综述：间充质干细胞的神经元分化方案

摘要：间充质干细胞 (MSCs) 是在血管周围区域的几乎所有出生后器官和组织中发现的自我更新细胞。这些细胞呈现出多种特征，使其成为神经退行性疾病细胞疗法的候选者，例如它们的分泌作用、向病变区域的迁移和免疫调节潜力。这些细胞具有很高的中胚层分化能力；然而，大量研究表明，MSCs 也可以分化为神经元。然而，尽管在移植未分化 MSCs 的多项试验中取得了积极的结果在神经退行性疾病的动物模型中，一些研究表明，通过使用在移植前向神经元谱系分化的 MSCs 可以增强获得的治疗效果。从这个意义上说，有几种方法可以诱导MSCs体外重编程向神经元谱系，包括化学物质、生长因子、与神经谱系细胞共培养、基因转染、miRNAs等，其中小分子脱颖而出。因此，本文比较了在这些诱导剂促进了 MSCs 的神经元分化，并确定了那些产生最佳神经元分化的方法。考虑到用作起源组织的 MSC 的内在特征和分离它们的物种，该分析包括分化、成熟、神经元标记的表达、功能和细胞存活的百分比。

关键词

间充质 干细胞,转 分化,神经 元 分化,小 分子, miRNA ,神经 诱导

一、简介

间充质干细胞 (MSC) 也称为多能间充质基质细胞，几乎存在于所有出生后器官和组织中，特别是在血管周围区域 [ 1 ]。这些细胞的特征是具有细长的中央细胞核的纺锤形形态，并含有2至3个核仁。流式细胞术已经描述了这些细胞的三个亚群：1) 小的梭形和颗粒细胞，2) 小的无颗粒细胞，和 3) 大颗粒细胞。通过显微镜检查，在培养物中报告了两种形态类型，一种是成纤维细胞形状（主要），另一种是具有菱形形状的巨细胞 [ 2 ]。

根据国际细胞治疗学会间充质和组织干细胞委员会的规定，间充质干细胞必须满足三个最低标准：1）它们必须在标准生长条件下粘附在塑料上；2) 必须表达 CD105、CD73 和 CD90 标记（超过 95% 的细胞培养物），通过流式细胞仪测量，并且应该缺乏 CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79a 的表达（低于 5%） 、CD19 和 HLA II 类；3) 最后，细胞必须具有分化成成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的能力，使用标准的体外条件文化分化（图1）。向成骨细胞的分化可以通过红茜素或冯科萨染色来证明；油红染色快速显示脂肪细胞分化和软骨细胞分化，如阿尔新蓝 8G 和 II 型胶原蛋白所示 [ 3 ]。

理论上，MSC 很容易实现中温分化，因为它们具有确切的胚胎起源。然而，几项研究提供的证据表明，在最佳体外生长条件或体内心脏壁龛下，MSC 还可能产生其他类型的高度特化组织，包括心肌细胞和内皮细胞 [ 4 ] 或内胚层谱系，如肝细胞 [ 5 ]和胰腺β细胞[ 6 ]。此外，许多研究已经

图 1。根据国际细胞治疗学会间充质和组织干细胞委员会的规定，被认为是间充质干细胞的最低标准。

表明这些细胞也可以分化成外胚层谱系，如神经组织 [ 7 ] [ 8 ] [ 9 ]。

体外MSCs 向神经元谱系的重编程可以使用不同的方法和不同的诱导剂进行，例如化学物质、生长因子、与神经谱系细胞的共培养、基因转染 miRNA 和称为小分子的化学物质。这些方法在分化效率方面表现出相当大的差异。各种分化诱导剂的选择取决于几个因素，例如用于诱导分化过程的细胞的价格和内在特征。这将取决于这些诱导剂所需受体的存在与否以及参与不同诱导剂必须特异性激活的分化途径的分子的表达。所以，本文旨在比较这些诱导剂促进 MSCs 神经元分化的多项实验测试。考虑到用作起源组织的 MSC 的内在特征和分离它们的物种，该分析将确定具有合理分化率、成熟度、神经元标志物表达、功能和细胞存活的最佳神经元分化方法。

2. MSC 历史

1999 年 Pittenger等人。表征了从骨髓中分离的同质人间充质细胞群，在培养中高度增殖，具有扩展的成纤维细胞形态。这些细胞表现出一组恒定的表面蛋白表达和对脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞谱系的高分化能力。所有这些特征都保留在源自单个细胞（克隆）的细胞集落中，避免了骨髓仅包含用于造血谱系的祖细胞的可能性 [ 10 ]。

除骨髓抽吸外，MSC 已从多种其他成人组织中分离出来，例如脂肪组织抽吸物和其他结缔组织，例如长骨的髓腔、小梁骨碎片、骨膜、滑液、牙周韧带、腭杏仁核、甲状旁腺和输卵管、胰腺、肝脏、真皮和成人骨骼肌 [ 2 ] [ 11 ]。同样，MSC 可以从其他组织中提取，例如沃顿氏脐带、临时牙髓、羊水、羊膜和胎盘 [ 11 ] [ 12 ]（图 2）。

最近，从鼻上皮中分离出一群具有间充质特征的干细胞。这些细胞具有一种细胞表型，其特征是表达 MSC 共有的表面蛋白，包括 STRO-1、CD90、CD105 和 Nestine，一种中间丝。它们不表达典型的嗅上皮标志物，如细胞角蛋白，也不表达造血谱系，如 CD34 和 CD45。重要的是要注意，这些细胞是从固有层获得的，与嗅觉上皮的基底细胞明显不同，嗅觉上皮的基底细胞充当神经上皮谱系的干细胞 [ 13 ]。

鼻 MSC 在转录上与骨髓 MSC 更相关，并且与造血干细胞、神经祖细胞、滑膜成纤维细胞和骨膜细胞等其他干细胞有显着差异。此外，与骨髓 MSC 相比，鼻 MSC 显示出高增殖率，分化为骨细胞和神经元，并且由于软骨形成抑制剂 (Asporin) 脂肪生成 (GATA2) 受到正向调节，因此对软骨细胞和脂肪细胞的分化能力很小。同时，神经发生 (Neurogenesis-1) 和成骨 (OSR2) 激活剂在这些细胞中过表达。此外，由于鼻MSC来源于神经嵴组织，它们表现出更显着的与神经细胞相关的基因表达，因此它们被称为外间充质干细胞（eMSC）。14 ]。

培养的细胞必须具有相似的标准才能被视为 MSC，无论它们来自何处；然而，根据来源不同，一些MSC的增殖能力和可扩展性存在一些差异，例如，骨髓和脂肪组织MSC比脐带MSC具有更大的培养效果，但与其他MSC相比，后者具有更显着的扩展潜力。细胞来源 [ 15 ]。

图 2。MSCs 来源。

3. MSC的多能性

间充质干细胞的多潜能能力，与间充质谱系特定分子的表达有关，如波形蛋白和纤连蛋白、I型和III型胶原、成骨细胞的特定因子2和VI型胶原，它们还表达不同种类的共同mRNA其他细胞谱系，包括成骨细胞、软骨细胞和成肌细胞。除此之外，间充质细胞本身的非典型分子的表达也已得到证实，如上皮细胞和内皮细胞的 mRNA 特征，如细胞角蛋白 (CK) 8 和 10、血管内皮生长因子 (EVGF) 和胶原蛋白四，等等。MSCs 还表达神经组织共有的转录物，如神经丝 H、高亲和力神经生长因子受体 (NGF hi)，Nexine 1 α，源自神经胶质、N-甲基-D-天冬氨酸谷氨酸受体的亚基 2C，以及各种神经营养因子 [ 16 ]。另一方面，已观察到从胎儿组织获得的 MSC 表达与胚胎干细胞相关的基因，例如白血病抑制因子受体 (LIFR)、ESG 1 、 SOX- 2 、 Oct4、FGFR4、Nanog、Rex1 和TERT ，以及与形态发生相关的蛋白质基因，例如SHH、 Neuregulin1 和 4、Patched、SNA 2 和WNT 4 [ 17 ]。

4. MSC的功能和特性

间充质干细胞具有显着的可塑性，使它们能够在适当的刺激下分化成不同的谱系。有人提出，这些细胞可以作为天然组织恢复剂，因此可用于在移植后恢复各种细胞群。不仅它们的分化潜能使它们成为此目的的理想候选者，而且还具有促进周围组织再生的几种营养特性，包括 1) 分泌作用 [ 17 ] - [ 22 ]，2) 迁移能力 [ 23 ] - [ 33 ] 3) 免疫调节作用 [ 12 ] [ 34 ]。

五、MSC的竞争优势

成人间充质干/祖细胞的几个独特特征对于治疗是必不可少的。MSC 可以长期储存而不会显着损失其特性或效力。此外，它可以从各种成人组织中收集，与胚胎干细胞不同，胚胎干细胞的使用不会因伦理考虑或法律限制而加重。[ 11 ]。MSC 在细胞周期的每个阶段都具有免疫特权和免疫调节功能。它被传播以产生感兴趣的组织 [ 35 ]，最重要的是，它不具有致瘤潜力 [ 36 ]]。同样，MSC 可以调节免疫反应，因为即使在没有免疫抑制剂的情况下，这些细胞的同种异体移植也不会产生重大的免疫排斥风险 [ 25 ]。此外，MSC在储存、冷冻和解冻后具有优异的稳定性，不影响其干性，也不影响其细胞特性和功能。并且不诱导表面蛋白表达、激活基因谱以及分化或增殖能力的变化 [ 37 ]。

MSCs 特征的决定性作用是这些细胞来源的年龄和健康状况。据观察，从 50 岁以下的健康个体中分离的基质骨髓细胞比从 60 岁以上的个体中获得的细胞具有更高的成骨分化能力 [ 38 ]。此外，就健康状况而言，据观察，从肥胖人群中获得的 MSC 的增殖和分化能力显着下降 [ 39 ]。

6. MSC 和神经系统疾病

大脑的某些区域会根据环境的认知需求而增长或退化，而急性攻击可以刺激成人神经发生。然而，在神经干细胞生态位的支持下，常驻祖神经元并不能完全补偿严重创伤或神经退行性疾病的有害后果。因此，干细胞培养可以提供外源性细胞疗法，并被提议作为治疗各种神经系统疾病的有吸引力的替代方案。已经提出了几种干细胞或祖细胞来治疗脑损伤，例如神经祖细胞和胚胎干细胞。然而，与这些细胞相关的伦理和技术问题推动了基于成人间充质干细胞自体移植的新策略 [ 30]。MSC可以在适当的诱导条件下分化成不同的谱系。因此，有人提出这些细胞可以在神经系统疾病移植后恢复受损的细胞群。事实上，不仅它们的分化潜能使它们成为细胞治疗的理想候选者，而且促进周围组织再生的微囊泡（外泌体）的分泌也至关重要[ 32 ]。

MSCs 必须满足以下退行性神经元疾病的细胞疗法治疗标准： 1) 供体细胞应易于获得；2）在细胞培养中必须具有高度增殖能力和快速扩增能力；3) 应该是免疫无活性的；4）必须长期生存，融入宿主大脑；5) 并且应该能够维持稳定的转染和外源基因的长期表达（如果治疗需要）[ 27 ]。

MSC 具有所有这些特征，并已成为应用于细胞治疗方案的优秀候选者，证明了它们在各种神经退行性疾病和神经系统损伤模型（如缺血性中风）的功能恢复中的有用性 [ 18 ] [ 30 ] [ 40 ] [ 41 ] [ 42 ] [ 43 ]、脱髓鞘损伤 [ 44 ] [ 45 ] [ 46 ]、脊髓损伤 [ 20 ] [ 47 ] [ 48 ] [ 49 ]、截瘫 [ 50 ]、帕金森病 [ 17 ] [ 51 ]] 和耳蜗损伤 [ 13 ]。

尽管在这些试验中使用未分化的 MSCs 获得了积极的结果，但一些研究表明，在细胞移植前使用分化的 MSCs 治疗神经元谱系时，通过 MSC 移植获得的治疗效果会增强 [ 52 ] [ 53 ]。从这个意义上说，有几种方法可以诱导MSCs 向神经元谱系进行体外重编程。使用化学物质、生长因子、与神经谱系细胞共培养、基因转染、

图 3。MSCs的神经元分化方法。

miRNA 和小分子（图 3）。

7. 化合物

通过化合物进行分化是促进 MSC 快速分化为神经表型的最常用方案之一。在这些物质中，抗氧化剂的使用尤为突出，这些药物可以增加环磷酸腺苷 (cAMP) 的水平，并修饰染色质作为转分化的诱导剂。

7.1。抗氧化剂

7.1.1. β-巯基乙醇

伍德伯里等人。是第一个使用β-巯基乙醇（β - Me）作为诱导剂将小鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元表型的人。为此，将 MSCs 暴露于具有β-Me 在低浓度下放置 24 小时，以便稍后利用具有更高化学浓度的神经元诱导来替换该培养基。这种方法促进了早在诱导培养基中培养 3 小时后，MSCs 就逐渐呈现出神经元形态特征。最初，细胞的细胞质向细胞核收缩，形成收缩的多极细胞体，以外周突起的形式留下膜状延伸。两小时后，细胞体变得越来越球形和折射，表现出典型的神经元外观，显示初级和次级分支，生长锥形末端扩张和假定的丝状延伸。此外，这种形态变化伴随着处理过的 MSCs 中神经元标志物神经元特异性烯醇化酶 (NSE) 表达的增加，54 ]。

在这方面，Zuk等人。使用该方案处理源自脂肪组织的人类 MSC，在诱导后仅 30 分钟，观察到 MSC 形态发生变化，其中约 10% 的细胞呈现神经元表型，其增加至最大值诱导后 3 小时为 70%。这种诱导导致神经元标志物 NSE 和神经元核抗原 (NeuN) 在处理过的 MSCs 中表达，在处理前在 MSCs 中未检测到其表达。然而, 该协议诱导的 MSCs 不表达成熟的神经元标记, 如微管相关蛋白 2 (MAP-2) 或神经丝 70 (NF-70), 也不表达胶质标记, 如半乳糖神经酰胺酶 (GalC) 或酸性胶质细胞的纤维蛋白。(GFAP) [ 55 ]。

该方案还成功地用于区分源自骨髓的人类 MSC，发现在添加抗氧化剂 5 小时后，观察到这些细胞的形态向神经元形态发生变化。然而，一段时间后，这些细胞的形态又恢复到其基础状态。这种处理还诱导了处理细胞中 NF-H 的从头表达和 NSE 和 NeuN 的增加，在对照 MSCs 中以缺乏的水平表达。免疫组织化学分析表明，高达 98% 的细胞被针对早期神经元标记 NeuN 和β-微管蛋白 III 的抗体染色。同时，正如 Zuk 和合作者所报告的，没有观察到 MAP2、GFAP 或 Gal-C 的表达。电生理分析显示存在钠电流（Na+ )，它很快被灭活，并且输出电流，可能是感应 MSCs 中的 K +。类似地，当受到高浓度谷氨酸或钾 (K + )的攻击时，这些细胞的细胞内 Ca 2+浓度增加。同时，在未分化的 MSCs 中，没有观察到该离子浓度的显着变化 [ 56 ]。

就他们而言，Khanabdali等人。还报道了与以缺乏水平表达这些标志物的对照组相比，用β -Me处理的鼠骨髓MSC中Nestin、MAP2和Tau的表达水平增加。同时，这些细胞的巢蛋白和β-微管蛋白 III 呈阳性染色 [ 57 ]。

最后，施等人。证明在诱导步骤中使用较低浓度的β -Me不会影响细胞分化。早在诱导后 5 小时，70% 的小鼠骨髓间充质干细胞用先前试验中使用的一半浓度的​​ β -Me 处理，就显示出神经元细胞的特征性形态学变化。同样，在诱导细胞中观察到 NSE 和 Nestin 的表达增加，而 Notch 1 和下游 Notch 基因 Hes1 的表达在诱导后降低。另一方面，当用过氧化氢（H 2 O 2)、Notch 1 和 Hes1 增加，表明这些分子的表达水平与活性氧 (ROS) 水平的变化相关，由β -Me 处理介导 [ 7 ]。

7.1.2. BHA/DMSO

伍德伯里等人。测试了用β -Me处理预诱导细胞的效果，在诱导步骤中添加二甲亚砜（DMSO）和丁基化羟基茴香醚（BHA）。这种修饰诱导神经元形态变化，其时间过程类似于β -Me，其中大多数显示圆形细胞体的细胞在暴露于这些抗氧化剂、扁平、未分化细胞后表达高水平的 NF-M、tau 和 NeuN不要。为了进一步优化微分协议，作者替换了β-Me 在含有碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF) 的诱导培养基中，然后用 DMSO/BHA 诱导 MSC。它促进了具有神经元特征的细胞比例的增加，因为以这种方式处理的大多数 MSC 都表现出神经元形态。大约 78% 的细胞对 NSE 染色呈阳性，79% 对 NF-M [ 54 ] 染色。

侯等人。还使用 DMSO/BHA 作为诱导剂来区分人 MSCs 和用β -Me预处理的脐带。诱导后，70%的细胞表现出神经元样表型，71.4%的诱导MSC为NSE阳性，73.2%为NF。此外，甲苯胺蓝染色表明在细胞的细胞质中存在尼氏体，这是神经元的特征。然而，这些细胞的电生理分析并未显示神经元存在典型的 Na +电流，这表明向未成熟神经元状态分化 [ 58 ]。

就他们而言，Vaquero等人。研究了在用β - Me、DMSO 和 BHA治疗骨髓人 MSC 之前添加脑脊液的效果。向培养基中添加脑脊液在显示神经分化标志物的细胞百分比方面没有显着差异。诱导后一周，表达神经元标志物的细胞比率为 NSE 的 92%、NF-200 的 90% 和β-微管蛋白 III 的 86%，而之前用脑脊液处理时，分别为 90%、86% 和 90 %，分别，当省略这个[ 59 ]的添加时。

7.1.3. 四甲基吡嗪

南等人。用四甲基吡嗪处理脐带衍生的人 MSCs，吡嗪是一种从中国植物川芎中分离纯化的活​​性生物碱，具有抗氧化特性。四甲基吡嗪处理30分钟后，40%的细胞呈现神经元形态，处理90分钟后达到85%。RT-PCR 分析表明，与未处理的细胞相比，这些诱导的细胞显示出 NF-H 和 NSE 表达。另一方面，免疫细胞化学染色结果显示，这些细胞中有 80.79% 为 NF-H 阳性，7​​9.76% 为 NSE [ 60 ]（补充表S1）。

7.2. 增加 cAMP 水平的化学物质

邓等人。用异丁基甲基黄嘌呤 (IBMX) 和环状二丁酰 AMP (dbAMPc) 处理人骨髓 MSC，这两种药物可增加 cAMP 水平以诱导神经元分化。诱导六天后，约 25% 的 MSCs 分化为具有典型神经形态的细胞，与未分化的 MSCs 相比，NSE 和波形蛋白的表达水平增加。然而，在两个群体之间没有观察到 MAP1B 或β-微管蛋白 III 的表达水平发生变化。同样，在从培养基中去除诱导剂后，所有神经元样细胞在接下来的几天内都会死亡 [ 61 ]。

阿什健等人。当在由补充有胰岛素、消炎痛和 IBMX 的 DMEM 培养基组成的诱导培养基中培养 CMM 时，诱导 CMM 的神经元分化。在诱导 14 天时，大约 25% 的总 MSC 群体呈现神经元表型，其中 NSE、波形蛋白、Trk-A 和 NeuN 的表达增加，这些在未分化的 MSC 中以低水平表达。此外，在分化 14 天后，表达神经元样形态特征的细胞显示出晚期整流 K +电流。然而，这些细胞没有 GFAP 或 MAP2 和 tau [ 62 ]。

龙等人。通过将人骨髓间充质干细胞暴露于 dbAMPc 和 IBMX 以及表皮生长因子 (EGF)、成纤维细胞生长因子 8 (FGF-8) 和脑源性神经营养因子 (BDNF) 等生长因子，评估了人骨髓间充质干细胞的神经元分化能力。在这些条件下培养一天后，大约 30% 的 MSCs 显示出神经细胞形态，到第 6 天达到 70%。另一方面，免疫组织化学分析表明，分化的 MSCs 对标志物β-微管蛋白 III染色呈阳性、Nestin、NeuN、NF、γ-氨基丁酸 (GABA)、Tau 和 Nurr1，其中大约 90% 的这些细胞在诱导第 14 天表达 TUJ1 和 Nestin。此外，在一些具有胶质细胞形态的细胞中观察到 GFAP 和 GalC 呈阳性 [ 63]。

蒂奥等人。研究了通过用具有低葡萄糖含量的DMEM的细胞因子诱导培养基处理从脐带获得的人MSC的神经元分化能力。它们补充了胎牛血清 (FBS)、IBMX、视黄酸 RA、dbAMPc、神经生长因子-β (NGF- β) 和 bFGF。培养基的添加以 15% 的百分比产生神经型细胞的外观。与未分化的 MSC 相比，Nurr-1、酪氨酸羟化酶 (TH)、NSE、NF-H、NF-M、NF-L 和 GFAP 的表达水平上调。相反，多巴胺β-羟化酶的表达在分化过程中受到负调控。免疫组织化学显示分化细胞中有高水平的突触素和磷酸化 TH。从培养基中去除 IBMX 和 dbAMPc 会导致神经样细胞减少。将这些成分单独添加到生长培养基中会产生一些神经元样细胞 [ 64 ]。

贝尼特斯-金等人。通过将它们在补充有 DbAMPc 的 DMEM/F2 培养基中培养 24 小时来分化来自嗅觉上皮的人 MSC。这些分子导致细胞总数减少，携带双极和多极神经突的细胞数量增加。总之，与对照 MSCs 相比，在 DbAMPc 存在下，嗅觉神经元特异性抗 OMP 抗体染色的细胞数量增加了 10 倍，呈现双极形态，并且它们的胞体呈现圆形或椭圆形形状 [ 65 ]。

2016 年，Shahbazi等人。在毛喉素（另一种增加 cAMP 和 IBMX 水平的药物）存在下评估人脐带 CMM 的神经元分化潜能。治疗 8 小时后，在一些 MSCs 中开始观察到向神经表型的形态变化，在诱导过程后 24 小时上升。免疫组化分析和蛋白质印迹结果表明，Nestin、β-微管蛋白 III、NSE 和 GFAP 在处理过的细胞中经过 8 小时的处理后呈阳性。相比之下，MAP2 的表达在诱导后 24 小时受到赞赏。相反，在对照 MSCs 中没有观察到这些标记。此外，毛喉素/IBMX 的组合提高了 Ser133 中 CREB ​​的磷酸化，Ser133 是由 cAMP 激活的 PKA 信号传导的下游效应子，它支持高水平 cAMP 在 MSCs 神经元分化中的作用 [ 66 ]。

最近 Ayala-Grosso等人。通过在补充有 EGF 和 b-FGF 的无血清 DMEM-F12 培养基中培养细胞，从嗅上皮的人 MSCs 产生神经球。随后，这些间充质神经球解离成单个细胞，通过用 RA 和毛喉素处理，在多聚赖氨酸包被的盖玻片上分化成神经元谱系，产生表达标志物β-微管蛋白 III 和 GFAP [ 8 ] 的细胞（补充表S2 ）。

8. 染色质修饰剂

亚历山尼安等人。用 bFGF 和 EGF 处理预诱导的鼠骨髓 MSCs，用低甲基化剂 5-aza-20-deoxycytidine (5azadC) 和组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素 A (TSA) 促进这些细胞的神经诱导。随后，分化的细胞在有或没有固定神经元干细胞的神经诱导培养基中培养。与未经处理的细胞相比，用表观遗传修饰剂处理的 MSC 表现出高 Sox2 表达。此外，用神经元干细胞培养 MSC 会产生类似于对 Sox2 和 Nestin 呈阳性的神经球的组或结构，通过用染色质修饰剂预处理细胞可以增强这些组或结构。最后，结果表明，用 5azadC 和 TSA 初步处理的 MSCs 产生了β免疫阳性细胞。-微管蛋白 III 和 GFAP 在维持在神经基础环境中时与神经元和神经胶质形态具有一定的相似性，其中大约 70% 的细胞表现出神经元形态 [ 67 ]。

2010 年，该工作组通过同时将细胞暴露于 DNA 甲基化抑制剂 (RG-108)、组蛋白去乙酰化抑制剂 (TSA) 来诱导人骨髓间充质干细胞的神经元分化。这些药物增加 cAMP（8-BrAMPc 和咯利普兰）和 bFGF。实时 RT-PCR 研究表明，治疗后 24 小时，与 Oct 4 多能性、Nanog、Klf4、c Myc 和 Sox 2 相关的基因在治疗的 MSCs 中的表达水平增加。同样，神经基因 Nestin、在分化过程中，这些细胞中的 A2B5、NCAM、GFAP、NeuN、MAP2、Nurr1 和 TH 逐渐增加。同样，这些细胞可以在诱导后向培养基中释放胶质源性神经营养因子 (GDNF)、BDNF 和多巴胺 [ 68 ]。

两年后，该工作组证明，经过低氧预处理并通过先前方案分化的人骨髓 MSCs 的多巴胺能分化有所改善，因为 Nurr1 和 TH 的表达水平在诱导的 MSCs 中显着增加。它们在缺氧条件下生长，而其对应物在正常氧气条件下生长。同样，细胞增殖试验结果表明，缺氧预处理通过保护MSCs免受H 2 O 2的细胞毒性作用而提高了MSCs的增殖和活力。另一方面，ELISA 研究表明，通过在低氧水平条件下培养细胞，处理的 MSCs 中 BDNF、GDNF 和多巴胺的释放得到增强 [ 69 ]。

郑等人。比较了在这些分化条件下来自骨髓和脂肪组织的小鼠 MSCs 的分化潜能。来自脂肪组织的 MSCs在体外表现出比骨髓 MSCs 更大的增殖能力。在 7 天的神经元诱导期后，73.61% 的骨髓来源的 MSCs 呈现神经元形态细胞，而使用脂肪 MSCs，观察到 93.01% 的这些细胞。此外，在治疗后，更多的细胞对β呈阳性-tubulin III 和 ChAT 存在于经处理的源自脂肪组织的 MSCs 的培养物中，相对于骨髓 MSCs。然而，当使用骨髓间充质干细胞时，观察到更多数量的 MAP2 阳性细胞。此外，RT-PCR 和 ELISA 结果显示，与脂肪来源的骨髓间充质干细胞相比，分化的骨髓间充质干细胞中 BDNF 的表达和释放较多，但 NGF 和神经营养因子 3 (NT-3) 较少[ 70 ]。

就他们而言，Nivet等人。用 5-氮杂胞苷、NGF、BDNF 和 bFGF 处理脂肪组织人 MSC，以诱导其神经元分化。诱导后，MSCs 表现出细胞形态的变化，在神经基础环境中可持续长达 2 周。具体来说，一些细胞的细胞质向细胞核收缩，形成收缩的细胞体，细胞质延伸。与对照 MSC 相比，这些形态变化和 MAP2 和 NSE 从头表达伴随着巢蛋白表达的增加。另一方面，定量分析表明，神经元诱导一周后，85.6% 的 MSCs 对 GFAP 染色呈阳性，而 81.2% 的 MAP2 染色呈阳性 [ 30 ]。

最近在 2017 年，Fila-Danilow等人分析了组蛋白去乙酰化酶抑制剂 TSA 和丙戊酸在 bFGF 和 EGF 预处理的小鼠 MSCs 神经元分化中的作用。他们发现β -tubulin III 和 Gal-C 的表达在 MSCs 治疗 3 天后增加，但在 6 天后下降。相反，在分化过程中，这些细胞中 TH 和 VAChT 的表达逐渐增加 [ 71 ]（补充表S3）。

9. 成长因素

古德温等人。在添加了 bFGF 和 EGF 的培养基中处理人脐带和骨髓的 MSCs 7 天以进行神经元分化。处理后，脐带和骨髓间充质干细胞在形态上都采用了培养中神经细胞的一些特征，例如长的双极延伸和分支末端。此外，两种细胞群在诱导后都表达β-微管蛋白 III 和 GFAP。然而，脐带间充质干细胞仅在分化过程后才表达这些标志物，而一些骨髓间充质干细胞已经在标准生长培养基中组成性地表达这些标志物，但随着生长因子的添加它们的表达增加 [ 72 ]。

出泽等人。使用生长因子的组合来分化鼠骨髓间充质干细胞，为此他们首先通过用β - Me 和 RA 处理这些细胞三天来预诱导这些细胞。后来，它们在补充有 FBS、Forskolin、bFGF、血小板衍生生长因子 (PDGF) 和重组人 Heregulin beta1 (HRG) 的 alpha-MEM 诱导培养基中培养 7 天。相差显微镜显示，与对照 MSC 不同，MSC 在分化后采用类似于雪旺细胞的形态。免疫组织化学显示大多数分化的 MSC，但不是未分化的，对雪旺氏细胞标志物 p75、S100、GFAP 和 O4 呈阳性。相反，省略了β-Me、RA、毛喉素或 HRG 在分化方案中导致 MSC 在形态和免疫反应性方面的不完全分化 [ 52 ]。

彭等人。使用相同的方案诱导源自沃顿果冻的人类 MSCs 的神经分化。诱导后，这些细胞从扁平形状变为双极纺锤形形态并表达雪旺细胞标志物。细胞定量显示，大约 68% 的分化细胞对 GFAP 呈阳性，77% 对 p75 呈阳性，75% 对 S100 呈阳性，72% 对 MBP 呈阳性。此外，酶联免疫吸附试验和 RT-PCR 表明，分化的 MSCs 表达并分泌 BDNF、NGF 和 NT-3 到培养基中 [ 73 ]。

就他们而言，江等人。在涂有纤连蛋白和bFGF的孔中培养小鼠骨髓间充质干细胞以诱导其神经元分化。诱导 14 天后，MSCs 获得神经元和神经胶质细胞的形态学和表型特征，由它们对 NF200 (68.9%)、GFAP (15.4%) 和 Gal-C (12.3%) 的阳性定义。bFGF 培养后，与未分化的 MSC 相比，Otx2、Otx1、Pax2、Pax5、Nestin、MAP2 和 Tau 的信使 RNA 水平显着增加。另一方面，当 MSCs 依次与 bFGF、FGF-8 和 BDNF 一起培养时，观察到更成熟的神经元表型，因为大约 30% 的细胞表达多巴胺能神经元的标志物，20% 的 5-羟色胺能神经元和 50% GABAergic 神经元 [ 74 ]。

金等人。用补充有 B27、glutaMAX、FGF-2 和 EGF 的神经基础培养基处理鼠骨髓 MSCs 7 天，随后在培养基中加入 RA 和β -NGF 4 周以诱导神经分化。该协议促进处理过的细胞获得类似神经元的极性形态。这些细胞中的大多数表达成熟的神经元标记 NeuN 和 MAP2，以及一些微管相关蛋白 tau。此外，这些培养物中的细胞表达与神经元钙通道和蛋白质突触素相关的α 1A 和α 1B 钙通道亚基。最后，许多分化的 MSCs 对 GABA 和谷氨酸 NMDA 受体的 NR2A 亚基染色呈阳性 [ 75 ]。

特罗佩尔等人。使用一步协议来区分神经元中的小鼠 MSC。将细胞接种在涂有聚-D-赖氨酸的板上，并在补充有 bFGF 的 DMEM 培养基中培养 7 天。添加生长因子后两天，在 MSCs 中观察到一些短的神经突样延伸，一周后完全发育，细胞获得类似神经元的形态。然而，细胞在几天后恢复成成纤维细胞形状。免疫染色显示约 50% 的未分化细胞表达巢蛋白、12.4% NF-L 和 2% β-微管蛋白 III，而用 bFGF 治疗一周后，阳性细胞的数量分别显着增加至 94.5%、88.5% 和 65%。此外，这种神经标志物的表达与神经元的功能获取相结合，例如响应特定的神经元激动剂（如谷氨酸和藜芦定）而增加细胞溶质钙的浓度 [ 76 ]。

2007 年，Trzaska等人。使用由 SHH、FGF8 和 bFGF 组成的诱导混合物来促进骨髓来源的人 MSCs 的神经元分化。暴露于这些因子 12 天后，MSCs 出现特征性神经元形态，神经元标志物 NeuN、B-tubulin III、TH、DAT、En1、En2、Wnt1、Lmx1a、Nurr1 和 Pitx3 的表达增加，但胶质细胞没有与未处理的 MSC 相比的标记。同样，随着细胞获得有丝分裂后的神经元命运，细胞周期激活蛋白细胞周期蛋白 B、细胞周期蛋白依赖性激酶 2 和增殖细胞的核抗原的表达受到负调节。诱导的 MSCs 的神经元特征通过 K + (Kv 4.2) 离子通道基因和电压门控 Na+ (NaV)。定量分析表明，超过 90% 的处理过的 MSCs 表达 NeuN 和β-微管蛋白 III，而 68.7% 的这些细胞是 TH 阳性。同样，这些细胞能够独立于去极化合成多巴胺并将其分泌到环境中。电生理分析表明，这些细胞的静息膜电位范围为 -50 mV 至 -70 mV。然而，没有一个细胞表现出自发和诱发的动作电位。此外，虽然 MSC 衍生的神经元样细胞表达功能性 K +通道，但它们表达的电压门控 Na +和 Ca 2+水平不足通道，表明 SHH、FGF8 和 bFGF 诱导的 MSC 产生的多巴胺能细胞尚未获得完全分化神经元的特性 [ 77 ]。

2011 年，达塔等人。使用该诱导方案将人类 MSC 从脐带和骨髓中区分开来。发现在暴露于 SHH、FGF8 和 bFGF 后，两种来源的 MSC 在形态上向神经元样细胞转变，其上调β-微管蛋白 III、Nurr1 和 EN1 的表达，同时降低 Nestine 的表达，但没有显着差异它们之间。免疫组织化学显示这些分化细胞对神经元标志物β呈阳性-微管蛋白 III、Map2ab 和 Kv4.2 以及多巴胺能神经元 TH DARPP32、Nurr1、PitX3 和 VMAT2 的特异性标志物。同时，未处理的 MSCs 对这些标记没有表现出任何明显的染色。细胞定量显示，91.4% 的诱导骨髓 MSCs 和 91.84% 的脐带 MSCs 对成熟神经元标记 Map2ab 呈阳性，TH 分别为 63.98% 和 65.82%，Nurr1 分别为 62.38% 和 68.90%。就其本身而言，功能分析表明从两种来源诱导的细胞组成性地释放多巴胺，这与未经处理的 MSC 不同。ATP 刺激促进诱导的 MSCs 中这种神经递质的释放增加，无论其来源如何 [ 78 ]。

就其本身而言，用这些因子处理源自牙髓的人类 MSCs 三天，随后在补充有 B27 和 BDNF 且不含形态发生素的神经基础培养基中维持六天，会在 MSCs 中产生神经元型形态学变化，因此作为一种积极的调节在多巴胺能神经元 Nurr1、Engrailed 1 和 Pitx3 的特定转录因子的表达中，以及 Nestin、musashi12 和 HNK1 的表达减少。免疫荧光和流式细胞术分析显示，诱导的 MSCs 中多巴胺能神经元标志物阳性的细胞数量较多，其中 77% 的 MSCs 对 TH 阳性，81.92% 对 En1，81.21% 对 Nurr1，77.87% 对 Pitx3。就他们而言，功能研究表明，诱导的 MSC 在用 KCl 和 ATP 刺激后组成型分泌多巴胺。同时，未经处理的 MSCs 没有表现出这种神经递质的任何明显释放。此外，诱导的 MSCs 显示出细胞内 Ca 的流入。2+在 KCl 存在下，这在未经处理的 MSCs 中未观察到 [ 79 ]。

王等人。使用 SHH、FGF-8、GDNF 和毛喉素的混合物来诱导源自用 bFGF 和 EGF 预诱导的牙髓的人 MSCs 的神经元分化。添加 bFGF 和 EGF 后，将细胞分组为包含阳性巢蛋白祖细胞和对β-微管蛋白 III 阳性但对 TH 阴性的神经元细胞的球体。一旦将诱导剂添加到培养物中，就会产生一些具有多个表达β-微管蛋白 III 和 MAP2的神经突的神经元样细胞。大约 10% 的细胞 TH 染色呈阳性。实时 RT-PCR 分析表明，当 MSCs 在诱导培养基中培养时，Nestin 和β的转录水平-微管蛋白III与未诱导的MSC相比下调，而MAP2和TH的转录水平显着增加。此外，通过液相色谱法测试，可以检测到诱导后 MSC 培养物上清液中多巴胺的存在。同时，在非诱导的 MSCs 或球体的上清液中没有看到这种神经递质 [ 80 ]。

王等. 将小鼠骨髓间充质干细胞与三环癸烷-9-基黄原酸酯 (D609)（一种磷脂酰胆碱特异性磷脂酶 C 的特异性抑制剂）与 FGF-2 一起孵育两天，并在与 FGF-2 一起培养时保持这些细胞的神经元状态额外六天。试验表明，用 FGF-2 处理的细胞在 48 h 时细胞活力增加，凋亡指数显着低于未用 FGF-2 处理的细胞。在接下来的六天内，分化的细胞在 FGF-2 存在下显示出典型的神经元形态。然而，分化细胞的数量减少了，许多细胞在没有这种生长因子的情况下死亡。免疫组化分析表明，这些用 D609 和 FGF-2 诱导的细胞显示出 NSE、NF-L 和突触蛋白的强阳性信号以及 NSE 和 NF-L 的高 mRNA 表达水平，与未分化的 MSC 相比。同样，在诱导 48 小时后，与未分化的 MSC 相比，分化的细胞具有较低的膜电位，当随后将细胞与 FGF-2 一起培养 6 天时，其变得更加阴性。在用 D609 和 FGF-2 处理的组中，神经元分化伴随着线粒体膜电位变化的显着增加，表明线粒体超极化，以及 6 小时后 ROS 水平的降低。81 ]。

马雷等人。用 FGF2 和肝素处理脂肪组织人 MSCs 15 天以诱导其神经元分化。该协议促进了纺锤形 MSCs 的细胞形态向具有球形形态和细胞过程的细胞的变化。另一方面，转录分析表明，与对照细胞相比，诱导的 MSCs中β-微管蛋白 III、MAP2、ChAT 和 TH 的表达水平受到正向调节 [ 82 ]。

马雷斯基等人. 使用来自羊水中的人类 MSC，通过用 FGF、EGF 和神经存活因子 (NSF-1) 培养它们三周来评估它们的神经元分化。在这些条件下，细胞聚集成悬浮在培养基中的球体，然后形成粘附的团块，细胞表现出显着的过程，在用生长因子处理期间缓慢增加。培养三天后分析的神经球样浮动池对巢蛋白呈阳性，而与未处理的细胞相比，细胞角蛋白表达保持阴性，波形蛋白表达降低。同样，神经元诱导增加了 MSCs 中神经元标志物的表达。特别是，在 80% 的细胞中观察到 NSE 和 MAP2 呈阳性。电生理分析表明，未分化的 MSCs 呈现短暂的 Na +对河豚毒素 (TTX) 敏感的进入电流以及用生长因子处理促进这些电流密度增加约三倍。同样，与未处理的 MSCs 相比，在分化的细胞中发现 Na +通道亚基的表达增加 [ 83 ]。

张等人. 在补充有 bFGF 的 DMEM 培养基中从脂肪组织中分离培养的人 MSCs 7 天，同时加入毛喉素另外 7 天以诱导其神经元分化。治疗后，大多数 MSCs 表现出明显的双极或多极形态和分支过程，通过体树突标志物 MAP2 和轴突标志物 GAP43 的免疫细胞化学可视化。此外，在神经分化的 MSCs 中，观察到神经干细胞 (Nestin)、神经元 (Tuj1、MAP2、NFL、NFM、NFH、NSE 和 NeuN)、突触 (GAP43 和 SNAP25)、星形细胞 (GFAP) 标志物的免疫反应性在 bFGF 和毛喉素存在下培养时，少突胶质细胞 (CNPases) 非常高，而表达特定标志物的未分化 MSC 部分非常低。RT-PCR 分析显示编码 ABCG2、Nestin、Tuj1、MAP2、NFL、NFM、NSE、GAP43、SNAP25、GFAP 和 CNPase 的 mRNA 水平在分化的 MSC 中上调。这些细胞的功能分析表明，超过 75% 的分化 MSCs 获得了类似于神经元的功能，其特征是对 TTX 敏感的电压依赖性钠电流的可视化，向外 K+电流和负静息膜电位。通过 RT-PCR 进行更详细的检查表明，钠 (SCN5A)、钾 (MaxiK、Kv4.2 和 EAG2) 和钙通道 (CACNA1C 和 CACNA1G) 的未分化 MSCs 表达通道基因通过诱导分化显着增加。这些细胞。相比之下，Kv4.3 和 Eag1 钾通道基因和 TTX 敏感钠通道基因仅在经过分化方案的细胞中表达 [ 84 ]。

英等人。通过在补充有 EGF、bFGF 和 BDNF 的 DMEM 培养基中预培养小鼠 MSCs 三天，促进了小鼠 MSC 从脂肪组织中的神经元分化。随后加入吲哚美辛、胰岛素和 IBMX 48 小时进行诱导。处理后，MSCs 表现出细胞形态的变化，包括细胞质收缩、轴突形成、树突样细胞质投射，并分别表达神经元和胶质细胞标志物 Tuj-1 和 GFAP，在诱导前极低。定量分析表明，大约 70% 的诱导细胞对 Tuj1 呈阳性，75% 对 GFAP 呈阳性。然而，在预诱导中不存在 BDNF 将这些标记的阳性细胞数量分别减少到 45% 和 50% [ 9 ]。

2014 年，冯和合作者将脂肪组织衍生的人类 MSCs 种植在明胶涂层板中。对于神经元分化，用β - Me和bFGF预诱导细胞八天。随后，在补充有 L-谷氨酰胺、B27、N2 和β的 DMEM/F12 培养基中培养-Me 7 天，最后用 EGF 和 bFGF 再治疗 7 天。受此协议约束的 MSC 表现出与神经元干细胞相似的独特形态，在超浅盘中培养时，它们可以很容易地从背景中分离出来，并在消化后合并形成神经球。此外，与未分化细胞相比，这些培养为单层或神经球的细胞高度表达 Sox1、Pax6、Nestin 和 Vimentin。随后，他们通过将细胞接种在覆盖有聚-D-赖氨酸和层粘连蛋白的盖玻片上，在补充有 N2、FBS、马血清和 RA 的 Neurobasal 培养基中测试细胞的终末分化能力，持续两周，随后施用 BDNF 进行神经元诱导。经过两周的诱导，在神经元诱导培养基中培养的细胞显示出与神经元相似的结构和 MAP2 表达。这些细胞表现出对 TTX 敏感的电压依赖性钠电流，表现出快速开关特性。此外，钠离子通道基因（SN5A、NE-NA）、钾离子通道基因（MaxiK、KV4.3、KV4.2、KV1.4、EAG1、EAG1）和钙离子通道基因（与未分化的 MSCs 相比，终末分化的 MSCs 中 CACNA1C、CACNA1G) 增加 [85 ]。

同年，余等人。比较了在 BDNF 存在下培养时从脂肪组织、骨髓和脐带获得的人 MSCs 的神经元分化能力。诱导 7 天后，无论采集位点如何，人类 MSCs 呈现神经元样形态，而对照 MSCs 保留成纤维细胞形态。同样，用 BDNF 处理的所有 MSC 组都显示出比对照组更高水平的巢蛋白表达，它们之间没有显着差异。另一方面，与对照 MSCs 和脂肪组织诱导的 MSCs 相比，在诱导的骨髓和脐带 MSCs 中观察到更高的 ChAT 和 GAD67 表达。暴露于 BDNF 似乎促进 GABA 能神经元分化，因为 GABA +的百分比增加与脂肪组织 MSC（9.7% 对 5.3%）、骨髓（21.5% 对 8.4%）和脐带（7.0% 对 1.8%）中的对照培养物相比，在处理的 MSCs 中观察到/DAPI +细胞，分别[ 86 ]。

最近 Jahan等人。通过用 NGF 处理脐带衍生的人 MSCs 的神经元分化进行了研究。添加这种生长因子 4 天后，观察到类似于神经元类型的形态变化，例如细胞变圆和神经突样延伸的发展。与未分化的 MSC [ 87 ]相比，这些神经元样细胞在神经元标志物 NF-M、β-微管蛋白 III 和 PSD-95 的信使和蛋白质水平上显示出显着且逐渐增加的水平（补充表S4）。

10. 共培养

桑切斯-拉莫斯等人。进行了先前由RA和BDNF分化的MSC与胎儿原代神经元培养物的共培养，以增加这些细胞的神经元分化。共培养后，2% - 5% β-半乳糖苷酶标记的 MSCs 对 NeuN 染色呈阳性，5% 至 8% 对 GFAP 染色呈阳性，比单独培养 MSCs 时观察到的比例要高得多。大多数用β-半乳糖苷酶标记的GFAP +细胞具有椭圆形或梭形形态，具有与NeuN +细胞相似的短突起。然而，一些 GFAP +细胞表现出不规则的形状，类似于神经胶质细胞的形态 [ 88 ]。

乔安尼德斯等人。通过暴露于 EGF 和 FGF-2 7 天诱导骨髓衍生的人 MSCs 的神经元分化，然后用源自大鼠海马培养物的出生后星形胶质细胞条件培养基处理。加入有丝分裂原 24 小时后，观察到以细胞收缩为特征的形态变化。同时，在诱导 7 天结束时，神经标志物β的共表达-微管蛋白 III 和泛神经丝在圆形细胞亚群的胞体中很明显。去除有丝分裂原后，这些标志物的表达显着降低，同时表达与 FN 共定位的平滑肌肌动蛋白的细胞增加。然而，与没有条件培养基的处理相比，用星形胶质细胞条件培养基处理分化细胞促进表达神经丝和β-微管蛋白III的细胞数量增加，并下调这些细胞中的纤连蛋白。此外，这些阳性β-微管蛋白 III 细胞显示出比仅用有丝分裂原处理的细胞更精细的过程 [ 89 ]。

傅等. 在神经元条件培养基中使用脐带衍生的人类 MSCs，观察到 MSCs 在第 12 天获得类似神经元的形态。在 MSCs 中产生的过程过长并形成细胞-细胞接触，形成网络外观。同样，与未处理的 MSC 相比，这些神经元样细胞显示 NeuN 和 NF 的表达增加。定量研究表明，在共培养的第 9 天，分别有 58.2% 和 87.4% 的 MSCs 对神经元标记 NeuN 和 NF 染色呈阳性。相比之下，GFAP 和 OX42 分别只有 1.95% 和 1.77% 这样做。此外，用条件培养基处理会在一些 MSC 中诱导功能性钙结合蛋白的表达，例如小白蛋白和钙结合蛋白。最后，红藻氨酸受体亚基，包括 GluR6、GluR7 和 KA2，90 ]。

该工作组通过用神经元条件培养基处理 9 天，诱导从沃顿明胶中分离出来的人类 MSCs在体外转化为多巴胺能神经元，随后再暴露于 SHH 和 FGF8 12 天。免疫细胞化学染色表明，用该方案处理的 MSCs 为 TH 阳性，成功率为 12.7%，能够合成多巴胺并将其释放到培养基中。另一方面，对酶谷氨酸脱羧酶的染色表明，除了多巴胺能神经元外，暴露于条件培养基和形态发生素的 MSCs 在低产量的 GABA 能细胞中分化 [ 91 ]。

祖里塔等人。比较了小鼠骨髓间充质干细胞的分化效率，采用基于使用β -Me 作为前诱导剂和 DMSO、BHA、KCl、丙戊酸和毛喉素作为诱导剂的化学方案，以及基于共培养的方法具有雪旺细胞的 MSC。开始化学诱导一小时后，大约 30% 的 MSC 显示出巢蛋白阳性，该百分比在四小时时增加 (64%)，同时显示出与神经元细胞相关的形态变化。化学诱导开始一周后，79.9% 的 MSCs 呈 NSE 阳性，85.3% 的 NF-200 呈阳性，β为 86.2%-微管蛋白III。就其本身而言，观察到共培养诱导晚期神经元分化，因为尽管 MSC 在共培养 4 小时后开始表达巢蛋白，但大多数 MSC 需要大约一周才能显示典型的神经元形态。然而，此时，神经元样细胞不再表达巢蛋白，但对 NSE (60%)、NF-200 (52%) 和β-微管蛋白 III (34%) 呈阳性 [ 92 ]。

由于不能排除细胞融合是在雪旺细胞中培养的 MSC 明显转分化的原因，因此这些作者在聚碳酸酯膜的存在下进行了骨髓 MSC 和雪旺细胞的共培养，以防止这些细胞之间的直接接触。在这些条件下，MSC 在开始共培养 4 小时后表达 Nestin。在 72 小时显示神经元标志物如 NF-200、β-微管蛋白 III 或 GFAP 的强烈表达，在治疗的第二周期间增加。在第二周结束时，大多数 MSCs 显示出清晰的神经元形态，约 9% 的 MSCs 对 Nestin 呈阳性，NF-200 为 39%，β - tubulin III 为 43.2%，而只有 20.4% 的细胞呈阳性对于 GFAP [ 93 ]。

就他们而言，Krampera等人., 将不同来源的 MSCs 与雪旺细胞共培养，以诱导其神经元分化。共培养 12 天后，一部分 MSCs 获得了雪旺细胞的形态特征和标志物 S-100 和 PMP-22 的选择性表达。这些细胞的比例取决于 MSCs 的来源。来自脂肪组织的 MSC 在共培养 7 天后显示出最高百分比的细胞获得雪旺细胞表型。这一比例明显低于胸腺、脾脏，特别是骨髓的 MSCs。另一方面，在本研究中，观察到雪旺细胞与 MSCs 之间的直接接触对于诱导 MSCs 的形态和表型变化是必要的，因为用细胞培养上清液施万氏处理MSC不会产生上述效果。最后，坎普雷拉等人。表明在共培养之前对雪旺细胞进行照射不会改变分化的 MSCs 的比例，因此排除了细胞融合在 MSCs 表达神经胶质标志物中的重要作用 [ 94 ]。

威斯莱特等人。通过EGF处理产生巢蛋白阳性小鼠骨髓间充质干细胞。随后，Nestin 阳性 MSC 在条件培养基中与小鼠小脑颗粒的神经元共培养，以诱导其终末分化。共培养 5 天后，40.17% 的 MSCs 对 GFAP 染色呈阳性，Tuj1 染色为 19%，NeuN 染色为 19.30%。然而，在共培养 Nestin 阴性 MSCs 或 Nestin 阳性 MSCs、培养的物理间隔神经元时，无法检测到这些神经元标记。电生理学分析表明，神经元样细胞在共培养 10 天时的静息膜电位为 -55.7 mV，并且这些细胞在分化的早期表达功能性电压门控 K +通道，随后出现电压门控 Na+通道，允许它们触发动作电位，这与控制 MSC 不同。最后，研究表明，这些分化的细胞可以通过诱发被其各自受体的特定拮抗剂可逆阻断的电流来对各种神经递质（如 GABA、甘氨酸和谷氨酸）作出反应 [ 95 ]。

尼维特等人。证明将来自嗅觉上皮的人 MSCs 与小鼠海马切片共培养为这些细胞的体外神经元分化提供了合适的环境，因为在移植后三周，在海马的器官型培养物上观察到存活的 MSCs，其中一些显示类似于中间神经元的形态，表达 MAP2，但不表达 GFAP [ 30 ]。

最近，Lo Furno等人。通过用从嗅包膜细胞或雪旺细胞培养物中获得的条件培养基处理人类 MSCs 7 天，诱导脂肪组织中的人 MSCs 的神经元分化。在这些条件下生长的 MSC 比单独生长的 MSC 具有更复杂的形态。同样，这些细胞对 Nestin、MAP2 和 Synapsin 的免疫反应性高于对照 MSC。特别是，相对于施万细胞条件培养基，当使用嗅觉包膜细胞条件培养基时，检测到 MAP 2 阳性的增加更为显着。对于胶质细胞分化，GFAP 的免疫阳性在对照中相对较低，但在用条件培养基处理的细胞中显着增加，特别是在使用源自雪旺细胞的培养基时[96 ]。

最后，在 2019 年，Wei等人. 用雪旺氏细胞条件培养基培养骨髓来源的小鼠 MSCs 以诱导神经元分化。用培养基处理后，随着细胞体逐渐缩小和神经突形成，MSCs 的形状变为神经元样形态。此外，在神经元样细胞中检测到巢蛋白和 MAP2 标记的增加。microRNA分析鉴定了共培养组和对照组之间显着差异表达的83个microRNA，其中基因本体分析表明microRNA靶基因的富集对于神经元投射的发展、轴突发生的调控以及在条件培养基培养的 MSCs 中增殖。此外，对 KEGG 通路的分析表明，Hippo、Wnt、97 ]（补充表S5）。

11. 基因转染

将针对 notch-1 (mNotch-1shRNA) 的小干扰 RNA (siRNA) 转染到 CMM 中。当在补充有 RA 和 BDNF 的 Neurobasal 培养基中培养六天时，诱导其神经元分化。转染 24 h 后，MSCs 中 mRNA Notch-1 的 MTT 测定值下降，远低于未转染的 MSCs。同样，转染的 MSC 中的凋亡细胞比对照 CMM 中的要多。另一方面，单独转染mNotch-1shRNA不足以诱导神经细胞中MSCs的分化。然而，在用 RA 和 BDNF 诱导后，转染的 MSCs 发生了显着的形态变化，在诱导后 24 小时，这些细胞的细胞质收缩并以突起的形式呈现延伸，并在接下来的 6 天内得到改善。同样地，诱导后mNotch-1shRNA MSCs中NSE和NF200的表达升高至高水平。相比之下，与未转染的诱导 MSCs 相比，该组 GFAP 的表达降低[98 ]。

2008 年，Trzaska等人. 寻求改善 2007 年获得的神经元分化，转染针对 REST 的 RNAip，这是一种转录调节因子，可在使用 SHH、FGF-8 进行分化之前沉默非神经元细胞和神经元祖细胞中成熟神经元特定基因的表达，和 bFGF。在诱导第 6 天和第 12 天拍摄的明场图像显示，与对照转染细胞相比，REST 敲低细胞的表型更为成熟。此外，REST 蛋白的缺失允许 TH、NeuN、Pitx3 和 Nurr1 的更高表达，以及来自 MSCs 的神经元细胞中 NaV 蛋白水平的增加。另一方面，99 ]。

杨等人。使用慢病毒载体递送针对 REST1 (siREST) 或阴性对照 (siControl) 的 siRNA，以将人骨髓间充质干细胞分化为神经元表型。转染 14 天后，大多数 siREST MSCs 表现出类似神经元的形态变化，其结构相当于长神经突和 Nissl 小体，但在 siControl MSCs 中没有。细胞增殖分析显示MSC-siREST比MSC-siControl生长慢，表明MSC-siREST处于分化阶段。RT-PCR 分析显示，在转染 14 天时，MSC-siREST 增加了神经元基因 BDNF、NGN-1、NSE、SYP 和 SCG10 的表达水平，而在 CMM 中检测不到这些基因的表达-siControl。同样，这些细胞对β染色呈阳性-微管蛋白 III、NSE、MAP-2 和 NF-200，未标记胶质标记物 GFAP 和 Olig2。最后，这些神经元样细胞显示出对 TTX 敏感的 NA (+) 电流和动作电位，这在 MSC-siControl 中未观察到，它仅呈现向外的 K +电流 [ 100 ]。

巴兹莱等. 在用 FGF-2 FGF-8 和 SHH 分化之前，使用慢病毒基因的传递将同源框一β LIM (LMX1b) 转录因子外源地施用给骨髓 MSC。在诱导前，LMX1a 转染的 MSC 中典型中脑多巴胺能基因（如 MSX1、Sox2、Neurogenin 2、hASH1、En1 或 Pitx3）的转录本表达水平未观察到变化，类似于用 GFP 对照转染的 MSX。然而，经过三周的诱导，与对照 MSC 相比，LMX1a MSC 中大量的这些因子被上调。此外，分化后，与未分化 MSCs 中 Tuj1 表达的基线水平相比，超过 90% 的 LMX1a MSCs 表达 Tuj1。一些分化的 LMX1a MSCs 对 MAP2 和突触蛋白染色呈阳性，还有一些表达神经元典型的电压门控钠通道。另一方面，诱导后 LMX1a MSCs 对 TH 蛋白的正向调节明显高于转染的对照 MSCs，这使得 LMX1a MSCs 向培养基中分泌的多巴胺是诱导后的对照 MSCs 的 3 倍。101 ]。

就他们而言，2013 年，Yan等人。通过暴露于β -Me、RA、bFGF、FGF-8 和 SHH，在 MSCs 神经分化前诱导 LMX1a 和 Neurturin 的异位表达。诱导 21 天后，转染和诱导的 MSCs 中 TH、Msx-1、Nestin、MAP-2、Lmx1 β、Fox α 2、Pitx3、DAT、β -tubulin III、Nurr1 和 EN1 的转录水平显着上调，与对照诱导和转染的 MSCs 相比，免疫荧光分析在蛋白质水平上证实了这一点，结果显示转染的 MSCs 中 NSE、MAP-2、β-微管蛋白 III 和 TH 的染色与对照 MSCs 不同 [ 102 ]。

同年，王等人。在用β -Me进行神经元分化之前，用针对 Caveolin 1 的 siRNA 转染小鼠骨髓 MSC 。单独转染不会在 MSCs 中产生显着的形态变化。然而，在转染过程后，这些细胞中 Notch-1、Notch 细胞内结构域 (NICD) 和 Hes5 的水平显着下调。用β -Me 处理后，大多数细胞在诱导六天时呈现典型的神经元外观。与其他测试不同，在本研究中，加入β-Me 在 mRNA 水平和蛋白质和 NSE 上产生 Map2 的表达。这些对形态和神经元蛋白表达的影响在转染组中增加。此外，在诱导 6 小时后，caveolin-1 的表达在转染和对照 MSC 中均受到正向调节。同时，Notch-1、NICD 和 Hes5 的水平显着下降，特别是在转染 siRNA CAv1 的组中[ 103 ]。

Park 及其同事使用两步法将人类 MSC 分化为运动神经元。首先，通过病毒载体递送促进了 MSCs 中 Olig2 和/Hb9 基因的异位表达，然后用β处理这些细胞-Me、forskolin、RA、bFGF 和 SHH 的差异化。与未处理的细胞相比，用这些因子处理显着增加了转染和未转染细胞中的 NF-M mRNA 水平。然而，运动神经元标志物 Islet-1 和 VAChT 的 mRNA 只有在转染细胞被诱导时才会增加。暴露于诱导培养基 9 天后，大约 32% 的转染细胞采用神经元样形态，其中 18% 甚至在去除诱导培养基两天后仍保持神经元形态。电生理测定表明，用诱导培养基转染和处理的细胞的静息膜电位比转染的非诱导 MSCs 更负。超过一半的这些细胞表现出诱发动作电位。此外，在体外，就像运动神经元一样 [ 104 ]。

人 MSCs 的分化通过 NICD 的基因转染诱导，然后在补充有毛喉素、bFGF 和睫状神经营养因子 (CNTF)的α -MEM 培养基中培养。转染后，与未转染的 MSCs 相比，MSCs 显示出增加的谷氨酸转运蛋白 GLAST 和 Nestin 表达。诱导后 5 天，转染和诱导的 MSC 表现出神经元样过程并表达神经元标志物 MAP-2ab、NF-M 和β-微管蛋白 III。免疫组化检测显示，超过 90% 的转染 MSCs 对 MAP-2ab 染色呈阳性，其中 89.4% 对 NF-M 和β也呈阳性染色-分化后的微管蛋白III，而未检测到GFAP细胞。电生理分析表明，转染和诱导的 MSCs 比对照转染的 MSCs 具有更负的静息膜电位。在 58% 的转染和营养因子处理的 MSC 中，整流钾电流增加，但快速电压门控钠电流没有增加。最后，与没有 GDNF 的转染和诱导的 MSC（3.9%）相比，向这些细胞中添加 GDNF 增加了 Nurr-1、Lmx1b、En1、Ptx3 的表达，并增加了 TH 免疫阳性细胞的比例（41.0%），其中使它们能够合成多巴胺并将其分泌到培养基中以响应去极化刺激 [ 105 ]。

2015 年，刘等人。将人 BDNF 基因转染到豚鼠来源的 MSCs 中，并用 RA 处理它们以进行神经元分化。用 RA 培养 48 h 后，转染的 MSCs 的活力大于诱导或非诱导的未转染的 MSCs。与未处理的MSC相比，转染并暴露于RA的所述细胞具有类似于神经元的形态。免疫组织化学和 RT-PCR 分析表明，与未转染的 MSCs 相比，转染的 MSCs 表达更高水平的巢蛋白、BDNF、NSE 和 GFAP，无论它们是否接受 RA 治疗。然而，在经过分化的转染 MSCs 中检测到更多的巢蛋白、NSE 和 GFAP 共染色阳性细胞比未诱导的细胞多 [ 106 ]（补充表S6)。

12. 微 RNA

静等人。用含有 microRNA-9 序列的病毒载体转染小鼠骨髓 MSCs，然后通过暴露于β -Me 将 MSCs 诱导成神经元。原则上，受感染的 MSCs 的存活率低于转染空载体的组，但在诱导后，转染的 MSCs 在 RNA 和蛋白质水平上均显示出更高水平的 MAP2，以及诱导细胞的 Notch1 表达较低无需转染 [ 107 ]。

就他们而言，Wu等人。分析了mir-125-b在小鼠骨髓间充质干细胞神经元转分化中的作用。他们用模拟 miR-125b（模拟）、抗 miR-125b（组抑制剂）转染它们，或者在用β -Me 分化之前不转染。正如预期的那样，miR-125b 的相对折叠在 Mimic 组中显着增加，但在 Inhibitor 组中显着降低。神经元分化，诱导六天，增加β水平与未处理组的信使和蛋白质相比，三个实验组的信使和蛋白质水平的微管蛋白 III、MAP-2、NF、NSE、GFAP 和巢蛋白。然而，与未转染的β -Me 组相比，这些标志物的 mRNA 相对定量在 Mimic 组中显着增加，但在抑制剂组中显着降低。此外，模拟组诱导的MSCs对于未转染的细胞获得了更类似于神经细胞的形态。相比之下，在抑制剂组中，形态变化不那么明显，仅发生在少数细胞中 [ 108 ]。

段等人。用含有 miR-29a 抑制剂的慢病毒感染 MSC，然后用β - Me、DMSO 和 BHA 诱导，发现 mir-29a 的下降促进了 REST 表达水平的增加。与未转染诱导的 CMM 相比，SNAP25、L1CAM 和神经元标记 NES 和 Tau 减少。另一方面，通过用针对 REST 的 siRNA 处理这些细胞，NSE 和 Tau 的表达得以挽救，这表明 miR-29a 通过靶向诱导的 MSCs 中的 REST 来调节神经源性标志物[ 109 ]。

另一方面，韩等人。发现在将 MSCs 暴露于这些诱导因子后，miRNA let-7f-5p 的表达受到负调控，而Par3/Par6/aPKC 复合物的成分Par6 α的表达增加。同样，计算机分析和荧光素酶测定表明 Par6 α是 let-7f-5p 的靶基因。使用功能增益和损失方法证明 Par6 α和 MAP2 表达与分化过程中的 let-7f-5p 水平呈负相关。另一方面，Par6 α的沉默使用 siRNA 通过降低 MAP-2 的水平来减弱 MSC 的神经元分化，这表明抑制 let-7f-5p 通过直接靶向 Par6 α促进神经元样细胞中的 MSC 诱导[ 110 ]。

武田和徐用源自神经元细胞系 PC12 细胞的外泌体处理 MSCs 一周，以测试它们的诱导能力。所述外泌体是从用NGF分化的不同阶段的PC12细胞中分离出来的，将未分化PC12细胞的外泌体称为“外泌体D0”，将用NGF处理3天和9天的PC12细胞的外泌体分别称为“D3”和“D9” . 另一方面，作为对照，MSCs 用源自 B16-F10 黑色素瘤细胞系的外泌体处理。在用源自 PC12 细胞系的外泌体处理后，MSCs 呈现神经突样延伸，这在未经处理的 MSCs 或用 B16-F10 外泌体处理的情况下未观察到。同样，在用外泌体 D3 和 D9 处理后，MAP2 和 NSE 的表达受到正向调节。

来自 PC12 细胞系的外泌体用于评估外泌体中所含 miRNA 促进的可能分化机制。与 B16-F10 细胞的外泌体相比，使用微阵列的外泌体样本中有 101 个 miRNA，其中 9 个在用 NGF 处理后呈正向调节。特别是 miR-125b 在 D9 外泌体中的表达是 B16-F10 外泌体的 319 倍，这表明该 miRNA 与神经细胞外泌体的其他成分一起可能在MSCs 中的神经元标志物。相反，源自 B16-F10 细胞的外泌体和外泌体 D0 不会导致这些标志物的表达水平发生变化 [ 111 ]。

13. 小分子

2017 年，Alexanian等人。使用他们的 2010 年分化方案与小分子 SB431542 和 dorsomorphin (DM)，这两种特异性 SMAD 抑制剂分别抑制激活素/节点/TGF- β信号通路骨形态发生蛋白 (BMP)，以诱导人 MSCs 的神经元分化。诱导三周后，MSCs 的各种神经元基因如 Sox2、Map2、β-微管蛋白 III、NSE、Nurr-1、ChAT、TH、NF、VGLUT1、SYP、SYN-1、VGAT、GAD67 和 PITX3，相对于未处理的 MSC。大约 95% 的经过分化的总细胞呈现神经元形态，而其余的虽然呈现成纤维细胞形态，但仍表达几种神经标志物。特定神经元标记阳性的细胞计数表明，大约 68.05% 的细胞染色 TH，89.12% 染色 Nurr1，11.03% 染色 ChAT。突触素免疫染色揭示了分化细胞之间形成的突触样结构 [ 112 ]。

小分子介导的激活素/淋巴结/TGF- β和 BMP 信号通路的双重抑制在 MSCs 暴露 14 天后诱导神经突向外生长。它促进 Pax6 转录因子和 Sox1 的表达增加以及 NF200、NES 和β-微管蛋白 III 的表达。该过程与 p38、Erk1/2、PI3K 和 Akt 信号传导的激活相关，因为在受到双重抑制的细胞中发现 Erk、PI3K 和 Akt 的磷酸化增强。三年后，Madhu等人. 使用这两种小分子而不添加任何其他因子作为源自脂肪组织的人MSC的神经元分化的诱导剂。NSE 的存在进一步证实了在第 14 天在用抑制剂处理的细胞中诱导了神经元表型，其中超过 85% 的用 SB 和 DM 处理的 MSCs 对该神经元标记物染色呈阳性 [ 113 ]。

J. Park等人. 开发了一种最佳方案，用于在神经元干细胞样细胞中诱导脂肪组织衍生的人 MSCs，使用小分子的效率超过 85%。为此，他们用三种 BMP 信号通路抑制剂：SB431542、noggin 和 LDN193289 对 bFGF 预诱导的 MSCs 处理 8 天。随后将这些细胞在含有抗坏血酸、B27 和 N2 的 Neurobasal 培养基中培养 5 天，最后用补充有 EGF 和 bFGF 的培养基再更换 7 天。qRT-PCR 分析显示，在小分子存在下培养的 MSCs 中，标记巢蛋白、Sox1、Sox2、Pax6、Musashi1、波形蛋白、EMX1、Gli3、FoxG1、Tuj1 和 Olig 2 的表达水平显着增加。到 CMM 而不添加这些。这些细胞在悬浮培养中作为神经球生长。流式细胞仪分析显示，NCAM、Nestin和Ki67阳性细胞比例分别为85.4%、92.9%和76.8%。随后，这些作者将部分分化的细胞接种在由 Purmorphamin（SHH 激活剂）和 BDNF 组成的神经元诱导培养基中，以支持这些细胞的成熟。培养 7 天后，细胞表现出神经元样结构，其特征是在其细胞体外围具有独特的双极或多极神经突生长。qRT-PCR 分析显示，在添加这些因子 7 天后，细胞显示 TuJ1、MAP2、Dlx5、Lhx6、GAD67 和钠离子通道 SCN5A 的表达水平增加。

相比之下，只有 33% 的细胞表达星形胶质细胞标志物 GFAP 和 S100，17% 的少突胶质细胞 OLIG2。这些细胞的电生理测试表明，神经元样细胞成功地引发了动作电位。一些细胞在超极化电流注入产生的膜电压中表现出去极化下降。此外，在记录的细胞中检测到自发的突触后电流，表明这些细胞通过突触连接并形成神经网络。最后，结果表明，用 dbAMPc 和 BDNF 处理暴露于小分子的 MSCs 14 天可促进与 GABA 能神经元相关的基因（如 GABRA2、GABRA5、vGat 和 GAD65）的表达水平显着增加，而免疫染色显示 67% MAP2 阳性神经元样细胞也表达 GAD 和 47% 的 MAP2 和 GABA 双重染色。114 ]。

2019年胡等人。使用 ROCK 激酶抑制剂 Fasudil 将小鼠 MSCs 与 bFGF 预处理的骨髓区分开来。小分子诱导与神经元相对应的 MSCs 的形态变化。间充质干细胞从梭形收缩为圆形，具有细长的过程，形成网络并与其他细胞接触。与对照组相比，这些神经元样细胞在神经元标记 NSE、巢蛋白和 NF-M 的信使和蛋白质水平上增加。定量分析表明，免疫荧光染色的平均阳性率为NF-M 69.35%，NSE 76.52%，nestin 78.95%。法舒地尔的分化作用被 Wnt/ β抑制剂部分抑制-catenin 途径（XAV939），表明法舒地尔促进的分化可能是由于该途径的激活[ 115 ]。

14. 视黄酸

桑切斯-拉莫斯等人。通过将人脐带间充质干细胞暴露于 NGF 和 RA（一种作为视黄酸受体配体的小分子）来进行人脐带间充质干细胞的神经元分化。用这种分子处理可促进神经标志物 Musashi-1、β-微管蛋白 III、多效素、Nestin、Necdin、NeuN 和 GFAP 的表达增加，这些标志物在未分化的 MSCs 中表达水平相对较低。免疫组织化学分析显示，6.2% 的诱导细胞对 Musashi-1 染色呈阳性，18.7% 对β-微管蛋白 III，GFAP 为 66.2%。伴随着这些标志物的表达增加，与血细胞系发育相关的基因的表达减少。DNA 微阵列分析表明，在存在 RA 和 NGF 的情况下生长的 MSC 在 DNA 芯片上代表的总共 12,600 个人类基因中的 322 个基因的表达表现出显着变化。至少 20 种可以与发育中的神经元、神经胶质或神经细胞中的产物结合 [ 116 ]。

洛卡特利等人。通过用 bFGF 和 EGF 处理诱导小鼠骨髓 MSC 形成球体，类似于大脑的神经球，其中 90% 对巢蛋白呈阳性。然后对这些球体进行免疫磁性选择以分离 Sca-1 和 Thy-1 阳性细胞，用 RA 和 SHH 分化 7 天。诱导后，这些细胞呈现出具有长胞质突起的极化形式（单极或双极）。大约 40% 对β-微管蛋白 III 和 NF 表现出免疫反应性，同时在 NF 轻链水平表达β-微管蛋白 III、NSE 和 mRNA [ 117 ]。

此外，小鼠骨髓 CMM 在补充有 FBS、FGF2、B27、毛喉素和 IBMX 的 DMEM 预诱导培养基中处理 24 小时，然后在补充有 FGF2、胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂的 DMEM 培养基中诱导其分化， B27、毛喉素、IBMX 和 BDNF。最后，将细胞暴露于 SHH 和 RA 的组合以改善神经元分化。在用 SHH 和 RA 治疗后，观察到具有神经元形态的细胞显着增加。MSCs 显示出多种神经元抗原，包括 MAP2、TUJ1、Tau、NSE、NeuN 和 NF，它们会增加谷氨酸转运蛋白 VGLUT1 和 VGLUT2、GluR3 和 GluR4 受体的表达。应该注意的是，单独应用 SHH 或 RA 对这些标志物的表达几乎没有影响或没有影响 [ 118]。

乔等人。用单剂量的 RA 处理人骨髓 MSC，在暴露的第 7 天产生具有神经元形态的 MSC。在这个时间点，处理过的细胞对 MAP2 显示出高阳性，对突触素显示出轻微的荧光，这种荧光在处理的第 12 天增加。此外，这种处理会产生 80% 的细胞对神经丝、MAP2 和巢蛋白呈阳性标记，并且大部分经历分化的细胞会产生动作电位 [ 119 ]。

赫尔曼等人。通过用 EGF 和 FGF-2 处理，从骨髓供体年轻（18 - 35 岁）和老年（45 - 76 岁）的人骨髓间充质干细胞中产生球体，在补充有 RA 的神经基础培养基中分化。这项研究表明，在诱导老年供体的 MSCs 分化后，超过 80% 的纤维连接蛋白 (FN) 保持阳性，而未观察到 MAP2、GalC 或 GFAP 的表达。此外，只有 33% 的细胞对β-微管蛋白 III 染色呈阳性，而 12% 的细胞对巢蛋白染色呈阳性。相比之下，来自年轻供体的处理细胞中有 42% 为β-微管蛋白 III 阳性、6% MAP2 阳性、13% GFAP 阳性和 15% GalC 阳性 [ 120]。同样，这些作者证明了用 RA 处理的神经球可以通过在培养基中添加 BDNF 14 天来进行终末神经元分化。这种修饰导致 MSC、NEUROD1、NGN2 和 OTX1 中 FN 表达水平降低，同时上调早期神经外胚层基因 MSI1 的表达。此外，该方案导致成熟的神经元表型，表现为 MAP2ab 在约 6% 的细胞中表达，TUBB4/III、SNCA 和 TH 增加，以及 GFAP 和 MBP 表达增加 [ 121 ]。

龚等人. 使用 RA 作为小鼠骨髓 MSCs 神经元分化的预诱导剂 24 小时，然后在由补充有 DMSO、丁基羟基茴香醚、KCl、丙戊酸、毛喉素、氢化可的松和胰岛素的 DMEM/F12 培养基组成的分化培养基中培养它们24 小时。诱导后，MSCs 转变为神经样细胞，表现出不同的神经元形态，包括广泛分支的单极、大极和多极、双极外观。经RA预处理的MSCs的神经元分化率为83.17%，明显高于未经预处理的MSCs（61.31%）。同样，预诱导的 MSC 衍生的神经型细胞表现出更长的轴突长度和更多的神经突。巢蛋白、NSE、MAP-2、Tau 和 Tuj1 标记的 mRNA 和蛋白质水平在预诱导细胞中均较高。电生理分析表明，与未诱导的细胞相比，未经 RA 处理的 MSC 衍生的神经型细胞在神经元诱导后发生超极化。然而，在用小分子处理的细胞中观察到更显着的效果。另一方面，在高浓度 K 刺激后+，与未分化细胞相比，诱导细胞中的细胞内钙浓度增加更显着。同时，通过用 RA 预处理细胞可以增强这种效果 [ 122 ]。

王等人。表明 RA 可以诱导骨髓来源的小鼠 MSCs 的有效神经型分化。随着神经元样细胞的产生，神经元特异性标志物如 NSE、NF-H、β-微管蛋白和 MAP-2 的表达增加，RA 治疗后这些细胞的静息膜电位逐渐降低。此外，这些作者发现，在 RA 诱导的 MSCs 神经型分化过程中，心肌素相关转录因子 A (MRTF-A) 被激活并转移至细胞核。同时，MRTF-A 的下降显着阻止了响应 RA 的神经元特异性基因表达的上调，部分抑制了这些细胞的分化 [ 123 ]。

高等人。用 RA 诱导鸡胚卵黄囊来源的 MSCs 神经元分化，观察到诱导过程后，一些细胞表现出细长的神经元形态，过程延长，以及 Nestin 和 Map 的表达增加-2，在未分化的 MSC [ 124 ]中以缺陷水平表达。

最近卢等人。通过添加EGF、牛磺酸和RA 10天，诱导来自嗅粘膜的人MSCs分化为感光细胞。用这些因子进行处理会导致源自嗅粘膜的细胞的细胞形态发生重大变化，其中一些细胞呈球形、扩大的凸起，以及存在初级和次级分支。免疫荧光染色和蛋白质印迹分析表明存在视紫红质蛋白，这是表达诱导光感受器的细胞的阳性标志物 [ 125 ]（补充表S7）。

15. 多重分化协议的优缺点

最佳分化方法的选择必须以特定方式进行，考虑到几个因素，例如价格和用于诱导分化过程的细胞的内在特征。所审查的不同方法在分化效率、成熟度、神经元标记表达、功能和细胞存活方面存在相当大的差异。然而，每个程序都呈现出一系列相互比较的有利和不利特征。表 1总结了每种微分方法的优缺点。

电感器

优点

缺点

化合物

1. 诱导细胞迅速转变为神经元形态（在几分钟或几小时内）。

2. 使用的电感器通常在大多数实验室都可以买到。

1. 大多数协议都需要一个预诱导步骤和一个诱导步骤。

2. 一些神经元标志物的表达。一些在未分化的 MSC 中在基线处表达。

3.观察到的形态变化可能是由毒性或细胞应激产生的，而不是分化过程。

4. 大多数使用化学物质作为诱导剂的研究显示了对形态变化的有效性，但对神经元标志物的免疫染色无效。

生长因子

1. 它们产生有效的分化，通过神经元标记的免疫荧光显示。

2. 这些因素的诱导与内源性诱导非常相似。

3.一些协议产生具有神经元特征的表型和电生理特性的成熟神经元。

1.与其他方法相比，它的获取成本更高。

2. 有效诱导通常需要各种生长因子的混合物。

3. 需要较长的曝光时间才能观察到最初的形态变化。

表 1。用于促进 MSCs 神经分化的多种分化方案的优缺点。

16. 结论

间充质干细胞分化成神经谱系的能力使它们成为在细胞治疗和再生医学领域产生新进展的有希望和潜在的工具。本综述总结并比较了多种诱导这种分化的有效方法。然而，差异可能因收集地点、使用的方法、生理状态和被隔离的个体年龄而异。需要当前的研究和程序来提供新的见解，以便更好地理解，从而帮助开发和设计治疗神经和神经退行性疾病的新疗法。

电感器

间充质干细胞的起源

脚步

时间

报告的分化百分比

用于展示差异化的技术

功能演示

参考

β-Me

成人骨髓

在 DMEM/SFB 培养基 20% 和β- Me 1 mM中预诱导24 小时。随后用β-Me 10 mM 诱导。

5个小时

50% 表现为神经元性质的形态学变化（细胞质收缩、神经突延伸、次级分支）。

显微镜下观察神经元形态。RT-PCR检测NF-M和NSE表达增加。NSE免疫染色。

不

[54]

β-Me 和 RA。

成人骨髓

DMEM/SFB 培养基中的预诱导 20%，β-Me 10-3M 和 RA 5 × 10-7M 每 24 小时。随后通过血清消耗进行诱导。

5个小时

NeuN 和β-微管蛋白 III的阳性免疫荧光显示 98% 。

在显微镜下观察神经元形态。通过 RT-PCR，Novo de Tau 和 NF-H 的表达以及 NSE 和 NeuN 的表达增加。WB 诱导后增加巢蛋白、NSE、NeuN 和 Tuj-1。对 NSE 进行免疫染色， NeuN 和 Tuj1。

膜片钳证明存在 Na+电流和 K+后处理电流。当用谷氨酸或钾 (K+) 攻击时，增加细胞内 Ca2+浓度。

[56]

β-Me

成年人的脂肪组织

在 DMEM/SFB 培养基 20% 和β- Me 1 mM中预诱导24 小时。随后用β-Me 10 mM 诱导。

9 小时

70% 表现为神经元性质的形态变化。

在显微镜下观察神经元形态。通过RT-PCR增加NSE、NeuN和nestin的表达。对NSE进行免疫染色。每WB增加NSE。

不

[55]

β-Me

成年 Sprague Dawley 大鼠的骨髓。

在 DMEM/SFB 培养基 20% 和β- Me 1 mM中预诱导24 小时。随后用β-Me 10 mM 诱导。

3小时

40% 表现为神经元性质的形态变化。

显微镜下观察神经元形态。RT-PCR检测Map2、Nefl、Tau和Nestin表达增加。nestin、tuj1、Nef和Flk免疫染色阳性。

不

[57]

β-Me

成年 Sprague Dawley 大鼠的骨髓

在 DMEM/SFB 培养基 20% 和β- Me 1 mM中预诱导24 小时。随后用β-Me 5 mM 进行诱导。

5个小时

70% 表现为神经元性质的形态变化。

在显微镜下观察神经元形态。通过 WBImmunostaining 对 NSE 进行 NSE 和巢蛋白的增加以及 Notch1 和 Hes1 的减少。

不

[7]

表 S1。使用抗氧化剂诱导 MSCs 神经元分化的出版物分类。

电感器

间充质干细胞的起源

脚步

时间

报告的分化百分比

用于展示差异化的技术

功能演示

参考

异丁基甲基黄嘌呤和环状 AMP 二丁酰基

成人骨髓

使用 IBMX 0.5 mM/dbcAMP 1 mM 进行诱导。

6天

25% 表现为神经元性质的形态变化。

在显微镜下观察神经元形态。

每个 WB 的 NSE 增加。

不

[61]

IBMX、消炎痛和胰岛素。

成年人的脂肪组织。

用 5 g/ml 胰岛素、200 M 消炎痛和 0.5 mM 异丁基甲基黄嘌呤进行诱导。

14天

25% 表现为神经元性质的形态变化。

在显微镜下观察神经元形态。

WB 增加 NSE 和 trk-A。

NSE、trk-A 和 NeuN 的免疫染色

由膜片钳证明存在电压门控外部电流和晚期整流器 K+电流。

[62]

表 S2。使用增加 cAMP 水平以诱导 MSC 神经元分化的物质的出版物分类。

电感器

三坐标测量机的起源

脚步

时间

报告的分化百分比

用于展示差异化的技术

功能演示

参考

5azadC 和 TSA

Balb/c 小鼠骨髓

用 25 ng/ml bFGF 和 EGF 预诱导 2 天。

随后用 1 mM 的 5azadC 和 40 nM 的 TSA 进行诱导。

2天

70% 由神经元性质的形态变化证明

在显微镜下观察神经元形态。

通过 RT-PCR 增加 Sox2 的表达。

Tuj1 和 GFAP 的免疫染色。

不

[67]

表 S3。使用染色质修饰剂诱导 MSCs 神经元分化的出版物分解。

电感器

三坐标测量机的起源

脚步

时间

报告的分化百分比

用于展示差异化的技术

功能演示

参考

bFGF 和 EGF。

人的脐带和骨髓。

用 20 ng/ml bFGF 和 20 ng/hEGF 进行诱导。

7天

50% 表现为神经元性质的形态变化。

在显微镜下观察神经元形态。

Tuj1 和 GFAP 以及 WB 的免疫染色。

不

[72]

表 S4。使用生长因子和/或神经营养因子诱导 MSC 神经元分化的出版物分类。

电感器

三坐标测量机的起源

脚步

时间

报告的分化百分比

用于展示差异化的技术

功能演示

参考

在 Sprague-Dawley 大鼠神经元条件下的培养基中共培养。

胎儿人脐带

MSCs 在 DMEM 培养基中生长，该培养基由从 7 天大的 Sprague-Dawley 大鼠的大脑中提取的神经元调节。

12天

NF 和 NeuN 的阳性免疫荧光分别显示 87.4% 和 58.2%。

在显微镜下观察神经元形态。

NeuN、NF、GFAP、OX42、小白蛋白和钙结合蛋白的免疫染色。

WB 和 RT-PCR 检测 GluR6、GluR7 和 KA2 的存在。

膜片钳演示了响应 1mM 谷氨酸浴产生的输入电流。

[90]

在大鼠 Sprague-Dawley、Shh 和 FGF8 神经元条件培养基中培养

人脐带

MSCs 在 DMEM 培养基中生长，该培养基由从出生 9 天的 7 日龄 Sprague-Dawley 大鼠的大脑中提取的神经元调节。随后，加入 Shh 500 ng/ml 和 FGF8 100 ng/ml。

6天

NF 和 NeuN 的阳性免疫荧光分别显示 87.4% 和 58.2%。

在显微镜下观察神经元形态。

TH 和 GAD 的免疫染色。

WB 存在 TH。

HPLC 证明多巴胺释放到介质中。

[91]

与雪旺细胞共培养

成年 Wistar 大鼠的骨髓。

共培养从成年 Wistar 大鼠坐骨神经中提取的 CMM 和雪旺细胞。

2周

NSE、NF-200 和 Tuj1 的阳性免疫荧光分别显示 60%、52% 和 34%

在显微镜下观察神经元形态。

巢蛋白、NF-200 和 Tuj1 的免疫染色。

不

[92]

与雪旺细胞共培养

成年 Wistar 大鼠的骨髓。

从成年 Wistar 大鼠的坐骨神经中提取的 CMM 和雪旺细胞在带有聚碳酸酯膜的 transwell 培养板中共培养。

2周

48.2%、46.2% 和 27.4% 的免疫荧光阳性

分别为 NF-200、Tuj1 和 GFAP。

在显微镜下观察神经元形态。

巢蛋白、NF-200、Tuj1 和 GFAP 的免疫染色。

通过 RT-PCR 增加表达巢蛋白、Tuj1 和 GFAP。

不

[93]

表 S5。将与成熟神经元细胞共培养用于诱导 MSCs 神经元分化的出版物细分。

电感器

三坐标测量机的起源

脚步

时间

报告的分化百分比

用于展示差异化的技术

功能性

参考

带有 REST 下降的 CMM 中的 Shh、FGF8 和 bFGF。

成年人的骨髓。

在用 250 ng/ml SHH、100 ng/ml FGF8 和 50 ng/ml bFGF 诱导之前，在 CMM 中针对 REST 转染 Ip RNA 载体。

12天

NeuN 的阳性免疫荧光显示 90% 和 68.7%

和 TH，分别。

在显微镜下观察神经元形态。

WB 增加了 TH、NaV11、NeuN、Pitx3 和 Nurr1。

膜片钳证明存在自发放电和自发突触后电流。

[99]

表 S6。使用基因转染诱导 MSCs 神经元分化的出版物分解。

电感器

间充质干细胞的起源

脚步

时间

报告的分化百分比

用于展示差异化的技术

功能性

参考

SB431542、多索吗啡、TSA、RG-108、8-BrcAMP、咯利普兰和 bFGF。

人骨髓

成人

使用 TSA 200 nM、RG-108 10 μM、8BrcAMP 300 μM、Rolipram 1 μM 和 20 ng bFGF 以及多索吗啡 2 μM 和 SB431542 2 μM 进行诱导。

3周

95% 表现为神经元性质的形态变化。

HT 和 Nurr1 的阳性免疫荧光分别显示 68.05% 和 89.12%。

在显微镜下观察神经元形态。

Sox2、NCAM、A2B5、NeuN、Map2、β-tubulin III、NSE、Nurr-1、ChAT、TH、NF、VGLUT1、SYP、SYN-1、GAB VGAT、GAD67、PITX3 和突触素的免疫染色。

通过 RT-PCR 和 WB 增加 Sox2、Map2、B3T、NSE、Nurr-1、ChAT、TH、NF、VGLUT1、SYP、SYN-1、VGAT、GAD67 和 PITX3 的表达。

突触素免疫染色揭示了分化细胞之间形成的突触样结构。

膜片钳证明存在 K+电流整流器。

[112]

SB431542 和多索吗啡

成年人的脂肪组织

用 Dorsomorphin 2 μM 和 SB431542 20 μM 进行诱导

14天

85% 的 NSE 免疫荧光呈阳性。

在显微镜下观察神经元形态。

RT-PCR 增加了 Pax6、Sox1、NF-200、NES 和β-微管蛋白 III。

Pax6、Sox1、NF-200、NES 和β-微管蛋白 III 的免疫染色。

通过 Erk1/2、PI3K 和 Akt 通过磷酸化和抑制磷酸化 SMAD 1/5/8 和 2 WB 进行激活。

通过表达轴突生长锥的特异性 GAP43 蛋白，在用 DM 和 SB 治疗后在 SCID CB-17 小鼠皮下植入时体内神经元分化得到证实。

[113]

bFGF，SB431542，头蛋白，LDN193289，交流。抗坏血酸、dbcAMP 和 BDNF。

成年人的脂肪组织

用 4 ng/ml bFGF、SB431542 10 μM、noggin 100 ng/ml 和 LDN193289 0.5 μM 预诱导 8 天。随后用 200 μM 抗坏血酸处理 14 天。最后，暴露于 50 μM dbcAMP 和 20 ng/ml BDNF

12 天。

Tuj1、GAD 和 GABA 的阳性免疫荧光分别显示 93%、37% 和 47%。

在显微镜下观察神经元形态。

通过 RT-PCR 增加 TuJ1、MAP2、Dlx5、Lhx6、GAD67、SCN1A、SCN5A、Nkx2.1、Dlx2、Dlx5y Lhx6、vGat1、vGlut2、GAD65、GAD67、CALB2 和 GABRA1 的表达。Tuj 1、Pax6、MAP2、NeuN、GFAP、OLIG2、NKX2.1、DLX2、LHX6、GAD 和 GABA 的免疫染色。

能够触发动作电位、电压激活离子电流的存在和

暴露于 NMDAR 和 AMPA 拮抗剂时会产生抑制性突触后电流。

[114]

表 S7。使用小分子诱导 MSCs 神经元分化的出版物分类。

利益冲突

作者声明与本文的发表没有利益冲突。

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