余甘子对东莨菪碱诱导的痴呆和氧化应激动物模型学习记忆障碍的神经保护作用

摘要：自然是补充和替代医学的最佳来源。植物 Phyllanthus acidus (PA) L. 传统上用于治疗疼痛、炎症和氧化应激相关疾病。因此，选择 PA 甲醇提取物 (MEPA) 来探索这种植物增强认知功能、大脑抗氧化酶和抗乙酰胆碱酯酶活性的能力，可用于治疗与氧化应激相关的疾病，如阿尔茨海默病 (AD) ）。本研究旨在探讨MEPA对东莨菪碱致痴呆和氧化应激大鼠学习记忆障碍的神经保护作用。用 MEPA 处理（即, 100 和 200 mg/kg bw) 在东莨菪碱治疗的瑞士白化病雄性大鼠中研究 14 天，并使用高架十字迷宫 (EPM) 测试、被动回避 (PA) 测试、新物体识别 (NOR) 检查其神经保护作用测试、莫里斯水迷宫 (MWM) 测试以及抗氧化酶水平，例如过氧化氢酶 (CAT)、超氧化物歧化酶 (SOD)、谷胱甘肽还原酶 (GSR)、谷胱甘肽-S-转移酶 (GST)、还原型谷胱甘肽 (GSH) 、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px)、脂质过氧化 (TBARS) 含量和大鼠脑组织匀浆中的乙酰胆碱酯酶 (AChE) 活性。MEPA 给药显着 (P < 0.05, P < 0.01; P < 0.01) 减少大鼠在第 7天和第14天的 RTL (保留转移潜伏期)在 EPM 测试中与疾病对照组和对照组相比。在 PA 测试中，MEPA 的剂量暗示性（P < 0.05，P < 0.001；P < 0.05，P < 0.01）在 7日和 14日增加大鼠的 STL（逐步潜伏期）天相对于疾病控制组和对照组。对于 MEPA 的 NOR 测试管理，与疾病对照组和对照组相比，大鼠的 DI（辨别指数）显着增加（P < 0.01，P < 0.001；P < 0.01）。MEPA 的剂量显着（P < 0.05，P < 0.01；P < 0.01）降低了 EL（逃逸潜伏期），显着（P < 0.01，P < 0.001；P < 0.05，P < 0.01）增加了 TSTQ（在目标象限）在连续几天与疾病控制组和对照组在 MWM 测试的获得试验中的比较。如果进行 MWM 测试 MEPA 管理的探测试验，则 TSTQ 显着增加（P < 0.01；P < 0.05，P < 0.01）并显着增加（P < 0.05，P < 0.01；P < 0.05，P < 0。01) 与疾病对照组和对照组相比，大鼠连续几天的 TSA（在环内停留的时间）增加。MEPA 给药显着（P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001；P < 0.05，P < 0.01）增加了 CAT、SOD、GSR、GST GSH、GSH-Px 的水平，并且显着（P < 0.01；P < 0.01 , P < 0.001) 通过抑制脂质过氧化降低 TBARS 水平以及显着 (P < 0.01, P < 0.001; P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001) 与疾病对照和对照相比降低大鼠脑中的 AChE 活性团体。本研究表明，MEPA 通过改善认知功能表现出神经保护作用，并通过增加脑抗氧化酶水平以及降低脂质过氧化和乙酰胆碱酯酶活性来减少氧化应激。所以，

关键词

神经保护,叶下珠,抗氧化酶,痴呆症,氧化应激, 乙酰胆碱酯酶活性,阿尔茨海默病

一、简介

认知是以一种有规律的方法存储事实排列的过程，通过这种方法，人们会注意到周围的环境、对象和视图[ 1 ]。认知障碍是正常老年人生活中最重要的健康并发症之一，其中包括阿尔茨海默病 (AD) [ 2 ] 在内的一些神经系统疾病。AD 是一种与年龄相关的进行性神经退行性疾病，与不可避免的认知功能丧失有关。这是最常见的痴呆形式，约占所有记忆障碍病例的 60% [ 3 ]。目前全球有 3000 万人受到这种疾病的影响，据估计，到 2050 年，将有超过 1.15 亿人患有痴呆症 [ 4 ] [ 5] . 这种疾病的特点是老年斑、β-淀粉样蛋白 (Aβ) 的沉积和大脑皮层和皮层下灰质中神经原纤维缠结 (NFT) 的发展 [ 6 ]。阿尔茨海默病患者的大脑中乙酰胆碱酯酶 (AChE) 水平升高，而乙酰胆碱酯酶 (AChE) 负责分解乙酰胆碱 (ACh)。ACh 是一种神经递质，对中枢胆碱能系统的正常运作起重要作用 [ 7 ]。AD没有治疗方法。然而，一些 AChE 抑制剂，如毒扁豆碱、他克林和多奈哌齐，可能有助于在有限的时间内防止症状恶化 [ 6 ]。因此，探索药用植物对治疗各种认知障碍的有用性是有利可图的。

东莨菪碱是一种托烷类生物碱，通常通过腹膜内注射来研究实验动物的认知缺陷。它在结构上类似于神经递质乙酰胆碱，并通过阻断导致胆碱能功能障碍和认知障碍的毒蕈碱乙酰胆碱受体发挥其功能 [ 8 ]。最近，许多研究表明，东莨菪碱诱导的动物模型中的记忆障碍与脑内氧化应激的增加有关，这是由于脑抗氧化酶的改变而引起的 [ 9 ] - [ 11 ]。越来越多的证据强调自由基介导的氧化应激是导致 AD [ 12] . 为了过上正常的生活，氧化对于导致产生作为副产物的活性氧（ROS）的生物反应或过程是必要的。人体的正常运作取决于氧化还原稳态，即氧化和抗氧化之间的平衡[ 13 ]。在迟发性散发性 AD 的情况下，氧化和抗氧化因子之间的不平衡会导致细胞和分子异常 [ 14 ]。神经元网络，即大脑更容易受到氧化损伤，因为神经元细胞膜中长链多不饱和脂质含量高、耗氧量高、过渡金属代谢率高、抗氧化防御能力差 [ 15 ] [ 16 ]] . 多项研究表明，在氧化应激后，会形成老年斑和 NFT，这两者都是 AD 的神经病理学标记 [ 17 ]。除此之外，大脑的抗氧化防御能力是适度的。与肝脏相比，大脑中过氧化氢酶 (CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px) 和维生素 E 的含量较低 [ 18 ]。

抗氧化剂是外源性或内源性物质，可防止氧化并对抗与氧化应激相关的对细胞系统的有害影响 [ 19 ]。抗氧化剂还与清除自由基、预防自由基链式反应和改善患者的抗氧化状态有关 [ 20 ]。为了预防或减缓自由基介导的氧化应激的进展，大脑抗氧化防御酶如过氧化氢酶 (CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px)、谷胱甘肽还原酶 (GSR)、还原型谷胱甘肽 (GSH) 和谷胱甘肽-S -转移酶 (GST) 发挥重要作用 [ 21] . 近年来，人们越来越关注抗氧化剂在治疗与自由基介导的氧化应激相关的疾病中的治疗用途。正如世界卫生组织 (WHO) 所说，世界上超过 80% 的人口相信补充和替代医学用于他们的医疗保健 [ 22 ]。药用植物的民俗学概念在治疗各种疾病方面发挥着积极作用。药用植物和植物产品的使用日益增加。发展中国家约有 35 亿人，主要依靠周围的药用植物和草药来满足他们的医疗保健需求 [ 23] . 另一方面，在西方社会，拒绝合成或生物医学产品已成为一种增长趋势，并导致对天然药物的需求增加 [ 24 ]。在治疗与年龄和神经退行性疾病相关的认知功能障碍中，药用植物的植物成分起着核心作用。在治疗 AD 药用植物如银杏、假马齿苋和锯缘石杉的治疗中，已被广泛研究 [ 25 ] - [ 27 ]。

植物 Phyllanthus acidus (PA) L. 在孟加拉语中被称为 Orbori，属于 Phyllanthaceae 家族，已被探索用于认知活动 [ 28 ]。这种植物广泛分布于孟加拉国、印度南部和东南亚国家[ 29 ]。果实为核果，扁圆形，浅 6 或 8 裂，黄绿色至乳白色，含 6 至 8 粒光滑种子 [ 30 ]。这种植物传统上用于治疗多种疼痛、炎症和氧化应激相关疾病，如发烧、风湿病、支气管炎、哮喘、呼吸系统疾病、肝病、糖尿病、淋病和胃肠道疾病 [ 31] . 叶下珠属富含多种植物成分，如生物碱、酚类、类黄酮、单宁、萜烯和木脂素 [ 32 ]。据报道，PA 的不同部分具有出色的药用特性。该植物的叶子据称具有抗高血压、抗菌、保肝活性，也可用作毒蛇毒的解毒剂 [ 33 ]。该植物的根和种子可用作泻药，树皮和根传统上用于治疗发烧 [ 34 ]。该植物的乳胶具有通便和催吐活性[ 35 ]。果实被用作记忆增强剂、血液净化剂、食欲兴奋剂、缓解咳嗽和预防糖尿病 [ 36 ]。

以前的研究表明，这种植物的果实具有抗氧化、增强记忆力、抗胆碱酯酶、收敛、保肝、细胞毒性和抗菌活性 [ 37] . 因此，本研究旨在通过行为研究，例如高架十字迷宫 (EPM) 测试、被动回避 (PA) 测试、新物体识别 (NOR) 测试，研究 MEPA 对东莨菪碱诱导的大鼠学习和记忆障碍的神经保护作用，莫里斯水迷宫 (MWM) 测试以及通过生化研究的抗氧化酶活性，例如过氧化氢酶 (CAT)、超氧化物歧化酶 (SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px)、谷胱甘肽还原酶 (GSR)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、还原型谷胱甘肽 (GSH)、大鼠脑组织匀浆中脂质过氧化 (TBARS) 和乙酰胆碱酯酶 (AChE) 活性的估计。

2。材料和方法

2.1。化学品和药物

乙酰硫代胆碱碘化物 (ATCI)、5,5-二硫代双-2-硝基苯甲酸根离子 (DTNB)、三氨基甲烷盐酸盐 (Tris-HCl)、牛血清白蛋白 (BSA)、吩嗪甲基硫酸钠焦磷酸钠、叠氮化钠、谷胱甘肽还原酶、氧化型谷胱甘肽、还原型谷胱甘肽 (GSH)、乙二胺四乙酸 (EDTA)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADPH)、1-氯-2,4-二硝基苯 (CDNB)、三氯乙酸 (TCA)、硫代巴比妥酸 (TBA) 和三氯乙酸均购买来自美国 Sigma-Aldrich。除非另有说明，所有其他化学品均为分析级。盐酸多奈哌齐粉末购自 Incepta Pharmaceuticals Ltd. 作为礼物和东莨菪碱丁基溴注射液（Butapan®) 标有 20 mg/ml 的标签，购自孟加拉国达卡市的零售药店。

2.2. 植物材料的收集和鉴定

PA的叶子于2014年8月从孟加拉加济布尔的卡帕西亚采集。采集后的叶子经过适当的清洗以去除脏物，并由孟加拉达卡米尔普尔的孟加拉国家植物标本馆的专家鉴定。登录号：用于 PA 的 DACB-40181。

2.3. 植物材料的干燥和研磨

采集后的植物新鲜果实切成小块，晒干7天，最后放入不超过50℃的烘箱中烘干，以便更好地研磨。干燥后，将全部部分用研磨机研磨成粗粉，并储存在密闭容器中以备后用。

2.4. 植物材料的提取

将重量约为 500 克的粉末状植物材料（水果）装入琥珀色玻璃瓶中，并在室温下浸泡在 1.5 升 98% 的甲醇中。将装有内容物的瓶子密封并保持约7天，偶尔摇晃和搅拌。然后将整个混合物通过棉花过滤，然后通过 Whatman No. 1 滤纸过滤，并在 50°C 温度下用旋转蒸发仪在减压下浓缩，得到粗提物 (12.542 g)。

2.5. 动物

本研究使用瑞士白化雄性大鼠。56 只体重约 180-230 克的瑞士大鼠购自孟加拉国达卡的 ICDDR,B。在标准实验室条件下将动物关在笼子中（每例3只大鼠），每个12小时的明暗交替循环。食物和水供应及时。根据美国国立卫生研究院 (NIH) [ 38 ] 的实验动物指南，对动物进行护理和使用。实验方案经孟加拉国达卡东南大学药学系动物伦理委员会批准。

2.6. 药物和试验化合物的管理

盐酸多奈哌齐用作标准药物。用生理盐水 (pH 7.4) 制备盐酸多奈哌齐溶液并以 1 mg/kg 体重 (bw) 对大鼠口服 (po)。以 1 mg/kg 体重向大鼠腹膜内 (ip) 施用丁溴东莨菪碱。将称重的 MEPA 悬浮在生理盐水 (pH 7.4) 中并以 100 和 200 mg/kg bw 对大鼠口服给药 根据文献检索调整了盐酸多奈哌齐、丁溴东莨菪碱和 MEPA 的剂量 [ 37 ] [ 39 ] - [ 41 ]。每天新鲜制备药物和提取物混悬液，并在实验前30分钟给药。

2.7. 实验设计

将大鼠随机分为8组，每组6只大鼠，如下：

第1组：在该组的情况下，向大鼠施用标准食物和水（Con）。

第 2 组：在该组的情况下，以 1 mg/kg bw 的剂量将东莨菪碱丁基溴腹膜内施用于大鼠 (Sco)。

第 3 组：在该组的情况下，以 1 mg/kg bw 的剂量向大鼠 (Don) 口服给予盐酸多奈哌齐。

第 4 组：在该组的情况下，将 100 mg/kg bw 剂量的植物提取物口服给予大鼠 (MEPA 100)。

第 5 组：在该组的情况下，将 200 mg/kg bw 剂量的植物提取物口服给予大鼠 (MEPA 200)。

第 6 组：在该组的情况下，向大鼠施用 1 mg/kg bw 剂量的东莨菪碱丁基溴和 100 mg/kg bw 剂量的植物提取物 (Sco + MPA 100)。

第7组：在该组的情况下，向大鼠施用1mg/kg bw剂量的东莨菪碱丁基溴和200mg/kg bw剂量的植物提取物(Sco + MPA 200)。

第8组：在该组的情况下，向大鼠施用1mg/kg bw剂量的东莨菪碱丁基溴和1mg/kg bw剂量的盐酸多奈哌齐(Sco + Don)。

2.8. 急性毒性研究

将大鼠分为4组，每组6只。生理盐水用作载体以制备提取物的悬浮液。大鼠仅用提取物处理一次，剂量为 5、50、300 和 2000 mg/kg bw 给予提取物前大鼠禁食 3 至 4 小时，但仅提供水，给药后禁食 1 次到 2 小时。接下来 24 小时观察大鼠的任何行为、神经学特征，并在 14 天观察死亡率。提取物的急性毒性研究是根据经济合作与发展组织 (OECD) [ 42 ] 的指导方针进行的。

2.9。行为研究

对大鼠进行为期一周的训练，以使它们为行为研究做好准备。在训练期间，只给大鼠喂食食物和水。训练有素的大鼠是该研究的选择。研究在上午 10 点到下午 3 点之间在隔音室进行。

2.9.1。高架十字迷宫 (EPM) 测试

大鼠的空间长时记忆通过使用EPM测试来评估[ 43 ]。典型的 EPM 设备由两个开放臂（长 500 mm × 宽 100 mm）和两个闭合臂（长 500 mm × 宽 100 mm × 侧壁高 400 mm）组成。迷宫被抬高到离地面500毫米的高度。在迷宫的中间，手臂由一个中央正方形连接 [ 44] . 在采集试验期间，将每只大鼠单独放置在背对中央平台的张开臂末端，并将从张开臂末端移动到任一闭合臂所需的时间记录为初始转移潜伏期 (ITL)使用秒表。如果大鼠在 300 秒内没有进入其中一个闭合臂，则将其背部推入一个闭合臂，转移潜伏期为 300 秒。之后，让大鼠探索该装置 30 秒以熟悉迷宫，然后返回其家笼。保留试验在采集试验后 24 小时进行，从开放臂末端移动并重新进入任一闭合臂所需的时间被记录为使用秒表的保留转移潜伏期 (RTL) [ 45] . 为了在每次测试后去除任何嗅觉线索，用 70% 乙醇清洁设备 [ 46 ]。

2.9.2. 被动回避（PA）测试

基于情境恐惧条件学习和工具学习的大鼠情绪记忆通过使用PA测试进行评估[ 47 ]。典型的 PA 设备由一个光室（深度 270 mm × 宽 370 mm × 高 360 mm）和一个暗室（深度 270 mm × 宽 370 mm × 高 360 mm）组成。直径为 90 mm 的滑动门位于设备的中间部分。该设备的底板由直径为 0.3 厘米、间隔 0.6 厘米的钢筋组成。冲击发生器连接到钢筋，能够产生 0.5 mA 范围内的冲击 [ 48] . 在采集试验中，将一只老鼠放在明亮的隔间中，当老鼠进入黑暗的隔间时，门被关闭，并给予 0.5 mA 的电脚电击，持续 3 秒 [ 49 ]。使用秒表将进入暗室所需的时间记录为转移潜伏期 (TL)。电击后立即将老鼠送回笼子。保留试验在采集试验后 24 小时进行，其中当大鼠进入暗室时没有电击，并且重新进入暗室的潜伏期被测量为逐步潜伏期 (STL)。如果大鼠在 300 秒内没有进入暗室，它的 STL 被测量为 300 秒 [ 50] . 为了在每次测试后去除任何嗅觉线索，用 70% 乙醇清洁设备 [ 46 ]。

2.9.3。新物体识别 (NOR) 测试

使用 NOR 测试评估大鼠的物体识别记忆，[ 51]这是盒形装置（深70厘米×宽50厘米宽×高40厘米）。金属三角形（8.5 × 5 × 14 cm）和矩形棱柱（5 × 5 × 14 cm）被用作物体。每个测试由两个不同的试验组成，例如培训课程和测试课程。在试验开始时，将两个相同的物体引入设备中。对于训练课程，每只大鼠被放置在设备中，并允许探索对象的时间≥10 秒。当大鼠嗅探和/或触摸距离其鼻子 <2 cm 的对象时，确定对象探索。之后，老鼠被送回了自己的笼子。在测试之前，其中一个相同的对象被一个新的对象替换并随机放置。培训课程结束 24 小时后进行测试，其中大鼠被允许探索新的和熟悉的物体 4 分钟。新事物和熟悉物体的探索次数用于确定辨别指数（DI）[52 ]。每次测试后用 70% 乙醇清洁该装置以去除任何嗅觉线索。

2.9.4。莫里斯水迷宫 (MWM) 测试

大鼠的空间学习和记忆能力采用MWM测试进行评估[ 50 ]。典型的 MWM 设备由直径为 1700 毫米、深度为 450 毫米的聚丙烯制成的圆形罐组成。迷宫分为四个象限，其中一个隔间放置一个直径为 110 毫米、高 250 毫米的目标平台。水箱中充满不透明的水，深度为 260 毫米，以使平台浸没在水面以下约 1 厘米处[ 53] . 对于采集试验，在水箱隔间的中间放置一只老鼠，并使用秒表记录它安装到水下平台上以确定逃生潜伏期 (EL) 所需的时间。如果大鼠默认在 300 秒内检测到平台，则将其引向平台。在这两种情况下，老鼠都被允许在平台上停留 30 秒 [ 54 ]。每天以不同的起点随机顺序对每只大鼠进行四次连续试验，在平台（东）保持静止，如表 1 所示。秒表还用于记录在目标象限 (TSTQ) 中花费的时间。第四次试验结束后，用软布将大鼠擦干，并在家用机箱内的 150 瓦灯泡下保温 [ 54] .

在移除平台的最后一天（第 14 天）的第四次试验后进行 60 秒的探测试验。测量 TSTQ 和在环 (TSA) 中花费的时间，其中所有大鼠在探测试验中从同一起点（西）开始 [ 55 ]。

第一天_

第二天__

第3天

第4天

第5天

第6天

第7天

第一季度

第二季度

第三季度

第四季度

第一季度

第二季度

第三季度

第二季度

第三季度

第四季度

第一季度

第二季度

第三季度

第四季度

第三季度

第四季度

第一季度

第二季度

第三季度

第四季度

第一季度

第四季度

第一季度

第二季度

第三季度

第四季度

第一季度

第二季度

表 1。WMM测试研究期间的试验顺序。

2.10。生化研究

第15天在轻度麻醉下处死大鼠，收集全脑。将立即收集的全脑置于冰冷的培养皿中清洗，然后迅速从全脑组织中取出小脑，剩余的脑用冰冷的无菌生理盐水（0.9% NaCl）清洗。通过在匀浆器中使用 30 mM 磷酸钠缓冲液 (pH 7.4) 制备 10% 脑匀浆。然后将匀浆在 4˚C 以 20,000 RPM 离心 2 小时以去除细胞碎片，上清液用于进一步研究。通过使用牛血清白蛋白 (BSA) [ 56 ] 测定蛋白质浓度。

2.10.1。过氧化氢酶 (CAT) 活性

CAT 活性通过 Chance 和 Maehly 的方法进行了一些修改[ 57 ]。该试验的反应混合物由 2.5 ml 50 mM pH 值为 5.0 的磷酸盐缓冲液、0.4 ml 5.9 mM H 2 O 2和 0.1 ml 10% 脑匀浆组成。孵育 1 分钟后，通过使用分光光度计在 240 nm 处测定反应混合物的吸光度变化。一个单位的 CAT 活性定义为吸光度变化 0.01 U/min。

2.10.2。超氧化物歧化酶 (SOD) 活性

SOD 活性通过 Kakkar 等人 [ 58 ] 的方法进行评估。该测试的反应混合物由 0.1 ml 186 μM 吩嗪甲基硫酸盐、1.2 ml 0.052 mM pH 7.0 焦磷酸钠缓冲液和 0.3 ml 离心后的上清液组成（1500 × g，10 分钟，然后是 10,000 × g，15 分钟） 10% 脑匀浆。为了开始酶反应，将 0.2 ml 780 μM NADH 添加到反应混合物中。孵育 1 分钟后，加入 1 ml 冰醋酸终止酶反应。通过使用分光光度计在 560 nm 处测定反应混合物的吸光度变化，并以 U/mg 蛋白质表示。

2.10.3。谷胱甘肽还原酶 (GSR) 活性

GSR 活性通过 Carlberg 和 Mannervik [ 59 ] 的方法进行评估。该试验的反应混合物由 1.65 ml 0.1 M 磷酸盐缓冲液（pH 7.6）、0.1 ml 0.5 mM EDTA、0.1 ml 0.1 mM NADPH、0.05 ml 1 mM 氧化 GSH 和 0.1 ml 10% 脑匀浆组成。使用分光光度计在 340 nM 下测定反应混合物的吸光度变化，即 NADPH 在 25˚C 的消失，并使用 6.22 × 10 3 M -1 cm的摩尔消光系数表示为 nM NADPH 氧化/min/mg 蛋白质-1。

2.10.4。谷胱甘肽-S-转移酶 (GST) 活性

通过 Habig 等人 [ 60 ] 的方法评估 GST 活动。用于该测试的反应混合物由 1.475 ml 0.1 M pH 为 6.5 的磷酸盐缓冲液、0.025 ml 1 mM CDNB、0.2 ml 1 mM 还原型 GSH 和 0.3 ml 10% 脑匀浆组成。通过使用分光光度计在340 nm处测定反应混合物的吸光度变化，并使用9.6×10 3 M -1 cm -1的摩尔消光系数表示为形成的nM CDNB缀合物/min/mg蛋白质。

2.10.5。谷胱甘肽 (GSH) 活性降低

通过 Jollow 等人 [ 61 ] 的方法评估 GSH 活性。对于该试验，用 1.0 ml 4% 磺基水杨酸沉淀 1.0 ml 10% 脑匀浆。样品在 4°C 下保存 1 小时，然后在 4°C 下离心（1200 × g 20 分钟）。该测试的反应混合物为3.0 ml，包含0.1 ml过滤的等分试样、2.7 ml 0.1 M pH 7.4的磷酸盐缓冲液和0.2 ml 100 mM DTNB。混合物呈黄色显色，反应混合物的吸光度通过使用分光光度计在 412 nm 处测定并表示为 μM GSH/g 蛋白质。

2.10.6。谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px) 活性

GSH-Px 活性通过 Mohandas 等人 [ 62 ] 的方法进行评估。该测试的反应混合物由 1.49 ml 0.1 M 磷酸盐缓冲液（pH 7.4）、0.1 ml 1 mM 叠氮化钠、0.05 ml 1 IU/ml 谷胱甘肽还原酶、0.05 ml 1 mM GSH、0.1 ml 1 mM EDTA、0.1 ml 0.2 mM NADPH、0.01 ml 0.25 mM H 2 O 2和 0.1 ml 10% 脑匀浆。通过使用分光光度计在 340 nm 处测定反应混合物的吸光度变化，即 NADPH 在 25°C 的消失，并使用 6.22 × 10 3 M -1 cm的摩尔消光系数表示为 nMNADPH 氧化/min/mg 蛋白质- 1 .

2.10.7。脂质过氧化 (TBARS) 活性

TBARS 活性通过 Iqbal 等人的方法评估，[ 63] . 用于该试验的反应混合物由 0.58 ml 0.1 M pH 值为 7.4 的磷酸盐缓冲液、0.2 ml 100 mM 抗坏血酸、0.02 ml 100 mM 氯化铁和 0.2 ml 10% 脑匀浆组成。将反应混合物在摇动水浴中于 37°C 温育 1 小时。然后加入 1.0 ml 10% TCA 以终止反应。添加 1.0 ml 0.67% TBA 后，将所有试管在水浴中煮沸 20 分钟。然后在离心前将试管转移到碎冰浴中（2500 × g 10 分钟）。通过使用分光光度计在 535 nm 处对试剂空白测量上清液的光密度来评估每个样品中形成的 TBARS 的量，并在 37°C 下使用 1.56 的摩尔消光系数表示为 nM TBARS/min/mg 蛋白质× 10 5米-1厘米-1。

2.10.8。乙酰胆碱酯酶 (AChE) 活性

通过 Ellman 等人 [ 64 ] 的方法评估 AChE 活性。对于该测试，在 96 孔板中加入 25 μl 15 mM ATCI、75 μl 3 mM DTNB 和 75 μl 50 mM Tris-HCl，pH 8.0，含有 0.1% BSA，并在 25°C 下孵育 5 分钟. 然后使用分光光度计在 405 nm 处测定吸光度。通过在添加酶之前减去反应速率来调整由于底物的常规水解引起的吸光度的任何增加。然后加入 25 μl 10% 脑匀浆，在 25°C 孵育 5 分钟后再次测定吸光度，并以 M/min/g 蛋白表示。

2.11。统计分析

所有结果均表示为平均值±SEM，并使用单因素方差分析（ANOVA）进行分析。对于行为研究，进行了 Tukey 的事后检验，在生化研究的情况下，最小显着性差异 (LSD) 是使用 0.05% 和 0.01% 的概率水平的组间比较的事后检验来确定的。使用 SPSS 14.0 (Chicago, IL, USA) 和 MS Excel 2010 (Roselle, IL, USA) 进行统计和图形分析。对于疾病控制组和对照组，结果被认为具有统计学意义，P < 0.05。

3. 结果

3.1。急性毒性的测定

在观察期间，没有报告任何行为、运动和神经元功能的变化和死亡率，并且对大鼠的皮肤、皮毛和眼睛的监测保持不变，因此提取物被认为是安全的。

3.2. MEPA对EPM试验大鼠ITL和RTL的神经保护作用

EPM测试用于检查MEPA的空间长期记忆改善能力。ITL在第 6天和第13天测量，RTL 分别在第 7天和第14天测量。除东莨菪碱治疗组外，所有治疗组的大鼠在第 7 天和第 14 天的 RTL 均低于图1中相同组的第 6天和第13天的ITR. 在多奈哌齐治疗大鼠的情况下，与疾病对照组和对照组相比，RTL 值显着降低（P < 0.05）。与疾病对照组和对照组相比，给予 MEPA 显着降低大鼠的 RTL（P < 0.05，P < 0.01；P < 0.01）。

3.3. MEPA对大鼠TL和STL的神经保护作用采用PA试验

PA测试用于检查MEPA的情绪长期记忆增加作用。TL分别在第6天和第13天测量，STL分别在第7天和第14天测量。除东莨菪碱治疗组外，所有治疗组在第 7 天和第 14 天的 STL 显着增加，与图2中指定的同一组的第6 天和第13天 TL 相比. 与疾病对照组和对照组相比，多奈哌齐治疗大鼠的 STL 值显着增加（P < 0.01；P < 0.05，P < 0.01）。与疾病对照组和对照组相比，用 MEPA 治疗的大鼠显着（P < 0.05，P < 0.001；P < 0.05，P < 0.01）增加了 STL。

3.4. MEPA对大鼠DI的神经保护作用NOR试验

NOR测试用于确定MEPA的对象识别记忆增强活性。测试阶段的 DI 分别在第 7天和第14天测量。与疾病对照组和对照组相比，MEPA 的给药显着（P < 0.01，P < 0.001；P < 0.01）增加了大鼠的 DI。事实上，除东莨菪碱治疗组外，所有治疗组均显示 DI 增加。与疾病对照组和对照组相比，用多奈哌齐治疗的大鼠的 DI 显着增加（P < 0.05；P < 0.05，P < 0.01）（图 3）。

3.5. MWM试验MEPA对大鼠EL、TSTQ和TSA的神经保护作用

MWM用于检验MEPA的空间学习和记忆升级潜力。采集试验的 EL 和 TSTQ 在第 7天和第14天测量。除了分别在图 4和图 5中给出的东莨菪碱治疗组之外，所有治疗组的大鼠在各天的 EL 显着降低和 TSTQ 升高。与疾病相比，多奈哌齐治疗组的 EL 显着降低（P < 0.01），TSTQ 显着升高（P < 0.05，P < 0.01；P < 0.05）

(一)(二)

图 1。MEPA对EPM试验大鼠ITL和RTL的神经保护作用。表示的值是平均值±SEM（n = 6/组）。(a) ITL 和 RTL 分别在第 6天和第7天；(b) ITL 和 RTL 分别在第 13天和第14天。+ P < 0.05， ++ P < 0.01 与疾病对照组有显着差异。* P < 0.05, ** P < 0.01 与对照组有显着差异。

对照组和对照组进行采集试验。MEPA 给药显着（P < 0.05，P < 0.01；P < 0.01）降低 EL，显着（P < 0.01，P < 0.001；P < 0.05，P < 0.01）增加大鼠疾病控制和控制的 TSTQ团体。与 MEPA 给药第14 天探查试验的采集试验相似，显着（P < 0.05，P < 0.01；P < 0.05，P < 0.01）增加 TSTQ 并显着（P < 0.05，P < 0.01；P < 0.05，P < 0.01) 与疾病对照组和对照组相比，大鼠的 TSA 增加，因此显示出空间学习和记忆的显着改善，如图 6所示。

3.6. MEPA对大鼠脑氧化状态的神经保护作用

在表2中给出的大鼠脑组织匀浆中测定脑抗氧化酶和丙二醛水平。大鼠的 CAT、SOD、GSR GST、GSH、GSH-Px 活性升高，而降低

(一)(二)

图 2。MEPA对大鼠TL和STL的神经保护作用采用PA试验。表示的值是平均值±SEM（n = 6/组）。(a) TL 和 STL 分别在第 6天和第7天；(b) TL 和 STL 分别在第 13天和第14天。+ P < 0.05, ++ P < 0.01, +++ P < 0.001 与疾病对照组有显着差异。* P < 0.05, ** P < 0.01 与对照组有显着差异。

在除东莨菪碱处理组之外的所有组中的 TBARS 活性。施用 MEPA 显着增加了 CAT、SOD、GSR、GST、GSH、GSH-Px 的浓度（P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001；P < 0.05，P < 0.01）并且显着（P < 0.01；P < 0.01, P < 0.001) 将 TBARS 降低至疾病对照组和对照组。多奈西匹给药显着（P < 0.05，P < 0.01；P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001）增加了 CAT、SOD、GSR、GST、GSH、GSH-Px 的浓度，并且显着（P < 0.01）降低了 TBARS与疾病对照组和对照组相比。

3.7. MEPA对大鼠脑内乙酰胆碱酯酶活性的神经保护作用

在大鼠脑匀浆中测量 AChE 的水平，作为中枢胆碱能状态的标志，这是保持典型认知功能所必需的。与对照组相比，东莨菪碱治疗显着增加了脑 AChE 水平。MEPA 给药显着（P < 0.01, P < 0.001; P < 0.05,

图 3。使用 NOR 测试的 MEPA 对大鼠 DI 的神经保护作用。表示的值是平均值±SEM（n = 6/组）。+ P < 0.05, ++ P < 0.01, +++ P < 0.001 与疾病对照组有显着差异。* P < 0.05, ** P < 0.01 与对照组有显着差异。

图 4。MEPA 对大鼠 EL 的神经保护作用，用于使用 MWM 测试进行的采集试验。表示的值是平均值±SEM（n = 6/组）。+ P < 0.05, ++ P < 0.01 与疾病对照组差异显着** P < 0.01 与对照组差异显着。

P < 0.01, P < 0.001) 与疾病对照组和对照组相比，降低了大鼠脑组织中的 AChE 活性。与表 3中所示的相应疾病对照组和对照组相比，标准药物多奈哌齐治疗显着 (P < 0.01) 抑制了脑 AChE 水平。

4。讨论

药用植物是治疗无数大病和小病的植物化学物质的仓库。如前所述[ 65 ]，药用植物的植物成分在治疗神经退行性病变尤其是 AD 中起着至关重要的作用。东莨菪碱诱导的痴呆和氧化应激动物模型被广泛用作

图 5。MEPA 对大鼠 TSTQ 的神经保护作用，用于使用 MWM 测试进行的采集试验。表示的值是平均值±SEM（n = 6/组）。+ P < 0.05, ++ P < 0.01, +++ P < 0.001 与疾病对照组有显着差异。* P < 0.05, ** P < 0.01 与对照组有显着差异。

用于确定未知植物或药物的抗阿尔茨海默病作用的初步筛选试验 [ 66 ]。在这项研究中，MEPA 给药第 14天通过改善大鼠的各种类型的记忆、学习、抗氧化酶和抗乙酰胆碱酯酶活性，显示出显着的神经保护作用。这是第一项通过各种行为和生化研究显示 MEPA 在大鼠中的神经保护活性的研究。

空间长期记忆通过 EPM 测试评估，其中测量的参数是 ITL 和 RTL。在该测试中大鼠从张开臂移动到闭合臂所花费的时间被记录为ITL。在 ITL 24 小时后，学习任务的保留被研究为 RTL。在该试验中， ILT后第 6天和第13天的RTL分别在第 7天和第14天下降，表明与疾病对照组和对照组相比，大鼠的空间长期记忆有所改善。Swaroop 等人在对黄檀叶提取物在 3-硝基丙酸诱导的大鼠神经毒性中的神经保护评估的研究中报道了类似的发现 [ 67] . 通过PA测试评估厌恶刺激后大鼠的情绪记忆，其中测量参数为TL和STL。在该测试中，在第 6天和第13天的 TL 后第 7 天和第 14 天的STL增加分别表明与疾病对照组和对照组相比，大鼠的学习和记忆力有所改善。在对小鼠 Elephantopus scaber 的研究中，Sagar 等人也报道了 STL 的增加 [ 68 ]。通过NOR测试评估大鼠的识别记忆，其中测量参数为DI。在这个测试中，一个

第6天和第13天训练后第7天和第14天的DI增加分别表明与疾病对照组和对照组相比大鼠的识别记忆有所改善。Wang 等人在研究木通对东莨菪碱诱导的痴呆动物模型中学习和记忆障碍的影响时，报告了相同的后果 [ 69 ]。MWM测试评估大鼠的空间学习和记忆能力，测量参数为EL、TSTQ和TSA。在这个采集试验测试中，第 7 天和第 14 天的 EL 降低和 TSTQ 增加，而对于探测试验，第14天TSTQ和 TSA 增加天表明与疾病对照组和对照组相比，大鼠的空间学习和记忆有所改善。Weon 等人 [ 39 ] 在关于寄生植物对东莨菪碱引起的小鼠记忆障碍影响的研究中报告了几乎相同的结果。

为了保护细胞成分免受氧化应激，CAT 和 SOD 具有重要作用。CAT 是一种非常重要的酶，可以保护细胞免受 ROS 的氧化损伤。它将破坏性的过氧化氢转化为反应性较低的水和分子氧 [ 70 ]。超氧化物是细胞中主要的活性氧物质之一。SOD 导致超氧化物 (O 2- ) 自由基分解成破坏性较小的过氧化氢 (H 2 O 2 ) 和分子氧 (O 2 )。因此，SOD 起着关键的抗氧化作用 [ 71] . 谷胱甘肽通过与自由基、过氧化物、脂质过氧化物和重金属等 ROS 反应，在维持人体细胞正常功能和防止氧化应激方面发挥关键作用。GSR 将谷胱甘肽二硫化物 (GSSG) 转化为还原

(一)(二)

图 6。MEPA对大鼠TSTQ和TSA的神经保护作用，用于MWM试验的探测试验。表示的值是平均值±SEM（n = 6/组）。(a)第14 天的 TSTQ；(b) 第 14天的 TSA 。+ P < 0.05， ++ P < 0.01 与疾病对照组有显着差异。* P < 0.05, ** P < 0.01 与对照组有显着差异。

治疗

猫

(U/分钟)

SOD (U/mg 蛋白质)

GSR (nM/min/mg 蛋白质)

GST (nM/min/mg 蛋白质)

GSH (μM/g 蛋白质)

GSH-Px (nM/min/mg 蛋白质)

TBARS (nM/min/mg 蛋白质)

骗局

10.17±0.68

9.57±0.22

156.72 ± 6.28

119 ± 7.42

62.79 ± 8.95

37.92 ± 3.85

210.54 ± 8.82

斯科

7.68 ± 1.32

8.05 ± 1.54

96.18 ± 4.25

76.64 ± 5.75

37.89 ± 5.75

18.09 ± 1.75

268.15 ± 9.24

大学教师

18.32 ± 0.47++**

22.5±0.65

286.68 ± 3.89++**

195.56 ± 8.76+*

125.78 ± 10.74++**

93.48 ± 1.02

105.63 ± 10.18++**

环保局 100

12.05 ± 0.79

13.03 ± 1.21+*

195.17 ± 6.81

138.00 ± 6.84

78.93 ± 7.49++*

48.63 ± 2.89+

180.86 ± 2.96

环保部 200

14.06±0.65++

16.75 ± 1.07++**

219 ± 4.07

156.76 ± 7.69++**

89.26 ± 6.76++**

68.08 ± 1.13+**

157.18 ± 7.56++***

斯科 + MEPA 100

9.54 ± 0.46++*

8.95 ± 1.18

123.85 ± 7.17

93.95 ± 4.94+

52.65 ± 5.76

26.58 ± 5.84+*

229.49 ± 5.15

斯科 + MEPA 200

10.95 ± 1.23

11.05 ± 0.65+*

172 ± 5.25++**

128.09 ± 5.57

70.76 ± 11.97

41.28 ± 0.95+++**

195.48 ± 6.09++**

斯科+唐

13.95 ± 0.48+*

15.26 ± 1.02++**

236.95 ± 8.02

178.25± 10.97

98.25 ± 10.67**

72.54 ± 1.09++***

136.28 ± 7.65

表 2。MEPA对大鼠脑抗氧化防御系统生化参数的神经保护作用。

大鼠脑生化参数表示为平均值±SEM 值（n = 6/组）。+ P < 0.05, ++ P < 0.01, +++ P < 0.001 与疾病对照组有显着差异。* P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 与对照组有显着差异。

治疗

AChE (M/min/g 蛋白质)

骗局

0.182 ± 0.003

斯科

0.245 ± 0.002

大学教师

0.045 ± 0.001++**

环保局 100

0.134 ± 0.005**

环保部 200

0.115 ± 0.005++**

斯科 + MEPA 100

0.201 ± 0.003*

斯科 + MEPA 200

0.149 ± 0.004+++***

斯科+唐

0.087 ± 0.030

表 3。MEPA对大鼠脑中AChE活性的神经保护作用。

每组的 AChE 活性表示为平均值 ± SEM 值（n = 6/组）。++ P < 0.01，+++ P < 0.001 与疾病对照组有显着差异。* P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 与对照组有显着差异。

谷胱甘肽 (GSH) 反过来有助于 GSH-Px 减少 H 2 O 2 [ 72 ]。GST 催化谷胱甘肽 (GSH) 与具有亲电官能团的底物的亲核加成。它主要参与内源性和外源性烷化剂的解毒，从而防止它们与蛋白质和核酸等基本细胞成分相互作用 [ 73 ]。GSH 通过提供相当于 ROS 的还原当量以及其他不稳定分子来发挥抗氧化作用。通过提供一个电子，谷胱甘肽变得具有反应性，但很容易与另一个谷胱甘肽分子反应生成谷胱甘肽二硫化物 (GSSG) [ 74] . GSH-Px的主要生物学作用是保护生物体免受H 2 O 2的氧化损伤。它将脂质氢过氧化物转化为相应的醇，并将游离 H 2 O 2还原为 H 2 O（水）[ 75 ]。中枢神经系统 (CNS) 由于高水平的多不饱和脂肪酸 (PUFA)、高耗氧量、高水平的氧化还原过渡金属和如前所述的大脑抗氧化防御能力差，对氧化应激高度敏感。不同大脑区域的几位研究人员表明，中枢神经系统是脂质过氧化过程的主要目标 [ 76] . 事实上，在神经退行性疾病的发病机制中，特别是 AD 自由基介导的脂质过氧化作为触发因素 [ 77 ]。在本研究中，东莨菪碱处理后的大鼠大脑抗氧化酶如 CAT、SOD、GSR、GST GSH、GSH-Px 显着降低，TBARS 脑水平升高，TBARS 是脂质过氧化和自由基的量度一代。目前的研究表明，MEPA 的施用显着增加了脑抗氧化酶的水平并降低了 TBARS 的水平。Khan 表明，在大鼠中施用 Launaea procumbens 甲醇提取物可提高大鼠脑抗氧化酶和认知能力 [ 78] . 兴奋性神经递质，ACh 对神经元交流更为专横。AChE 酶负责 ACh 的降解，这种降解酶的水平在阿尔茨海默病患者中较高 [ 79 ]。这项研究的结果表明，东莨菪碱注射组的 AChE 活性增加，而 MEPA 组的活性显着降低。在 Uddin 等人关于松黄桃对大鼠脑抗氧化标志物、认知能力和 AChE 活性的影响的研究中，表明这种植物提取物具有潜在的促智活性 [ 80 ]。

我们的研究结果表明，与疾病对照组和对照组相比，MEPA 对大鼠的神经保护作用更佳。上述行为和生化结果表明 MEPA 具有改变 AD 发展和进展的能力。

5. 结论

本研究清楚地表明，MEPA 果实通过改善学习、记忆、抗氧化能力和抗乙酰胆碱酯酶活性，显着减轻东莨菪碱诱导的痴呆和氧化应激。因此，这种水果提取物可以成为控制神经退行性痴呆特别是 AD 的潜在新治疗策略。然而，需要进一步研究来表征活性化合物并揭示可能的作用机制。

致谢

作者感谢孟加拉国达卡东南大学药学系提供财政支持和研究设施。

道德批准

研究方案经孟加拉国达卡东南大学药学系伦理委员会批准。根据实验动物护理原则（NIH 出版物第 85-23 号，1985 年修订）对动物进行护理和使用。

作者的贡献

这项工作是在所有作者的合作下进行的。MSU、AAM、MSA 和 MA 进行了实验室实验并准备了手稿。AAN、MSH 和 JS 有助于数据的统计分析和解释。MJU 修改了最终手稿。MA设计并监督了这项研究。所有作者阅读并认可的终稿。

利益冲突

作者声明与文章内容没有利益冲突。

缩写

AD：阿尔茨海默病；

PA：叶下珠；

MEPA：Phyllanthus acidus 的甲醇提取物；

EPM：高架加迷宫；

PA：被动回避；

NOR：新物体识别；

MWM：莫里斯水迷宫；

SOD：超氧化物歧化酶；

CAT：过氧化氢酶；

GSR：谷胱甘肽还原酶；

GST：谷胱甘肽-S-转移酶；

GSH：还原型谷胱甘肽；

GSH-Px：谷胱甘肽过氧化物酶；

TBARS：硫代巴比妥酸活性物质；

ACh：乙酰胆碱；

AChE：乙酰胆碱酯酶；

ITL：初始传输延迟，

RTL：保留传输延迟；

TL：传输延迟；

STL：逐步延迟；

EL：逃逸延迟；

TSTQ：在目标象限中花费的时间；

TSA：在环中花费的时间；

DI：辨别指数；

Aβ：淀粉样蛋白-β；

NFT：神经原纤维缠结；

ROS：活性氧；

ATCI：乙酰硫代胆碱碘化物；

DTNB：5,5-二硫代双-2-硝基苯甲酸根离子；

Tris-HCl：三法氨基甲烷盐酸盐；

BSA：牛血清白蛋白；

GSH：谷胱甘肽；

EDTA：乙二胺四乙酸；

NADPH：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；

CDNB：1-氯-2,4-二硝基苯；

TCA：三氯乙酸；

TBA：硫代巴比妥酸。

笔记

*通讯作者。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

参考

[ 1 ] Sternberg, RJ 和 Pretz, JE (2005) 认知和智力：识别心灵的机制。剑桥大学出版社，纽约。

[ 2 ] Selnes, OA 和 Vinters, HV (2006) 血管认知障碍。Nature Clinical Practice Neurology, 2, 538-547. http://dx.doi.org/10.1038/ncpneuro0294

[ 3 ] Sosa, A.、Albanese, E.、Stephan, BCM、Dewey, M.、Acosta, D.、Ferri, CP 等。(2012) 拉丁美洲、中国和印度轻度认知障碍的流行、分布和影响：基于 10/66 人口的研究。PLoS 医学，9，1-11。

[ 4 ] Querfurth, HW 和 LaFerla, FM (2010) 阿尔茨海默病。新英格兰医学杂志，362, 329-344。

[ 5 ] Wimo, A.、Winblad, B.、Aguero-Torres, H. 和 von Strauss, E. (2003) 世界上痴呆症发生的程度。阿尔茨海默病及相关疾病，17, 63-67。

[ 6 ] Asaduzzaman, M., Uddin, MJ, Kader, MA, Alam, AHMK, Rahman, AA 和 Rashid, M. (2014) 体外乙酰胆碱酯酶抑制活性和 Aegle marmelos 叶提取物的抗氧化特性：对治疗阿尔茨海默病的意义. 老年精神科，14、1-10。

[ 7 ] Chang, YT, Chang, WN, Tsai, NW, Huang, CC, Kung, CT 和 Su, YJ (2014) 氧化应激和抗氧化生物标志物在阿尔茨海默病中的作用：系统评价。国际生物医学研究，2014，1-11。

[ 8 ] Oh, JH, Choi, BJ, Chang, MS 和 Park, SK (2009) Nelumbo nucifera Semen Extract 通过诱导胆碱乙酰转移酶表达改善东莨菪碱诱导的失忆症大鼠的记忆力。神经科学快报，461、41-44。

[ 9 ] Fan，Y.，Hu，J.，Li，J.，Yang，Z.，Xin，X.，Wang，J.，等。(2005) 酸性寡糖糖链对东莨菪碱诱导的大鼠记忆障碍的影响及其相关机制。神经科学快报，374，222-226。

[ 10 ] El-Sherbiny, DA, Khalifa, AE, Attia, AS 和 Eldenshary, ES (2003) Hypericum perforatum Extract 证明了对因失忆剂量的东莨菪碱引起的大鼠脑氧化状态升高的抗氧化特性。药理学生物化学和行为，76，525-533。

[ 11 ] Jeong, EJ, Lee, KY, Kim, SH, Sung, SH 和 Kim, YC (2008) 东莨菪碱处理小鼠中玄参环烯醚萜苷的认知增强和抗氧化活性。欧洲药理学杂志，588, 78-84。

[ 12 ] Sultana, R. 和 Butterfield, DA (2010) 氧化应激在阿尔茨海默病进展中的作用。阿尔茨海默病杂志，19，341-353。

[ 13 ] Hossain，MS，Asaduzzaman，M.，Uddin，MS，Noor，MAA，Rahman，MA 和 Munira，MS（2015 年）研究矢状叶黄花叶的体外抗氧化和细胞毒性活性。印美药物研究杂志，5，3300。

[ 14 ] Kuhla, B., Haase, C., Flach, K., Luth, HJ, Arendt, T. 和 Munch, G. (2007) 脂质过氧化和高级糖基化终产物前体对 Tau 聚集的伪磷酸化和交联的影响和细丝的形成。生物化学杂志，282, 6984-6991。

[ 15 ] Zimmerman, G. 和 Soreq, H. (2006) 终止和超越：乙酰胆碱酯酶作为突触传递的调节剂。细胞和组织研究，326、655-669。

[ 16 ] Lane, RM, Potkin, SG 和 Enz, A. (2006) 针对痴呆症中的乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶。国际神经精神药理学杂志，9, 101-124。