铬-乙醇氧化还原反应分光光度法测定小鼠血浆乙醇水平

摘要：血液/血浆乙醇浓度 (BEC/PEC) 的量化在涉及基础研究、临床研究和生物乙醇生产的实验中非常重要。通常用于测量 BEC 的传统方法可能很昂贵，并且需要高成本的设备和合格的劳动力。本研究的目的是开发一种低成本的方法，该方法可以使用研究实验室常用的简单基础设施来执行。为此，我们开发了一个协议来量化小鼠的 PEC，使用乙醇还原重铬酸钾的方法。然而，这种氧化还原（氧化还原）反应并不是乙醇特有的。因此，PEC 是在一系列化学反应后测量的，以消除样品中存在的还原性干扰物质。首先，我们评估了重铬酸盐对乙醇和血浆中发现的不同还原物质的敏感性，以确定哪些主要干扰物质是。接下来，一旦确定了重铬酸盐还原中的主要干扰物质，就测定了血浆中的 PEC。首先，小鼠接受腹膜内 (ip) 盐水（基础读数，0% 乙醇）或乙醇注射（0.5、1、2、3 和 4 g/kg）并收集它们的血浆。血浆脱蛋白和血浆葡萄糖氧化后，与重铬酸盐/乙酸反应混合，然后用分光光度法测定氧化还原反应的产物。然后，我们使用商业乙醇测定试剂盒作为阳性对照，用相同的血浆样品测定了 PEC。我们发现两者之间存在极好的相关性 以确定哪些主要干扰物质。接下来，一旦确定了重铬酸盐还原中的主要干扰物质，就测定了血浆中的 PEC。首先，小鼠接受腹膜内 (ip) 盐水（基础读数，0% 乙醇）或乙醇注射（0.5、1、2、3 和 4 g/kg）并收集它们的血浆。血浆脱蛋白和血浆葡萄糖氧化后，与重铬酸盐/乙酸反应混合，然后用分光光度法测定氧化还原反应的产物。然后，我们使用商业乙醇测定试剂盒作为阳性对照，用相同的血浆样品测定了 PEC。我们发现两者之间存在极好的相关性 以确定哪些主要干扰物质。接下来，一旦确定了重铬酸盐还原中的主要干扰物质，就测定了血浆中的 PEC。首先，小鼠接受腹膜内 (ip) 盐水（基础读数，0% 乙醇）或乙醇注射（0.5、1、2、3 和 4 g/kg）并收集它们的血浆。血浆脱蛋白和血浆葡萄糖氧化后，与重铬酸盐/乙酸反应混合，然后用分光光度法测定氧化还原反应的产物。然后，我们使用商业乙醇测定试剂盒作为阳性对照，用相同的血浆样品测定了 PEC。我们发现两者之间存在极好的相关性 测定血浆的PEC。首先，小鼠接受腹膜内 (ip) 盐水（基础读数，0% 乙醇）或乙醇注射（0.5、1、2、3 和 4 g/kg）并收集它们的血浆。血浆脱蛋白和血浆葡萄糖氧化后，与重铬酸盐/乙酸反应混合，然后用分光光度法测定氧化还原反应的产物。然后，我们使用商业乙醇测定试剂盒作为阳性对照，用相同的血浆样品测定了 PEC。我们发现两者之间存在极好的相关性 测定血浆的PEC。首先，小鼠接受腹膜内 (ip) 盐水（基础读数，0% 乙醇）或乙醇注射（0.5、1、2、3 和 4 g/kg）并收集它们的血浆。血浆脱蛋白和血浆葡萄糖氧化后，与重铬酸盐/乙酸反应混合，然后用分光光度法测定氧化还原反应的产物。然后，我们使用商业乙醇测定试剂盒作为阳性对照，用相同的血浆样品测定了 PEC。我们发现两者之间存在极好的相关性 然后用分光光度法测定氧化还原反应的产物。然后，我们使用商业乙醇测定试剂盒作为阳性对照，用相同的血浆样品测定了 PEC。我们发现两者之间存在极好的相关性 然后用分光光度法测定氧化还原反应的产物。然后，我们使用商业乙醇测定试剂盒作为阳性对照，用相同的血浆样品测定了 PEC。我们发现两者之间存在极好的相关性在所分析的两种方法中给予乙醇剂量和 PEC。在重铬酸盐反应方法中发现的 PEC值与文献中在相同乙醇剂量下获得的值相似，并且与商业酶活性测定法相似。因此，尽管需要背景读数，但该方法可以成功地应用于使用低成本化学试剂测定 PEC。

关键词

非酶乙醇定量,分光光度法,重铬酸钾,氧化还原反应,血液乙醇浓度

一、简介

血浆或血液乙醇浓度 (PEC/BEC) 的量化在基础 [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ]、临床研究 [ 6 ]、法医报告 [ 7 ] 以及在生物乙醇生产 [ 8 ] [ 9 ]。例如，在基础研究中，BEC 提供了有关特定行为的不同反应的更准确信息。例如，它用于比较菌株间翻正反射丧失的敏感性 [ 10 ]，以及不同年龄对乙醇的反应是否存在行为差异是由于乙醇药代动力学差异所致 [ 3 ]。

常用的定量血浆乙醇的方法包括气相色谱法、酶促氧率酒精分析仪和通过酶促氧化的市售比色测定试剂盒，这些方法价格昂贵和/或需要高成本的设备和熟练的劳动力。因此，开发成本更低的替代方案非常重要，这些替代方案也可以通过研究实验室常用的基础设施进行，并且易于获取。

重铬酸钾溶液的乙醇氧化已被用于测定酒精浓度测定仪 [ 11 ]、酒精饮料 [ 12 ] [ 13 ] 和血浆 [ 14 ] 中的乙醇浓度。然而，在后一种情况下，该方法很复杂，涉及蒸馏和滴定。在酸性溶液中，乙醇与重铬酸盐反应，六价铬Cr 6+被还原为Cr 3+，而乙醇被氧化为乙酸，使溶液从橙色变为绿色。然而，铬从 Cr 6+还原为 Cr 3+可以由血液样本中存在的多种元素诱导，使得反应对乙醇的特异性较差。一些作者试图通过使用溶剂萃取来规避这一限制 [ 9 ]。然而，它提供了相对值，因为乙醇在溶剂萃取后存在于极性和非极性相中。尽管 Cr 6+还原缺乏特异性，我们还是寻找替代方法来消除干扰（即葡萄糖、蛋白质等）在铬和乙醇之间的氧化还原反应中。一种替代方法是转化和/或去除样品中减少铬的主要干扰物质，从而实现对乙醇的特异性检测。即使在这些程序之后仍然存在的干扰元素可以被视为背景控制。

因此，为了获得一种能够准确估算样品中乙醇浓度的重铬酸钾方法，本研究的目的是：1）通过氧化血浆中发现的主要营养物质和代谢物来比较重铬酸盐反应的敏感性（如葡萄糖、甘油、脂类、维生素、酮类、醛类、乳酸、氨基酸和肌酐）；2) 进行化学和物理步骤，以消除能够将Cr 6+还原为Cr 3+的主要干扰物质; 3) 在将样品进行一系列化学反应后，验证小鼠注射的乙醇剂量与 PEC 之间假定的正相关，以及 4) 将重铬酸盐反应获得的绝对值与对照方法进行比较，更具体地说，比色法使用酒精加氧酶。

二、材料与方法

2.1。动物

将总共​​ 14 只 80 天大的瑞士雄性小鼠饲养在聚碳酸酯笼子中（长 42 厘米 × 宽 28 厘米 × 高 21.5 厘米），每笼 4-5 只小鼠分组，随意进食和饮水在整个实验过程中，在受控温度 (21˚C ± 1˚C) 和 12:12 h 的明暗循环（早上 7:00 亮灯）下。在实验开始前一周让小鼠适应实验室。药理实验在白天（上午 8:00 至中午 12:00）进行。所有实验程序均按照巴西国家动物实验控制委员会 (CONCEA) 的指导方针进行，在获得批准后，根据 2008 年 10 月 8 日第 11,794 号巴西国家法律、2009 年 7 月 15 日第 6899 号法令进行来自圣保罗大学生物医学科学研究所的动物使用伦理委员会（协议 5520141020）。

2.2. 乙醇溶液

将乙醇（95% v/v，Merck，巴西里约热内卢）溶解在 0.9% w/v 氯化钠盐水中，制成 20% v/v 乙醇溶液，并以 0.5 的剂量腹膜内 (ip) 给药, 1, 2, 3 和 4 g/kg。生理盐水腹腔注射用等体积的0.9% w/v生理盐水给药。

2.3. 试剂和化学品

D-葡萄糖、L-乳酸、抗坏血酸、α-生育酚、L-谷氨酰胺、L-甘氨酸和肌酐购自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)。重铬酸钾、冰醋酸、甲醛、甲醇、氯仿、无水乙醇和三氯乙酸购自 Labsynth® (Diadema, SP, Brasil)。甘油购自 Promega (Madison, WI, USA)。肝素购自 Cristália Chemicals & Pharmaceuticals Ltda (Itapira, SP, Brasil)。Kit Saccharide Removal Kit (DSRK-500) 购自 BioAssay Systems (Hayward, CA. USA)。Ethanol Kit Assay 购自 GenWay Biothec, Inc. (San Diego, CA, USA)。

2.4. 使用重铬酸盐反应的分析物的标准曲线

为了确定重铬酸盐对不同营养素、代谢物和乙醇反应的敏感性，使用 200 uL/孔在 96 孔 ELISA 微孔板中绘制标准曲线，并在酶标仪分光光度计中读取。空白读数包括除分析物外的所有试剂，用相同体积的超纯水代替。一式两份测定所有样品。从标准曲线中去除了偏离兰伯特-比尔定律的高分析物浓度。

将 80 μL 体积的含有不同浓度分析物的储备溶液转移到含有 1 mL 重铬酸钾 (K 2 Cr 2 O 7) 5% (w/v) 和冰醋酸（比例 1:3 v/v）。反应在 95°C 的水浴中进行 10 分钟，然后将试管在自来水中冷却，并从每个试管中将 200 μL 添加到微孔板中。在 570 nm 处进行分光光度读数。用于选择分析物的标准是它们各自在血浆中的丰度。因此，我们为标准曲线选择了以下物质：乙醇、葡萄糖、脂质、甘油、乳酸、丙酮、氨基酸谷氨酰胺和甘氨酸、肌酐、甲醛（代表乙醇代谢物乙醛）、抗坏血酸和α-生育酚。

为了建立脂质的标准曲线，首先，我们通过 Folch 方法进行脂质提取 [ 15 ]。Folch 方法允许提取总脂质（酯化和非酯化胆固醇、甘油三酯、饱和和不饱和脂肪酸、磷脂）。在含有氯仿/甲醇（500 μL 甲醇/1000 μL 氯仿）的猎鹰中进行肝组织（50 mg 组织）的 Polytron 均质化，加入 400 μL 蒸馏 H 2 O 后，涡旋样品以提取非脂类水溶性成分（氯仿/甲醇/H 2 O 的比例为8:4:3 v/v）。离心（5 分钟，1200 RPM，4°C）后，将溶液分成两相：上层水相（氯仿/甲醇/H 2O 3:48:47) 和有机下层相 (氯仿/甲醇/H 2 O 86:14:1) [ 15 ]。使用巴斯德吸管，将底部的有机相转移到新的试管中。将氯仿加入水相中，涡旋，重复离心步骤，将有机相转移到含有先前获得的有机相的管中。在蒸发有机相（主要含有氯仿）后，在室温下，将所得的脂质颗粒称重并溶解在冰醋酸中。

2.5. 使用重铬酸盐反应测定血浆乙醇浓度

2.5.1。小鼠血浆采集

小鼠被随机分配到以下两种治疗中的一种：乙醇或盐水 小鼠接受以 0.5 g/kg 的剂量腹膜内注射盐水（0.9%）或乙醇（在 0.9% w/v 的盐水中稀释 20% v/v） , 1 g/kg, 2 g/kg, 3 g/kg e 4 g/kg, 紧接着, 回到他们的笼子里。腹腔注射 10 分钟后，在含有 25 IU 抗凝肝素钠的 eppendorfs 中从尾部采集 500 μL 血液，然后在 4°C 下以 2000 × g 离心 10 分钟，将血浆与血清。血浆（约 120 μL/动物）储存在 -20˚C 下，几天后进行了检测。尾采血是从小鼠身上采集血液的方法，因为它可以轻松获得高血量（高达 500 μL）。

2.5.2. 葡萄糖和蛋白质去除

将血浆样品置于碎冰上，将 100 μL 血浆与来自 Saccharide Removal Kit (DSRK-500) 的 10 μL 试剂 A、50 μL 试剂 B 和 11.66 μL 试剂 C 混合。在室温下孵育 15 分钟后，将混合物在 14,000 RPM 下离心 5 分钟，将来自紫色上清液的 80 μL 转移到含有 80 μL TCA 50% 的 eppendorfs 中，从紫色变为透明。将混合物在 4°C 下以 14,000 RPM 离心 5 分钟，以沉淀蛋白质。然后，将 100 μL 澄清的上清液转移到含有 1 mL 重铬酸钾 (K 2 Cr 2 O 7) 5% (w/v) 和冰醋酸（比例 1:3 v/v）。反应在 95°C 的水浴中进行 10 分钟，然后将试管在自来水中冷却。之后，将每管中的 1 mL 转移到新的 eppendorfs 中，然后以 14,000 RPM 的速度离心 20 分钟，得到不溶性沉淀。将每支管的 200 μL 体积移液到微孔板上。在 570 nm 处进行分光光度读数。

2.6. 去除葡萄糖和蛋白质后背景阅读成分的测定

如前所述，我们打算检测背景干扰以及背景吸收对总吸光度读数的贡献程度。为此，血浆中存在的每种干扰的百分比值乘以各自的校准曲线斜率。鉴于重铬酸盐对物质的敏感性和/或它们在血浆中的丰度，我们选择甘油、甲醛、乳酸和总脂质作为主要候选物进行研究，并在从盐水对照动物收集的血浆中进行该方案，如下与上述相同的程序。

2.7. 乙醇血浆浓度的阳性对照

将通过重铬酸盐反应获得的 PEC 值与使用相同血浆样品在 Ethanol Kit Assay (Genway Biotech, Inc.) 中检测到的值进行比较。该方法基于乙醇氧化酶的乙醇氧化。该酶促反应生成乙醛和 H 2 O 2，​​后者与探针反应生成粉红色（λ max = 570 nm）。该测定是按照制造商的说明进行的。标准曲线从每孔 2 nmoles 到 18 nmoles 乙醇进行，使血浆样品的适当稀释度位于曲线的线性范围内。

2.8. 统计分析

计算 Pearson 相关系数 R 以确定注射到小鼠中的乙醇剂量与表观血浆乙醇浓度之间的相关强度。R 值及其各自的显着性水平 p 由 Statistica 7.0 软件 (StatSoft, Inc., 2004) 计算。计算确定系数 R 2以证明线性回归模型与标准曲线数据的拟合优度。线性回归、曲线方程和 R 2数值均由 Excel 软件（365 版）和 GraphPad Prism 7.0 软件执行和计算。为了验证重铬酸盐反应物和乙醇测定试剂盒（阳性对照）产生的曲线之间是否存在平行性，进行了比较回归的 F 检验，由 GraphPad Prism 7.0 软件计算。所有统计检验的显着性水平设定为 5% (p ≤ 0.05)。

3. 结果

3.1。重铬酸盐反应生成分析物的标准曲线

每种分析物产生的标准曲线的斜率（图 1-3）表明了干扰铬还原的主要还原物质。

3.2. 通过重铬酸盐反应和乙醇测定试剂盒测定 PEC

去除葡萄糖和蛋白质后的背景吸光度

盐水对照的吸光度值为：0.008、0.008、0.006、0.007、

图 1。分析物的标准曲线，用重铬酸盐反应进行。(a) 乙醇（浓度为 0.01% 至 1% w/v）；(b) 甲醛（浓度为 0.01% 至 1% w/v）；(c) 葡萄糖（浓度为 0.01% 至 1% w/v）；(d) 甘油（浓度从 0.01% 到 1% w/v）。

图 2。分析物的标准曲线，用重铬酸盐反应进行。(a) 脂质（浓度从 0.01% 到 1% w/v）；(b) 抗坏血酸（浓度为 0.01% 至 2.5% w/v）；(c) 肌酐（浓度为 1% 至 50% w/v）；(d) 乳酸（浓度为 0.01% 至 10% w/v）。

图 3。分析物的标准曲线，用重铬酸盐反应进行。(a) 丙酮（浓度为 0.5% 至 78.5% w/v）；(b) α-生育酚（浓度为 0.025% 至 10% w/v）；(c) 甘氨酸（浓度为 0.025% 至 20% w/v）；(d) 谷氨酰胺（浓度从 0.025% 到 10% w/v）。

图 4。在应用相同的试剂和物理过程以消除葡萄糖和蛋白质后，用重铬酸盐反应生成的分析物的标准曲线。(a) 乳酸（浓度为 0.01% 至 10% w/v）；(b) 甘油（浓度为 0.001% 至 1.25% w/v）；(c) 甲醛（浓度为 0.025% 至 5% w/v）；(d) 脂质（浓度从 0.3% 到 2.5% w/v）。

0.0055, 0.006, 0.006, 0.006, 0.0065，得出中间值为 0.0065。从 0.0065 的值中减去每个剂量的吸光度值。

我们可以推断，主要背景吸光度来自总脂质（其血浆浓度约为 0.26%，吸光度为 0.001）、乳酸（其血浆浓度约为 0.036%，吸光度为 0.002）和甘油（其血浆浓度约为 0.00138%，吸光度为 0.00032）。因此，将这些值相加，我们的吸光度为 0.0034，与从我们的背景对照（0.0065 的中值）获得的值相比，这大约是该值的一半。

如图 5所示，重铬酸盐法提供的乙醇给药剂量与血浆乙醇浓度呈正相关（R = 0.9956；p = 0.0003）。使用 Ethanol Kit Assay 也发现施用的乙醇剂量与 PEC 之间存在正相关（R = 0.9896；p = 0.001）。图 5还展示了使用重铬酸盐法的非酶促反应与使用乙醇检测试剂盒中的醇氧化酶的酶促反应（阳性对照）之间 PEC 的相似性。回归比较的 F 检验表明，图 5中的两条线的斜率之间没有显着差异（F 1,6 = 0.0902；p = 0.7741），它们的 Y 截距之间没有差异（F1,7 = 1.449；p = 0.2679）。

图 5。腹腔注射乙醇（剂量从 0.5 到 4 g/kg）与其各自的乙醇血浆浓度（g/100 mL）之间的相关性。实线：线性回归与从重铬酸盐反应获得的数据（正方形）并从从注射盐水的小鼠的平均值中获取的背景读数中减去。虚线：线性回归与从相同样品但使用乙醇测定试剂盒（阳性对照）获得的数据（菱形）。

4。讨论

在本研究中，主要发现可总结如下： 1）重铬酸盐反应，在控制背景读数后，在乙醇剂量和 PEC 之间产生强烈的线性相关性；2）通过重铬酸盐反应得到的PECs与文献中先前显示的相似；3) 重铬酸盐反应和标准比色法通过乙醇氧化酶产生相似的 PEC，适用于各种乙醇剂量。

考虑到分析的每种物质曲线的斜率值，我们发现重铬酸盐反应法对乙醇、甲醛、抗坏血酸、葡萄糖和甘油具有更高的灵敏度（斜率值分别为 0.3293、0.4139、0.3373、0.3465 和 0.2794，分别）; 对乳酸的中位敏感性（斜率为 0.1151）；对α-生育酚、脂质和甘氨酸的敏感性低（斜率值分别为 0.0133、0.063、0.0411 和 0.0134）；对丙酮、谷氨酰胺和肌酸的敏感性非常低（斜率值分别为 0.0003、0.009 和 0.0059）。酮体等物质（空腹时乙酰乙酸的血浆浓度：0.001%）[ 16 ]，α-生育酚（血浆浓度为 0.0017%）、肌酐（血浆浓度为 0.0001%）[ 17 ] 和氨基酸谷氨酰胺（血浆浓度为 0.008%）和甘氨酸（0.002%）[ 18 ] 不代表检测中的重要干扰，因为重铬酸盐反应检测这些物质的灵敏度低和血浆浓度低。根据我们在文献中描述的标准曲线和它们各自的血浆浓度，我们确定了哪些物质可能是噪声读数的原因。这种噪音读数部分来自乳酸、脂质、甘油，还有其他我们无法确定的物质。

由乙醇脱氢酶催化的乙醇代谢物乙醛在血液中的浓度很低。在之前的一项研究中，发现的血液乙醛浓度为 0.00019%，在小鼠接受 1.5 g/kg 乙醇的 ip 注射 20 分钟后 [ 19 ]。这种乙醛浓度逐渐增加，直到注射后 2 小时——达到乙醇给药后 20 分钟测量值的近 4 倍——然后逐渐下降 [ 19 ]。我们通过甲醛反应间接证明，血浆乙醛不会干扰吸光度。通过重铬酸盐反应，脂质往往具有低氧化电位（斜率值为 0.0411）。然而，血浆中的脂质浓度足够高（0.26%）[ 20] 以干扰阅读，如图 4 (d) 所示。分析标准曲线（图 4 (a)），乳酸似乎占背景读数的近三分之一。因此，考虑到每种物质在血浆中的丰度以及它们各自将Cr 6+还原为Cr 3+的能力，我们得出结论，在去除蛋白质和葡萄糖后，铬氧化还原反应中的主要干扰物是脂质和乳酸。

先前的研究表明，在白化病瑞士小鼠以及禁食 24 小时内，个体之间的甘油、游离脂肪酸和三酰基甘油水平的血浆变异非常小 [ 21 ]。基础乳酸水平也被证明在静息状态下非常稳定，除了运动后 [ 22 ]。然而，当向小鼠腹膜内注射乳酸时，它会在注射后 30 分钟立即恢复到其基础水平 [ 23 ]。因此，背景值是值得信赖的，原因有两个：首先，因为它给出的背景值非常低，其次，因为它涉及对个体内变异敏感性低的物质。

如图 5所示，我们观察到 ip 乙醇剂量与表观 PEC 之间存在强正相关 (r = 0.9956)。绝对值等同于先前从文献 [ 2 ] [ 20 ] [ 24 ] 中获得的值。值得一提的是，在先前的研究中发现的 PEC，[ 2 ] [ 20 ] [ 24 ] [ 25 ] 在乙醇注射和血液收集之间使用相似的时间间隔（4 - 15 分钟）进行乙醇定量。我们使用 Ethanol Kit Assay（其方法基于乙醇氧化酶对乙醇的氧化）进行的阳性对照产生了非常相似的血浆乙醇值（图 5 ) 与重铬酸盐法相比。图 5还描绘了曲线之间的高度平行性。尽管存在要求背景值的限制，但我们的方法比乙醇试剂盒检测具有优势：我们的方法包括使用相同血浆体积的各种乙醇剂量。它检测到 PEC 从 0.5 g/kg ip 的极低剂量（对动物没有明显的行为影响）到诱导运动刺激 (2 g/kg) 或镇静/翻正反射丧失 (4 g/kg) 的剂量. 因此，与 Ethanol Kit Assay 不同，无需预测在标准曲线线性范围内获得样品吸光度值所需的稀释因子。此外，从商业化验试剂盒获得的标准曲线的线性包括乙醇浓度的窄限。

本方法可以方便地用于测量PEC。主要限制是需要对某些干扰进行校正。与气相色谱法和乙醇测定试剂盒相比的优点是：1) 乙醇剂量和 PEC 之间的关系在很宽的剂量范围内是线性的，无需稀释，例如在比色试剂盒中；2) 它可以在使用低成本试剂的基础设施最少的实验室中进行。未来可能会进一步修改测定程序以获得更好的读数，以量化不同生物样品来源中的乙醇。

致谢

Marcos Brandão Contó 进行了所有的药理学和化学分析，参与了研究的构思和设计，进行了统计分析，并撰写了手稿。Rosana Camarini 参与了研究和写作的构思。作者阅读并批准了最终手稿。Marcos Brandão Contó 是 CAPES 的奖学金获得者。这项研究的资金由圣保罗研究基金会 (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo-FAPESP) 的赠款 #2018/05038-0 提供。作者要感谢 Priscila Mariano 在小鼠血液采集方面提供的技术援助。Rosana Camarini 是 CNPq（Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico，“国家科学技术发展委员会”）的研究员。

利益冲突

作者声明与本文的发表没有利益冲突。

参考

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