皮肤抑制素B2体外抗横纹肌肉瘤RD细胞增殖活性及抗增殖、血管生成和转移基因的下调

摘要：背景：横纹肌肉瘤 (RMS) 是儿童中最常见的软组织肉瘤，约占小儿肉瘤的 50%，可以在身体的任何部位发展，但在四肢更常见。目的：评价Dermaseptin B2 对横纹肌肉瘤 RD (CCL-136TM) 细胞的体外抗增殖活性及其对MYC、FGFR1、NOTCH1和 CXCR7 基因表达的影响，这些基因涉及增殖、血管生成和转移等过程。方法：RD 细胞在添加了 10% 胎牛血清的 Dulbecco's Modified Eagle's 培养基中生长。用 Dermaseptin B2 处理指数生长的细胞，并在三个时间点使用刃天青和迁移测定法测定抗增殖活性。为了确定MYC、NOTCH1、FGFR1和CXCR7的基因表达谱，从细胞中提取总 RNA 并以β-肌动蛋白作为参考基因进行 q-RT-PCR。结果： Dermaseptin B2 以时间和浓度依赖性方式抑制 RD 细胞的增殖，IC 50值为 7.679 微米，7.235 微米，5.993 微米。二维伤口愈合测定显示在 6、24、48 和 72 小时的时间点抑制 RD 细胞的迁移和运动，在 72 小时观察到最大的抑制。Dermaseptin B2 下调目标MYC (fc; 1.5013, 1.5185, 2.4144), CXCR7 (fc; 2.8818, 4.4430, 3.9924), FGFR1 (fc; 2.3515, 2.0809, 2.2543), NOTCH1 (fc; 2.46.23, 526) 基因。分别为三个时间点。与MYC和FGFR1相比， NOTCH1和CXCR7对β-肌动蛋白的倍数变化更高。结论：这项研究的结果表明，Dermaseptin B2是信号通路的靶分子，包括 PI3K/AKT、RTK 和 NOTCH 通路，可以影响这些基因的转录和整体抑制癌症进展。需要进一步研究以更好地了解 Dermaseptin B2 肽的详细作用机制以及体内作用。

关键词

Dermaseptin B2 ,阿霉素, RMS ,血管 生成,转移

一、简介

横纹肌肉瘤 (RMS) 是儿童中最常见的软组织肉瘤 [ 1 ] [ 2 ]，约占小儿肉瘤的 50% [ 1 ] [ 3 ] [ 4 ]，它可以在身体的任何部位发展，但更常见于四肢[ 5 ]。横纹肌肉瘤是一种侵袭性肿瘤，经典起源于骨骼肌祖细胞 [ 3 ] [ 6 ]，占儿童癌症的 4% - 5%，每百万人中 20 岁以下的发病率为 4.5% [ 7 ] [ 8 ] . RMS 有六种组织学亚型 [ 8 ] [ 9]，主要亚型为肺泡型和胚胎型 [ 2 ] [ 10 ] [ 11 ] [ 12 ]。胚胎性横纹肌肉瘤 (ERMS) 约占病例的 80% [ 7 ]，在 10 岁以下的儿童中更为普遍 [ 13 ] [ 14 ]，预后较好，无事件生存率为 81% [ 7 ] [ 13 ] [ 15 ]。它与染色体 11p15 基因座 [ 7 ] 的明显遗传改变和杂合性丧失有关，并具有MYCN扩增和胰岛素受体损伤 [ 16 ]，TP53 突变和FGFR4 [ 15 ]。

MYC原癌基因参与许多细胞过程，包括细胞增殖、分化和凋亡 [ 17 ]。它是最常见的原癌基因，在 40% 的众多人类癌症中被扩增 [ 18 ] [ 19 ]。Missiaglia等人。(2009) 报道了ERMS (RD) 细胞和其他原发性肿瘤中致癌基因MYC的高扩增和过表达 [ 20 ]。MYC的靶向和抑制也已被证明可以减少 RMS 和肌原性分化的进展和致瘤性 [ 21 ]，表明MYC作为横纹肌肉瘤治疗的潜在靶点。尽管MYC通过各种信号通路（如 WNT、Hedgehog 和受体酪氨酸激酶）在正常细胞中受到严格调节，这些通路的组成型激活导致癌细胞中的MYC激活 [ 22 ] [ 23 ]。PI3K 耐药性也与MYC扩增有关，说​​明该基因是 PI3K 的下游肿瘤发生 [ 22 ]。抑制MYC表达、中断Myc -Max二聚化和Myc - Max与 DNA 结合的最终改变对于阻碍目标MYC基因至关重要[ 18 ]。

Notch 信号通路涉及细胞命运的调节和确定，在人类癌症中失调 [ 24 ]。该途径可以通过使用小分子抑制剂抑制缺口受体来靶向 [ 25 ]。酶，γ-分泌酶导致 Notch 细胞间结构域的增加和 Notch 通路的过度激活，随后是细胞核中的转录激活 [ 26 ]。别利亚等人。(2011) 表明使用 Notch1 RNAi 或 Ƴ-分泌酶小分子抑制剂可减少体外ERMS 的生长[ 25 ]。Roma等人的一项研究。(2011) 显示融合阳性 (FP) 和融合阴性 (FN) RMS 中的 Notch 通路上调，在 Notch 通路激活时 RMS 细胞的侵袭性和运动性之间存在显着相关性 [ 27 ]。在体外模型中，γ-分泌酶抑制也会降低细胞的运动性和侵袭性[ 27 ]。此外，NOTCH1显示通过SNAIL1转录因子的上调导致胚胎 RMS 斑马鱼模型中的肿瘤增殖，最终导致胚胎 RMS 细胞去分化 [ 28 ]。该研究还表明了NOTCH1 / SNAIL1 / MEF2C的可能作用胚胎 RMS 转移能力中的通路 [ 28 ]。可以抑制该途径的新化合物将形成有希望的治疗剂来治疗转移性癌症 [ 29 ]。

成纤维细胞生长因子受体 (FGFR) 属于一种信号通路，它参与多种生物过程，包括生长、存活、分化、血管生成、肿瘤生长和发育 [ 30 ] [ 31 ]。了解成纤维细胞生长因子受体家族在癌症发展中的不同作用将阐明该途径作为癌症治疗的潜在靶标和开发新靶标疗法的重要性 [ 32 ]。穆伦等人。(2021) 报告称，25% 的激素受体阳性 (HR+) 乳腺癌患者存在FGFR1扩增或过表达[ 33 ]。研究报告了成纤维细胞生长因子受体 1 的作用（FGFR1 ) 在乳腺癌的肿瘤发生和乳腺发育中的作用 [ 34 ] [ 35 ]。此外，该因子 ( FGFR1 ) 的扩增和过表达与乳腺癌预后不良有关，可作为预后不良的预测因子 [ 36 ] [ 37 ]。据报道，FGFR1在 RMS [ 32 ] 中过度表达。Missiaglia等人的一项研究。(2009) 证实了FGFR1的扩增和增益及其在 RMS 细胞中的过表达，胚胎型的表达高于肺泡亚型 [ 20 ]。戈德斯坦等人。(2007) 报道RMS 细胞中的FGFR1过表达，启动子区域低甲基化 [ 38 ]。这些数据表明FGFR1作为 RMS 的潜在治疗靶点，并寻找可以特异性靶向该基因及其途径的治疗化合物 [ 38 ]。最近的报告显示了对化疗的耐药性与 FGF/FGFR 信号传导之间的相关性，并强调了靶向该信号传导途径的药物作为癌症治疗的潜力 [ 39 ]。

趋化因子CXCR7是一种七跨膜受体，被重新命名为ACKR3，因为它是非典型趋化因子受体家族 (ACKR) [ 40 ] 的成员。CXCR7的过表达被证明在癌症的血管生成过程中很重要，这表明它在肿瘤进展中的作用及其在血管生成过程中的调节活性 [ 40 ]。盛等人。(2010) 显示了CXCR7在血管内皮增殖、迁移和产生血管内皮生长因子中的作用，这些生长因子通过介导血管生成来增强肿瘤传播 [ 41 ]。已显示胚胎 RMS 细胞高度表达CXCR7趋化因子 [ 42 ]。据报道，这种趋化因子对基质衍生因子 (SDF)-1 也称为 CXCL12 的刺激有反应，导致 MAPK 和 AKT 通路的最终激活。这种激活与 RMS 细胞的运动有关，而不是与增殖和存活有关 [ 43 ]。有重点关注作为 CXCR7 拮抗剂的小分子，它们表现出不同的亲和力 [ 40 ]。同时阻断 CXCR7 和 CXCR4 也代表了治疗方法，因为它们都涉及癌症恶性肿瘤 [ 44 ]。

化疗、手术、放疗及其组合是癌症的标准治疗方法。然而，这些都与局限性有关，包括缺乏特异性、毒性和耐药性的发展 [ 45 ]。因此，需要寻找具有较小抗药性发展趋势并精确靶向癌细胞的替代治疗剂[ 23 ]。最近，人们越来越关注抗菌肽 (AMP) 作为治疗药物的来源，这种药物具有低耐药性、更高的疗效和对细胞的毒性更小 [ 46 ] [ 47 ] [ 48 ]。抗菌肽 (AMP) 是短的阳离子肽，本质上是两亲性的 [ 49 ] [50 ]，具有多种氨基酸和二级结构 [ 51 ]。最近的研究表明，抗菌肽通过两种机制杀死癌细胞；膜破裂导致坏死 [ 52 ] [ 53 ]，诱导细胞凋亡，这是由于它们与线粒体膜的结合 [ 54 ] [ 55 ]。帕波等人。(2004) 表明 DK 6 L 9肽（15-mer D,L-氨基酸肽）在瘤内注射后抑制前列腺腺癌细胞的增殖，对非恶性细胞没有活性 [ 56]。这种肽的系统给药也抑制了原发性和转移性肿瘤的生长[ 57 ]。Dermaseptin B2 [ 58 ] 是一种 α-螺旋多肽，是 Dermaseptin 家族中最有效的，具有微摩尔范围内的活性 [ 59 ] [ 60 ]。体外研究报告了抗菌肽 Dermaseptin B2 (Drs B2) [ 61 ] 的抗肿瘤和抗血管生成活性。佐格尔等人。(2012) 证明 Drs B2 抑制 PC3 和 MDA-MB231 肿瘤细胞的集落形成、内皮 HUVEC 细胞的增殖和毛细血管形成 [ 62]。后来的这项研究报告了 Drs B2 的坏死效应，而不是凋亡活性，没有激活 caspase-3，也没有改变线粒体电位 [ 62 ]。在目前的研究中，我们研究了 Drs B2 对 RMS (RD) 细胞的抗增殖活性，并通过评估参与细胞增殖 ( MYC )、血管生成 ( FGFR1 、FGFR1 、CXCR7）和转移（NOTCH1，CXCR7）。

2。材料和方法

2.1。化学品和试剂

Dermaseptin B2（Adenoregulin，批号：2020/10/14）、阿霉素（货号：SD9280）和刃天青染料（批号：415E035）购自 Solar Bio（中国北京）。DMEM（批号：RNBH6554）、FBS（批号：BCCB7351）和 PBS（批号：017K8212）购自 Sigma Aldrich。L-谷氨酰胺（批号：2085472）、胰蛋白酶-EDTA（批号：2091549）、青霉素-链霉素（参考号 1514-122）和庆大霉素（批号：2163664）均购自 Gibco (Gibco Biosciences)。所有试剂均为细胞培养级。

2.2. Dermaseptin B2 规格

表 1代表本研究中使用的抗菌肽 Dermaseptin B2 (Drs B2) 的信息。

2.2.1。细胞培养

细胞系 RD (ATCC ® CCL-136) 和 Vero (ATTC CCL-81) 购自美国典型培养物保藏中心 (ATCC)，并如前所述 [ 5 ] [ 63 ] 进行培养。简而言之，将细胞在 37°C 水浴中解冻，用 70% 乙醇消毒，然后小心转移到 T-75 细胞培养瓶和含有 DMEM、10% FBS 和青霉素/链霉素的完整培养基中，并在 37°C、5 % CO 2和 95% 湿度的培养箱。细胞在 80% - 90% 汇合度水平下每 3-4 天传代一次。

2.2.2。使用刃天青还原测定法测定细胞活力

如前所述 [ 64 ] [ 65 ] 进行刃天青还原测定。在 65% - 75% 用胰蛋白酶处理细胞，用血细胞计数器计数并以 1 × 10 4 个细胞/孔的接种密度接种到 96 孔细胞培养板中，并在 37˚C、5% CO 2的培养箱中培养和 95% 的湿度。将先前的培养基从细胞中轻轻取出，并将 100 μL 浓度逐渐增加（3、6、9、12 和 15 μM）的 Drs B2 在完全培养基中一式三份地添加到每个孔中。用作标准对照药物的多柔比星以相同方式制备。然后将板孵育 24、48、72 小时以确定 Drs B2 与多柔比星相比的抗增殖活性。孵育 24、48、72 小时后，加入 20 µL (0.15 mg/mL) 刃天青染料并孵育 4 小时。然后用读板器（Infinite M1000，Tecan）在 570 nm 和 600 nm 的吸光度下读取培养物的光密度。使用公式从 570 nm 和 600 nm 读数的净吸光度计算细胞活力百分比；66 ]。然后将 Drs B2 对细胞增殖的影响以细胞活力百分比图表示

名称 (CRO1001)

Dermaseptin B2 (Drs B2)、腺调节素

UniProt 登录号

P31107 (DRS2_PHYBI)

肽序列

GLWSKIKEVGKEAAKAAAKAAGKAALGAVSEAV-NH2

分子量

3180 道尔顿

生物

Phyllomedusabicolor（双色叶蛙）

表 1。dermaseptin B2（腺调节素）的基本信息。

对数浓度 (µM) 的处理。然后使用GraphPad Prism软件(v8.4.3)中的非线性回归分析计算处理的50％抑制浓度(IC 50 )。

2.2.3。细胞迁移测定

如前所述 [ 67 ] [ 68 ] [ 69 ] 进行二维伤口愈合测定。使用补充有 10% FBS 的 DMEM 在 T-75 细胞培养瓶中培养 RD 细胞。将细胞用胰蛋白酶处理、计数并铺板在12孔板中，细胞密度为5×10 4 个细胞/孔。监测细胞生长直至细胞达到 95% - 100% 融合 [ 68 ]。从培养箱中取出培养板，在生物安全柜中使用无菌条件，使用 200 µL 移液器尖端在细胞单层上形成垂直伤口。然后将细胞碎片连同培养基一起去除，并加入 2 ml 含有预先确定的 IC 50的 Drs B2 和多柔比星的培养基被添加到孔中。将空白（具有 PBS 溶剂的培养基）添加到未处理的细胞中。处理后，在倒置显微镜下观察细胞，拍摄快照照片并标记为时间零。在6、24、48和72小时的时间点，在显微镜下观察细胞并在每个时间点拍照。结果表示为与未处理的对照细胞相比处理对细胞恢复的影响。

2.3. 基因表达分析

2.3.1。RNA提取

在24、48、72小时的时间点用Drs B2和多柔比星的相应计算的IC 50值处理具有70％汇合的指数分裂的RD细胞。使用 DirectZol RNA Miniprep 试剂盒（货号：R2053，Zymo Research，USA）按照制造商的说明进行总 RNA 提取。简而言之，细胞在 TriZol 裂解缓冲液中裂解，加入等体积的乙醇（95% - 100%），并通过加入 Zymo SpinTM 柱进行纯化。然后洗涤细胞并在无 DNase 的水中洗脱 RNA。在 nanodrop 分光光度计 (Thermofisher) 和 1% 琼脂糖凝胶电泳中检查 RNA 的纯度和完整性。

2.3.2. cDNA合成

使用 FIREScript RT cDNA 合成试剂盒（货号：06-15-00050，Solis BioDyne，爱沙尼亚）按照制造商的说明进行 cDNA 合成。20 µL 反应混合物包含 10 µl (500 ng/µl) RNA、1 µl Oligo (dT) 引物 (100 µM)、2 µl 10x RT Reaction Buffer with DTT、0.5 µl dNTP Mix (20 mM)、1 µl FIREScript RT、0.5 µl RNase Inhibitor (40 U/µl) 和 5 µl 无核酸酶水。使用 GeneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystems, USA) 进行逆转录。反应在 55°C 进行 30 分钟，在 85°C 进行酶失活 5 分钟。

2.3.3。引物设计和优化

本研究中使用的引物是使用国家生物技术信息中心 (NCBI) 的 Primer Blast 工具 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast 设计的。基因的参考序列以 FASTA 格式从 GenBank 中检索出来，并用于设计正向和反向引物的各个序列。目标范围为 70 - 300 bps、40% - 60% GC 含量和不超过 2 的自我互补性。为了确认 PCR 产物的大小，使用序列操作套件 (SMS) 检查引物序列。引物序列和优化条件见表 2。

2.3.4。qRTPCR分析

使用 qRTPCR 实时热循环仪 qTOWER 3 84 GmbH (Analytik Jena) 评估靶基因的表达水平。qRTPCR 反应使用 Luna ® Universal qRTPCR Master Mix (NEBM3003S, New England Biolabs) 按照制造商的说明进行。20 µl 反应液含有 10 µl Luna ®预混液、正向和反向引物各 0.5 µl (10 pmol/µl)、2 µl cDNA 和 7 µl 无核酸酶水。所有反应一式三份进行。qRTPCR 是使用该程序完成的；初始变性：95˚C 60 秒，40 个循环；变性：95°C 15 秒，退火/延伸：62°C 30 秒，在 60°C - 95°C 熔化。使用 Microsoft excel 软件（2019 版）分析数据。参考β-肌动蛋白管家基因，使用2^ -ddCt方法[ 70 ]确定靶基因的表达水平。图 1显示了目标基因的 qPCR 产物。

2.3.5。相对基因表达

使用 2^ -ddCt方法计算靶基因的相对表达水平。管家基因β-肌动蛋白用作参考基因以标准化靶基因的表达。然后将相对表达表示为相对于对照的倍数变化。

基因名称

序列

退火温度/°C

PCR产物大小/bp

NCBI 参考序列。

PCR条件

缺口1

F

5'GTGGGCTCCCGTGTTTTGTA3'

62

300

NM_017617.5

初始变性：95˚C 3 min，30个循环；变性：95°C 15 秒，退火：62°C 45 秒，伸长率：72°C 3 分钟，最终伸长率：72°C 10 分钟

R

5'TCCCTCACTGGCATGACACA3'

CXCR7

F

5'ATTTGATTGCCCGCCTCAGA3'

62

149

NM_020311.3

R

5'GACGCTTTTGTTGGGCATGT3'

我的C

F

5'TGTTGAAAATGGGTCTGGGGG3'

62

129

NM_002467.6

初始变性：95˚C 5 min，30个循环；变性：95°C 30 秒，退火：62°C 1 分钟，伸长率：72°C 3 分钟，最终伸长率：72°C 10 分钟

R

5'TCTCACCTTCTCACCTGCCT 3'

FGFR1

F

5'ATTTCTGCCTTGGCCCTACC3'

62

175

NM_001354369.2

R

5'CTAGCGCAGTCTTTGGGGAA3'

β-肌动蛋白

F

5'CGGCATCGTCACCAACTG3'

62

153

NM_001101.5

R

5'ACATGATCTGGGGTCATCTTCTC3'

表 2。目标基因的引物序列、退火温度和 PCR 产物大小及其 NCBI 登录号。

图 1。目标基因优化引物的 4% 琼脂糖凝胶：L：100 bp ladder，A： β-ACTIN（153 bp），B： MYC（129 bp），C： FGFR1（175 bp），D： NOTCH1（ 300 bp），E： CXCR7（149 bp）。

2.4. 数据分析

所有实验一式三份进行，至少重复三次。数据在 Microsoft Excel 软件（2019 版）中呈现，并表示为平均值 ± SE。使用Graph-pad Prism软件（v8.4.3）进行方差分析，用于比较组间差异。P. 值< 0.05 被认为具有统计学意义。

3. 结果

3.1。Dermaseptin B2对RD细胞增殖的影响

Drs B2 和阿霉素对横纹肌肉瘤 (RD) 细胞系的抗增殖活性进行了评估。在 24、48 和 72 小时的时间点进行治疗。阿霉素用作阳性对照。结果表明，超过 9 µM 的处理会导致细胞增殖的完全抑制。Drs B2 和阿霉素在 24 小时（图 2）、48 小时（图 3）和 72 小时（图 4）时间点的抑制浓度（IC50）见表 3. 数据显示，Drs B2 (5.993 µM) 和多柔比星 (1.886 µM) 的活性随着细胞在处理中的孵育时间延长（72 小时）而增加。尽管多柔比星显示出对细胞生长的更大抑制作用，但当使用方差分析 (ANOVA) 比较这些结果时，它们在所有治疗时间点上均未显示 Drs B2 和多柔比星之间的显着差异。

3.2. Drs B2 对细胞迁移的影响

Drs B2 和阿霉素对细胞迁移的影响如图 5 所示。显示了每次处理前 RD 细胞的正常形态（字母

图 2。Drs B2 和阿霉素对 24 小时治疗细胞的影响。细胞在 DMEM 中培养并铺板在 96 孔板中，然后进行处理。通过用刃天青细胞活力染料染色细胞并孵育 24 小时来确定细胞活力，并在读板器 Infinite M1000 (Tecan) 机器上读取板。每个实验至少重复三次。结果表示为平均值±标准差。

图 3。Drs B2 和阿霉素对 48 小时治疗细胞的影响。细胞在 DMEM 中培养并铺板在 96 孔板中，然后进行处理。通过用刃天青细胞活力染料染色细胞并孵育 4 小时来确定细胞活力，并在读板器 Infinite M1000 (Tecan) 上读取板。每个实验至少重复三次。结果表示为平均值±标准差。

图 4。Drs B2 和多柔比星对细胞 72 小时治疗的影响。细胞在 DMEM 中培养并铺板在 96 孔板中，然后进行处理。通过用刃天青细胞活力染料染色细胞并孵育 4 小时来确定细胞活力，并在读板器 Infinite M1000 (Tecan) 上读取板。每个实验至少重复三次。结果表示为平均值±标准差。

细胞类型

B2博士

IC50(微米)

多柔比星

IC50(微米)

24小时

48小时

72 小时

24小时

48小时

72 小时

RD 电池 (IC50)

7.679

7.235

5.993

4.879

2.701

1.886

Vero 细胞 (CC50)

20.53

13.87

11.64

11.17

8.138

6.890

选择性指数 (SI) = CC50/IC50

2.673

1.917

1.942

2.289

3.079

3.653

表 3。在时间间隔内，Drs B2 和阿霉素治疗 RD 细胞的IC 50值。

CC 50：细胞毒性浓度，IC 50：抑制浓度，Drs B2：dermaseptin B2，RD：横纹肌肉瘤细胞。

一个，Bn，Cn）。A0、A6、A24、A48 和 A72 代表未处理细胞的伤口闭合（空白对照）。该结果表明空白对照在处理间隔期间对细胞恢复没有影响。B0、B6、B24、B48 和 B72 显示 Drs B2 对 RD 细胞伤口闭合的影响。这一结果表明，Drs B2 抑制了细胞迁移并影响了细胞恢复的能力，更长的孵育时间（48、72 小时）显示出更强的效果。相反，C0、C6、C24、C48 和 C72 代表阿霉素对细胞伤口闭合的影响。阿霉素还抑制细胞迁移并影响细胞向伤口闭合的恢复。总之，这些结果表明 Drs B2 和多柔比星对细胞迁移和运动的影响，

图 5。伤口愈合试验。Drs B2 和阿霉素对细胞迁移的影响。时间间隔表示为 0、6、24、48 和 72 小时的孵育时间。箭头表示治疗时间点期间伤口的空间。图像以 10 倍放大倍率拍摄。

3.3. 基因表达分析

研究了 Drs B2 对MYC、NOTCH1、FGFR1和CXCR7的表达谱的影响。通过比较处理和未处理的RD细胞之间靶基因的表达谱进行相对基因表达，并将结果标准化为参考基因β-肌动蛋白。Livak [ 70] 方法用于确定处理和未处理细胞之间靶基因的倍数变化表达。Drs B2 和阿霉素均显着下调所有靶基因的表达。条形顶部的相同字母表示无显着差异，而不同字母表示使用 GraphPad Prism 软件 (v8.4.3) 进行的 Tukey 多重比较测试 (≤0.05) 存在显着差异。

Drs B2和阿霉素对RD细胞24、48和72小时MYC表达的影响见图6。在 72 小时处理时（P.值= 0.01），在用 Drs B2（倍数变化 = 2.4144）和多柔比星（倍数变化：3.5067）处理的 RD 细胞中，MYC显着下调。所有基因的倍数变化表达见表4。经处理和未经处理的细胞在 24 小时和 48 小时时间点上没有显着差异（P.值= 0.4）。相反，在所有治疗时间点，Drs B2 和多柔比星之间没有发现显着差异（P.值= 0.53）。

图 6。在用 Drs B2 和多柔比星处理 24、48 和 72 小时后，RD 细胞中的MYC表达。(A)24 小时处理后的MYC表达。(B)治疗 48 小时后的MYC表达。(C)治疗 72 小时后的MYC表达。每个处理重复三次。

时间间隔

Drs B2和阿霉素处理细胞后靶基因的相对倍数变化

B2博士

多柔比星

我的C

缺口1

CXCR7

FGFR1

我的C

缺口1

CXCR7

FGFR1

24小时

1.5013

2.4667

2.8818

2.3515

2.3483

3.0189

3.9366

2.5943

48小时

1.5185

4.6274

4.4430

2.0809

2.7945

4.7481

5.8937

2.3105

72 小时

2.4144

4.3352

3.9924

2.2543

3.5067

5.7878

5.5799

2.2402

表 4。治疗间隔期间靶基因的相对倍数变化。

图7显示了Drs B2和阿霉素对FGFR1表达的影响。在P. 值：0.01 时，Drs B2 和多柔比星在 24 小时和 48 小时处理时均显着下调处理细胞中的FGFR1 。对于 Drs B2 和多柔比星，这种下调在 72 小时（P.值：0.003）治疗中也很显着。倍数变化表达式如表 4 所示。在 72 小时处理中，倍数变化表达略有减少。在所有治疗时间点之间，Drs B2 和阿霉素之间没有观察到显着差异（P.值：0.9）。

Drs B2和阿霉素对NOTCH1基因表达的影响见图8。在P. 值0.0001 时，与未处理的细胞相比，Drs B2 和多柔比星在处理的细胞中 24、48 和 72 小时的所有处理间隔中均下调了NOTCH1基因。倍数变化表达式如表 4 所示。Drs B2 和阿霉素在所有治疗时间点均未观察到显着差异（P.值= 0.58）。

图 7。用 Drs B2 和多柔比星处理 24、48 和 72 小时后 RD 细胞中的FGFR1表达。(A)24 小时处理后的FGFR1表达。(B)48 小时处理后的FGFR1表达。(C)72 小时处理后的FGFR1表达。每个处理重复三次。

图 8。用 Drs B2 和多柔比星处理 24、48 和 72 小时后，RD 细胞中的NOTCH1表达。(A)24 小时处理后的NOTCH1表达。(B)48 小时处理后的NOTCH1表达。(C)72 小时处理后的NOTCH1表达。每个处理重复三次。

Drs B2和阿霉素对CXCR7基因表达的影响见图9。在 P. 值 0.0001 时，与未处理的细胞相比，Drs B2 和多柔比星在处理的细胞中 24、48 和 72 小时的所有处理时间点均下调 CXCR7 基因。倍数变化表达式如表 4 所示。Drs B2和阿霉素在治疗时间点上没有显着差异。

图 9。用 Drs B2 和多柔比星处理 24、48 和 72 小时后 RD 细胞中CXCR7的表达。(A)24 小时处理后的CXCR7表达。(B)48 小时处理后的CXCR7表达。(C)72 小时处理后的CXCR7表达。每个实验进行三个重复。

4。讨论

目前的研究旨在研究抗菌肽 Drs B2 对横纹肌肉瘤 (RD) 细胞的抗增殖活性及其对参与细胞增殖 ( MYC )、血管生成 ( FGFR1、CXCR7 ) 和转移 ( NOTCH1、CXCR7 ) 的基因表达的影响。)，同时使用多柔比星作为对照抗癌药物。结果表明，Drs B2对横纹肌肉瘤（RD）细胞具有较强的抗增殖活性，呈时间依赖性，Drs B2的抑制作用可推断为时间和浓度依赖性。这些发现与先前的研究一致，这些研究报告了 Drs B2 对具有微摩尔浓度的各种癌细胞的细胞生长抑制作用 [ 62 ]。相比之下，据报道，Dermaseptin 家族的成员 Dermaseptin-L1 具有 45µM 的选择性抑制活性 (GI 50 ) [ 71]，表明 Drs B2 的活性高于其他 Dermaseptins 家族成员。尽管有这些结果，但与多柔比星相比，Drs B2 显示出较低的特异性，因为对 Vero 细胞的选择性指数较低，然而，差异并不显着，因此 Drs B2 可以成为治疗的潜在替代品。

与癌症治疗相关的主要并发症之一是由于转移到远处器官导致预后和生存不良[ 72 ]。细胞迁移的研究是细胞运动和转移能力的一个重要方面。Drs B2 和多柔比星强烈抑制细胞迁移，长时间暴露（48 和 72 小时）导致细胞无法重建伤口/划痕。通过接触抑制抑制细胞的通讯和恢复表明它们无法移动，因此会干扰它们的转移潜能 [ 72 ]。该结果表明 Drs B2 影响涉及细胞迁移和侵袭的因素或基因。这一结果也进一步支持了FGFR1的下调涉及 Drs B2 转移过程的基因。

MYC发挥许多关键功能，包括增殖、生长和凋亡过程 [ 21 ]。该基因已被证明在不同的人类癌症中失调，其失活导致肿瘤消退，可作为癌症治疗的目标 [ 73 ]。Drs B2对RD中MYC基因的下调表明它影响了涉及细胞增殖和生长的过程。处理的细胞毒性结果可以进一步支持该结果，该处理显示出更大的抑制活性，细胞与处理的孵育时间越长。癌症治疗药物的主要作用机制之一是诱导细胞凋亡 [ 74]，Drs B2 也可以参与该过程，尽管之前的一项研究报告说 Drs B2 的坏死多于凋亡活性 [ 62 ]。

伊格内修斯等人。(2017) 显示了NOTCH1在胚胎横纹肌肉瘤分化中的作用及其对整体肿瘤发生的影响 [ 28 ]。先前的一项研究报道，Ƴ-分泌酶抑制剂降低了 RMS 细胞的流动性，但对细胞周期或凋亡过程没有影响 [ 27 ]。这表明 Notch 通路抑制降低了细胞的侵袭性，因此，可以抑制该通路的新化合物在 RMS 治疗中可能至关重要，并且可能具有抗转移潜力。在这项研究中，Drs B2 (fc: 4.6275) 和阿霉素 (fc: 5.7878)对处理细胞中的NOTCH1表达有显着影响。虽然NOTCH1的倍数变化表达Drs B2 在 72 小时 (fc: 4.3352) 间隔内略微降低，该基因在所有治疗间隔内显着下调（P 值0.0001）。Drs B2 和阿霉素对细胞迁移的活性可以进一步支持这些结果，这表明它们可能对涉及细胞运动和侵袭性的因子或基因产生影响。多柔比星的更高疗效可能是由于多柔比星用于治疗晚期 RMS 和转移性实体瘤 [ 8 ]。

成纤维细胞生长因子受体 (FGFRs) 在生存、运动、体内平衡和致癌过程中发挥重要作用 [ 75 ]。研究证实了FGFR1在 RMS [ 20 ] [ 32 ] [ 38 ] 中的扩增和过表达。因此，可以靶向和抑制包括细胞新血管形成在内的过程的新型治疗剂对于治疗 RMS 至关重要。尽管 Drs B2（fc：2.3515，p.值；0.01）和多柔比星（fc：2.5943，p.值）都将 RD 细胞暴露于 Drs B2 和多柔比星导致FGFR1在所有治疗间隔中显着下调; 0.007），在 24 小时间隔内更有效。我们的结果支持先前报道的 Drs B2 [ 61 ] 的血管抑制作用。由于FGFR1涉及许多过程，包括新血管形成和血管生成，其在细胞中的下调表明 Drs B2 具有新的抗血管生成活性和抑制 RD 细胞中的新血管形成。

CXCR7 被证明是高度表达的 RMS 细胞，并且与这些细胞的粘附性增加有关 [ 43 ]。据报道，CXCR7 在控制血管生成过程中起关键作用 [ 40 ]。还报道了 CXCR7 在控制 RMS 细胞的转移性传播、粘附和侵袭方面的作用 [ 41 ] [ 43 ]]，表明该基因轴作为 RMS 治疗的目标。与未处理的细胞相比，处理过的细胞中 CXCR7 的相对下调进一步表明 Drs B2 对新血管形成的治疗效果和 Drs B2 的抗血管生成潜力。趋化因子及其受体调节 RMS 细胞的前转移增殖，增加 MMP 的运动性、趋化性和表达以及细胞粘附 [ 76 ] [ 77 ] [ 78 ]，但不直接参与 RMS 细胞生长，阻断新发现的 SDF Drs B2 的 CXCR7 [ 43 ] -1 结合受体可能是这些细胞中的靶标。

5. 结论

Drs B2 对 RMS 细胞具有很强的抗增殖活性。细胞迁移测定结果表明，Drs B2 对细胞迁移具有很强的抑制活性，这可能是由于其对涉及细胞迁移和运动的因素的影响。基因表达结果显示 Drs B2 下调涉及细胞增殖、血管生成和转移性增殖的基因。需要进一步研究以更好地了解 Dermaseptin B2 肽的详细作用机制以及体内作用。

作者贡献

概念化，Ahmed A. Abdille、Josephine Kimani、Fred Wamunyokoli 和 Esther。N迈纳。数据管理，Ahmed A. Abdille；形式分析，Ahmed A. Abdille；资金收购，Ahmed A. Abdille、Josephine Kimani、Fred Wamunyokoli 和 Esther。N迈纳；调查，Ahmed A. Abdille；方法论，Ahmed A. Abdille、Josephine Kimani、Fred Wamunyokoli 和 Esther。N迈纳；项目管理，Fred Wamunyokoli；资源，Josephine Kimani、Fred Wamunyokoli、Wallace Bulimo 和 Esther。N迈纳；监督，Josephine Kimani，Fred Wamunyokoli 和 Esther。N迈纳；验证，Ahmed A. Abdille、Josephine Kimani、Fred Wamunyokoli、Wallace Bulimo、Yahaya Gavamukulya 和 Esther。N迈纳；写作原稿，Ahmed A. Abdille；写作评论与编辑，Josephine Kimani、Fred Wamunyokoli、Wallace Bulimo、Yahaya Gavamukulya 和 Esther。N迈纳。

资金

本研究由泛非大学基础科学技术与创新研究所 (PAUSTI) 资助，资助号 (MB400-0007/2019) 和 AFRICA- ai -JAPAN 项目（第 2 阶段，2021-2022） .

机构审查委员会声明

不适用。

知情同意声明

不适用。

数据可用性声明

本研究的所有原始数据均可根据合理要求从通讯作者处获得。

致谢

作者感谢泛非大学支持这项研究。非常感谢 Mark Ndubi、Samwel Symekher、Silvanos Mukunzi、Meshack Wedagu、Janet Mananja 以及肯尼亚医学研究所 (KEMRI) 病毒研究中心 (CVR) 新兴传染病部的整个团队，流感清洁细胞培养实验室的慷慨支持。

缩写

ARMS，肺泡横纹肌肉瘤；ATCC，美国典型培养物保藏中心；CC 50 , 细胞毒浓度; DrsB2，皮肤菌素 B2；DOX，多柔比星；DMEM，Dulbecco改良Eagle培养基；ERMS，胚胎性横纹肌肉瘤；FBS，胎牛血清；FGFR1，成纤维细胞生长因子 1；FNRMS，融合阴性横纹肌肉瘤；FPRMS，融合阳性横纹肌肉瘤；IC 50 , 抑制浓度; RMS，横纹肌肉瘤；SDF-1，SI，选择性指数；基质衍生生长因子。

补充材料

所有分析的数据都包含在手稿中。https://data.mendeley.com/drafts/2mz6jw4zzc

利益冲突

作者声明与本文的发表没有利益冲突。

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