu22、Asp23 和 Ser26-Ile31 相互作用，其处于 a-螺旋无规卷曲构象，而不是作为纤颤传播的先决条件的 b-折叠构象。如表2所示, 氨基酸残基 24-29 和 39-42 是 Aβ 1-42最容易聚集的区域。所有这些结果表明 DHA 与这些易于聚集的单体-单体表面间相互作用位点相互作用。此外，ThT 以与 DHA 类似的方式与 2BEG 对接，并与 Ile31、Ile32、Gly33 和 Leu34 结合。

在 PatchDock 系统中，DHA 和 ThT 的对接是相似的，如几乎相似的对接分数所示。然而，当它们通过 PatchDock 对接至 Aβ 1-42三聚体时，DHA 显示出比 ThT 更高的结合亲和力（得分）。当使用 PyMOL 观察 PatchDock 受体-配体时（图 6），获得了一个有趣的特征：DHA 螺旋包裹二聚体，而 ThT 结合在二聚体内部。值得注意的是，DHA 和 ThT 都与预测的结合口袋结合（图 4）。配体分子 (DHA) 和受体 (Aβ 1-42 ) 之间的结合相互作用) 在确定抗淀粉样蛋白活性方面具有重要作用。因此，该计算研究中 DHA 的结合潜力支持了我们之前的体内和体外生物学研究结果，表明 DHA 降低了大鼠 AD 模型中的体外淀粉样蛋白纤颤和淀粉样蛋白脑负荷，同时改善了 Aβ 诱导的记忆损失 [ 10 ] [ 14 ] [ 16 ] [ 18] . AD药物发现是一个非常漫长和昂贵的过程，AD的预防仍然是世界范围内的一个紧迫问题。在过去的几年中，包括 DHA 在内的多不饱和脂肪酸作为潜在的候选药物在 AD 和/或 AD 人类患者的实验动物模型中被不断研究，其副作用最小。对未来的高通量筛选使用有针对性和更具体的方法，例如基于此处进行的类似计算机实验结果的方法，我们可能能够更快地识别新的 AD 药物。

5. 结论

计算药物设计是一种很有前途的方法，可以在未来几年发现更多药物。在这里，我们证明 DHA 的分子对接与其抗淀粉样蛋白作用一致，特别是对 AD 模型大鼠的体外纤颤和体内 Aβ 诱导的记忆障碍。我们的研究进一步证实了 DHA 对 Aβ 的结构和生物学功能很重要。我们还表明，对对接值进行评分可以最好地预测配体与蛋白质的相互作用。最后，我们的计算机结果为 DHA 作为神经退行性疾病（如 Aβ 1-42诱导的 AD）的预防药物的效用提供了令人信服的证据。对 DHA 样分子的进一步研究为开发抗淀粉样蛋白药物提供了希望。

致谢

这项工作部分得到了日本教育文化、体育、科学和技术部 (26500008 至 MH) 的科学研究资助 (C) 的支持。我们也非常感谢 MVD 权威为我们提供免费的学术版本。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

使用的缩写

AD：阿尔茨海默病；

Ab：β淀粉样肽；

RCSB：结构生物信息学研究实验室；

PBD：蛋白质数据库；

MVD：Molegro 虚拟 Docker；

ThT：硫黄素 T；

DHA：二十二碳六烯酸

提交您的手稿： http: //papersubmission.scirp.org/

笔记

*通讯作者。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

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