人工甜味剂阿斯巴甜对小鼠血液参数的急性影响

摘要：阿斯巴甜 (APM) 或 L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯是一种常见的人造非糖类甜味剂，在许多食品和饮料中用作糖替代品，但对消费者有一些副作用。本研究的目的是研究每天摄入不同剂量的 APM 对小鼠血液参数的急性影响。在部门动物房饲养的60 只健康的 3 个月大的雄性小鼠被分为 5 组，即对照组饲喂正常饮食和自来水，而其他 4 组（每组 12 只）每天口服饲喂 1 mL 的 40、500、 1000 或 1500 mg/Kg b wt，用管饲法连续 5 周溶解在蒸馏水中。在解剖时直接从心脏采集的新鲜血液样本进行 com除了手动分类白细胞 (WBC) 计数外，还使用自动血液分析仪 (Cell DYN-1700) 进行全血计数 (CBC) 。从最低剂量（40 mg/Kg·b·wt）开始，WBC 计数显着增加（p ≤ 0.01）；与对照相比，血红蛋白百分比 (Hb%) 和淋巴细胞百分比 ( p ≤ 0.004)均显着降低 ( p ≤ 0.01)。得出的结论是，使用上述剂量摄入阿斯巴甜具有急性影响，并且与血液参数无关，从长远来看，这可能对消费者的其他组织产生进一步的健康风险。

关键词

急性 作用,阿斯巴甜,血液 参数,小鼠, CBC

一、简介

非营养型人工二肽甜味剂阿斯巴甜 (APM) 和天然营养成分在食品添加剂中受到特别关注，因为它们的使用能够大幅减少糖的消耗，显着降低热量摄入，同时保持理想的适口性。食品和软饮料 [ 1 ] [ 2 ]。自 1965 年发现阿斯巴甜以来，对人类和动物进行的许多研究都显示出关于其对人类食用的安全性的相当大的争议，包括可能的神经和行为副作用。研究表明，超过一半的人口更喜欢人工加糖的食物，也许是为了避免增加体重 [ 3] . 由于阿斯巴甜在其分解过程中产生的代谢成分，即苯丙氨酸 (Phe)、天冬氨酸 (aspartate)、二酮哌嗪 (DKP) 和甲醇 [ 4 ]，引起了人们对可能产生的副作用的担忧。APM 是由两种氨基酸的甲酯在商业上生产的：L-天冬氨酸和 L-苯丙氨酸甲酯，它们构成了阿斯巴甜的化学结构 [ 5 ]。APM 的甜度是蔗糖的近 200 倍，几乎不含卡路里，自 1981 年以来已获得美国食品和药物管理局 (FDA) [ 6 ] 的安全消费者使用许可。美国饮食协会 [ 7] 进行了大量研究，其中他们对 APM 消费的安全性提出了挑战。FDA 接受的每日推荐量为 50 毫克/公斤体重/天，而世界卫生组织 (WHO) 接受或/和批准的每日剂量为 40 毫克/公斤/天 [ 8 ] [ 9 ]。其主要杂质、化学和物理性质在其他研究[ 10 ]中有详细说明。

阿斯巴甜成分进入人体后，通过酶的作用迅速在上消化道（GIT）内释放出来。然后它们被运送穿过小肠壁，最后进入全身循环[ 11 ]。甲醇在肠腔中水解，天冬氨酰苯丙氨酸二肽转运至粘膜细胞，在粘膜细胞中代谢为天冬氨酸和苯丙氨酸。甲醇约占阿斯巴甜重量的 10%，它被代谢成甲醛、甲酸和 CO 2，​​然后被吸收到体循环中。阿斯巴甜也可能被肠粘膜细胞吸收，在那里它被水解成它的成分，然后被吸收到全身循环中[ 12] . 因此，受这些化学物质影响的第一个组织将是血液。进一步的安全性研究包括急性推注剂量、重复剂量、胶囊给药以评估胶囊作为一种剂型在盲法临床研究中的适宜性，以及随餐摄入的阿斯巴甜。长期给药安全性研究也已被广泛审查 [ 13 ]。然而，对于阿斯巴甜使用的可信度，既有支持者也有反对者。在人类中，以 24-48 毫克/天的剂量摄入阿斯巴甜三天表明，阿斯巴甜的急性给药对糖尿病大鼠和非胰岛素依赖型糖尿病患者的血糖或胰岛素水平没有影响 [ 14] . 虽然有几项研究涉及不同前景的阿斯巴甜的各种影响，但确实对健康产生了相对真实的风险；虽然自相矛盾，但是，ASP 仍在使用中。血液参数的止血可以在任何人和动物的正常功能中发挥不可或缺的作用。已经对多种不同的动物模型（小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、猪和猴子）进行了测试，以确定阿斯巴甜对各种组织的影响在动物和人类之间具有可比性 [ 15 ]。

研究问题是摄入不同剂量的阿斯巴甜后，白细胞的形态和数量是否会发生变化！小鼠白细胞的功能与其他哺乳动物（包括人类）的功能相似，所有这些都被研究为全血细胞计数 [CBC] [ 16 ]。CBC 可以被许多医生用作检查医院和科学家身体健康状况的指标。CBC 用于评估吸入柴油对豚鼠健康的影响，被发现是一种非常有用且实用的工具 [ 17 ]。

APM 在地中海国家被广泛使用，特别是在糖尿病患者中，但其副作用仍在争论中，并且很少有研究阐明 APM 对健康的严重影响。考虑到经 FDA 批准的公认的每日阿斯巴甜摄入量，本研究计划区分阿斯巴甜在 40 毫克/公斤、500 毫克/公斤、1000 毫克/公斤和 1500 毫克/公斤阿斯巴甜四种剂量下的作用体重作为阿斯巴甜摄入对全血细胞计数的短期（急性）影响作为评估工具。

2。材料和方法

APM 是从日本公司 Tokyo Chemical Industry Co. (TCI) 商业订购的，每瓶 25 克的细白色粉末，纯度为 98%（CAS 号 22839-47-0），同义词为 NL-α-天冬氨酰-L-苯丙氨酸1-甲酯、H-Asp-Phe-OMe 和 [C 14 H 18 N 2 O 5 ] 的化学式。通过溶解在蒸馏水中制备四种浓度：40、500、1000 和 1500 mg/Kg 体重。

2.1。血液分析

将每只动物 2-3 mL 的血样收集在装有 EDTA（乙二胺四乙酸）的安瓿中，并摇晃以避免凝结。使用自动分析仪（Cell DYN-1700）手动和/或机械分析它们。使用新鲜干净的载玻片制备血涂片，并用任一 Giemsa 染料染色，以使用 Olympus 光学显微镜进行差异计数。

2.2. 全血细胞计数 (CBC)

将血液样本放置在分析仪的架子上，这是一种称为 (RM5-Assistant 348) 的旋转机器，以充分混合血液并在分析前防止血液凝固。自动分析机器连接到屏幕监视器以显示血液的更多细节，并连接到打印机。细胞计数组件对血液中不同细胞的数量和类型进行计数。此外，该机器还测量和分析红细胞 (RBC)、白细胞 (WBC) 和血小板 (PLT) 以及血液中和每个红细胞内的血红蛋白含量。

2.3. WBC 的差异计数（手动）

自动 CBC 机器未能对 WBC 进行分类计数，但淋巴细胞占优势；但是，改为进行手动计数。使用组合的 Wright-Giemsa 染色剂（分别为 10 和 20 分钟）对血液涂片进行染色 [ 18 ]。然后将染色的涂片用于使用油浸透镜（×100）通过一滴芥子油对白细胞进行分类计数。继续水平计数，直到区分出一百个白细胞。计数区域的数量直到区分出一百个白细胞。

2.4. 实验方案

在“动物部门”饲养了 60 只 3 个月大的 Swiss Webster 成年健康雄性小鼠，分为五组（G1-G5），每组在实验开始时体重约为 20 ± 2 gm b wt，计算所有剂量准确并相应地送达。第一组作为未治疗组或对照组 (G1)，而其他四个实验组 (G2-G5) 用四种剂量治疗：40 mg/kg、500 mg/kg、1000 mg/kg 和 1500 mg/kg 阿斯巴甜体重。每天（上午 10 点至 12 点）通过使用胃管的管饲法给所有动物口服剂量的阿斯巴甜。这些实验是根据标准动物福利指南进行的，并且从民族委员会获得了伊斯兰立法许可。

2.5. 数据分析

ANOVA 生物统计学程序用于分析数据以与对照数据进行比较的两种方式，并计算显着差异以进行概率检验，表示为 p ≤ 0.05 或更高。表图例中酌情引用了详细信息。

3. 结果

3.1。全血细胞计数 (CBC)

在所有 4 种剂量的阿斯巴甜中，白细胞数量显着增加（p ≤ 0.05），从对照组的（6.025 × 10 3 ± 486）增加到大约（9.35 × 10 3 ± 223），在较高剂量下几乎保持稳定（表 1） . 虽然红细胞数量从低剂量对照的8.488 × 10 6 ± 188/µL 略微下降到 8.32 × 10 6± 188/uL；然而，在整个实验过程中，它们保持不变并在较高剂量下保持稳定。与最低剂量 (12.2% ± 1.8%) 相比，血红蛋白百分比 (Hg%) 从对照组的 13.4% ± 2.7% 显着下降 (p ≤ 0.02)，但在较高剂量下几乎保持稳定。4 种不同剂量阿斯巴甜中的血小板记录显示数量没有显着下降（118 ± 84 到 112 ± 117 × 103）。

血小板

×106克/分升

HGB

克/分升

红细胞

×106/µL

白细胞

×10³/µL

标准

数量和单位

1.187 ± 84

n = 8

13.4±2.70

n = 8

8.474 ± 188

n = 8

6.025 ± 486

n = 8

控制和±SE

1.095 ± 78

n = 6

12.3 ± 382**

n = 8

8.325 ± 188

n = 6

9.35 ± 792*

n = 8

40毫克/公斤

&±SE

1.087 ± 56

n = 7

13.4 ± 208**

n = 8

8.403 ± 99

n = 8

9.975 ± 954*

n = 8

500 毫克/公斤

&±SE

1.086 ± 66

n = 6

13.2 ± 172**

n = 8

8.464 ± 110

n = 9

8.600 ± 891*

n = 7

1000 毫克/公斤

&±SE

1.122±117

n = 7

12.9 ± 189**

n = 9

8.44±151

n = 9

9.029 ± 801*

n = 7

1500 毫克/公斤

&±SE

表 1。摄入阿斯巴甜后小鼠的 CBC。与对照相比，生物统计学暗示了 Student-T-stest ANOVA。(n) = 每个实验使用的动物数量；显着性差异表示为 (*) p ≤ 0.012；(**) p ≤ 0.019 和 (***) p ≤ 0.013。

3.2. 白细胞的差异计数和形态学

人工计数代替自动计数，详情见表2。对照小鼠中 WBC 的差异计数与小鼠标准 CBC 的差异计数一致。一般来说，小鼠的白细胞比其他实验动物（即大鼠和豚鼠）小得多。淋巴细胞，几乎是球形的，小细胞（直径 4.5 ± 0.35 um）的大小略大于 RBC，很容易被识别。一些淋巴细胞在治疗小鼠中具有半卵圆形或异常，并且它们的百分比在治疗小鼠中波动不大（71％ - 63％）。

单核细胞在细胞质内很容易区分为豆形突出的细胞核。在一些实验小鼠中，类似于淋巴细胞，它们的细胞核和细胞质都倾向于比正常小鼠染色更深。它们的平均大小为 11 ± 0.6 um，细胞核周围有透明的非颗粒细胞质。细胞膜清晰可见，周围细胞质区域较大；然而，一些实验小鼠的细胞膜丢失了。有些在细胞核和细胞质中都显示出空泡，导致尺寸增大。与对照组 (20.7%) 相比，它们的频率在较低剂量 (40 mg/Kg 体重) 中有所下降，但在接下来的三个剂量 (15% - 23%) 之后出现波动 [表 2 ]。

在对照组和阿斯巴甜处理的小鼠中，中性粒细胞的细胞核（分段）被染成亮蓝色，最多可区分 8 个裂片。与其他物种相比，小鼠嗜中性粒细胞的直径范围为（7.5 - 12.0 um），平均为 8.0 ± 1.2 um。在实验小鼠中，偶尔会出现一些细胞质内的空泡。对照组小鼠的细胞膜比治疗组更清晰可见；然而，在实验小鼠中，很少会丢失而导致核叶松动。在对照组和处理组中偶尔可检测到中性粒细胞样小细胞，染色质材料堆积，略大于淋巴细胞

嗜酸性粒细胞

%

嗜碱性粒细胞

%

中性粒细胞

%

单核细胞增多症

%

LYM

%

标准

数量和单位

0

0

5.33±1.0

20.67 ± 2.4

74±2.37

控制和±SE

n = 8

5.33±1.2

2.33±0.5

6.33 ± 2.09***

15.00 ± 1.9

71.0±2.5

40毫克/公斤

&±SE

n = 8

0.50±0.2

0.33±0.2

7.83 ± 0.5***

23.17 ± 1.9

74.50 ± 2.2

500 毫克/公斤

&±SE

n = 8

1.83±0.5

1.00 ± 0.5

6.17 ± 1.3***

10.33±1.6

80.5±2.2

1000 毫克/公斤

&±SE

n = 8

0.5±0.2

3.33±0.4

9.67 ± 1.5***

22.00 ± 1.0

63.33±1.0

1500 毫克/公斤

&±SE

n = 8

表 2。将暴露于不同剂量阿斯巴甜的白细胞的差异计数作为平均值；Wright 和 Giemsa 染色剂染色的百分比 (%) 和 ±SE 使用自动机器和手动进行。与对照相比，使用学生 T 检验 ANOVA 进行生物统计学。显着性差异表示为 (*) p ≤ 0.012；(**) p ≤ 0.019 和 (***) p ≤ 0.013。

组老鼠。这些小细胞在验证中性粒细胞和淋巴细胞之间的白细胞差异计数时造成了一些混乱。

小鼠血液中的嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞都非常罕见，与人类和其他高等哺乳动物相比几乎无法识别。它们的尺寸略大于中性粒细胞（直径 10.2 ± 1.5 微米）。这两种白细胞类型的验证在对照和阿斯巴甜处理的小鼠中都不容易区分。偶尔，一些比淋巴细胞（7.5 ± 1.0 um）小的、稍大的细胞，也许可以从它们的双叶细胞核中检测到，只是细胞质的颜色有所不同。这些细胞被认为是与细胞质颗粒的颜色（分别为蓝色或右侧）相关的小嗜碱性粒细胞或嗜酸性粒细胞。嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞的百分比均在 0% - 5% 之间波动，但在小鼠的标准范围内。另一方面，血小板，尽管在所有血涂片中很容易检测到，但没有显示出显着变化。他们的计数在老鼠的标准记录附近。

4。讨论

在这些实验中遇到的所有老鼠都来自同一批次、健康的雄性和相同的年龄，以保证对结果的公正解释。由于没有死亡事件，阿斯巴甜的口服给药方案和技术被批准在整个 5 周的实验中取得成功。实验动物在 5 周实验中的存活意味着使用的所有剂量 (40-1500 mg/Kg∙b∙wt.) 可能表明阿斯巴甜的非致命性。然而，接受最高剂量阿斯巴甜 (1500 mg/Kg∙b∙wt.) 的动物在第 5 周结束时身体后部严重受伤，表明出现攻击行为。虽然在现阶段尚不清楚这种侵略的具体原因，但唯一的解释可能是，19 ]。这种攻击性的实际病因可以通过超出本研究范围的生化行为研究来进一步探索。

自 1965 年以来，在全球范围内进行的许多批准其安全性的研究仍然存在冲突，导致两所不同的学校对立，其中一所支持 APM 的安全消费，而另一所反对。然而，后者受两个主要因素的支配，即进行这些研究的各种场景以及每年发财的制造商的商业贪婪。尽管如此，它已被宣布安全并被医生推荐给世界各地的糖尿病患者。现在几乎不可能做到完全不含甜味剂和/或其他添加剂的饮食 [ 1] . 从工业用途来看，添加剂已不可避免地成为延长保质期和改善风味、颜色和质地或使食品变甜的必需品，其中包括抗氧化剂、防腐剂、稳定剂、着色剂、调味剂、乳化剂和甜味剂 [ 20 ]。幸运的是，APM 主要用于未煮过的食物作为烹饪，否则任何温度升高或极端 pH 值都显示出其三种成分的化学结构和组成发生变化，通过转化酯化二肽导致其后果发生变化，非酶解成多种分解产物 [ 21] . 因此，对健康的风险是由上消化道中的 APM 代谢物生成氨基酸天冬氨酸 (Asp)、苯丙氨酸 (Phe) 和甲醇，这些氨基酸将被吸收并水解成其成分，穿过肠壁运输小肠最后进入全身循环[ 22 ]。Asp 主要以 CO 2 的形式通过肺排出，而形成的一些 Phe 以 CO 2的形式排出体外也是其中大部分被纳入氨基酸库并有助于蛋白质合成的地方。因此，对这些代谢物健康的第一条影响将意味着可以通过 CBC 测试检测到的血液参数。因此，健康状况可以通过其参数与正常值的偏差来评估。

早期对 7 只婴儿猴喂食 APM 和牛奶的研究表明，高剂量组没有摄入预期水平的 APM，从而得出结论，高剂量组实际上摄入的 APM 与中剂量组大致相同 [ 23 ]。幸运的是，这可能表明身体有能力吸收一定限度的 APM 剂量，而更高的剂量可能会以某种方式从身体排出或/和变得无害。

本研究中血液参数的一般记录与其他参考文献中记录的标准记录相似，表明这项工作的 CBC 计数的可靠性和准确性。在这项工作中表现出的各种血液疾病从不显着到非常显着不等。因此，APM 对将营养和氧气循环到所有身体组织的血液的实际影响将是可行的，可以从其成分的整个变化中考虑。一些血液系统疾病被归因于通过抑制骨髓红细胞生成来阻止红细胞合成，从而导致贫血[ 24 ]。

一般来说，小鼠的 WBC 大小比其他实验动物小得多，例如大鼠、豚鼠和兔子 [ 17 ] [ 25 ]。它们的大小似乎在一定程度上与动物的大小成正比。如此小的小鼠可能不可避免地会混淆自动分析机器来区分白细胞，而手动计数时的意外错误可能是不可否认的。

WBC 的总频率在所有四剂 APM 中显着增加，然后几乎在较高剂量下稳定下来。它们在血液中的频率通常预示着疾病 [ 26 ] [ 27 ] 而升高则被认为是免疫系统对任何外来入侵者作出反应的状态的尖锐指示 [ 28 ] [ 29 ]。由于各种微生物感染、癌症或药物摄入，通常会出现 WBC 总数的升高；然而，在吃完大餐或经历压力后也检测到“白细胞增多” [ 30 ] [ 31] . 因此，实验小鼠中 WBC 的升高可能是由于免疫系统将 APM 代谢物识别为异物。

淋巴细胞的平均百分比在小鼠的标准范围内，表明 APM 剂量对淋巴细胞群没有影响。因此，由于 APM 对血液的作用，不太可能与任何血液疾病（即淋巴症）相关。这一结果与其他关于人类的研究相反，后者都将其归因于白血病（淋巴恐惧症）的可能发展 [ 4 ] [ 32 ]。

单核细胞大小的变化可能会在差异计数中引起一些混乱，从而导致一些意想不到的数字错误。少数单核细胞出现在胞质内，呈超致密球体，代表一种新型小鼠特异的单核细胞。这种类型的 WBC 类似于被描述用于豚鼠和兔子 [ 25 ] 和豚鼠 [ 17 ] 的 Foa Karloff 细胞] . 因此，假设小鼠中的这些白细胞等同于豚鼠和兔子的 Fao Karloff 细胞可能并没有错。单核细胞的细胞核出现较深和较浅的颜色，这在以前的涉及小鼠血液的研究中没有描述。与对照动物相比，一些单核细胞在其细胞质以及细胞核中形成了液泡和/或失去了细胞膜，而另一些则具有无定形，特别是在较高剂量的 APM 下。这是 APM 对所有使用剂量的此类 WBC 起作用的明显迹象，表明它们对 APM 的敏感性高于其他类型。使用 TEM（未发表的数据）的细胞学研究已经探索了这些变化。

最高剂量时中性粒细胞计数异常升高有多种可能的解释，例如超过 8000 被认为异常高，即高度压力；细菌突然感染、烧伤和心脏病发作；突然肾功能衰竭、子痫、癌症在体内扩散 [ 33 ]。本研究中嗜中性粒细胞比例的显着增加只能归因于高剂量的中性粒细胞作为对 APM 毒性作用的即时反应而触发的免疫系统。这可能解释了小中性粒细胞（带状或 B 型中性粒细胞）的增加，在被外来化学物质感染的情况下确实会升高 [ 34 ]。

在本研究中，与对照相比，所有剂量的处理过的血液中的红细胞 (RBC) 数量均无影响。这一结果与其他研究一致，这些研究表明 APM 和谷氨酸对红细胞浓度的影响不大，也不对人体摄入 APM 加 L-谷氨酸单钠后的血浆 [ 35 ] [ 36 ] 而低剂量对膜酶活性没有危害，但高剂量确实 [ 37 ]。然而，这样一个有希望的结果表明，低剂量的 APM 可能比高剂量更安全。在这项研究中，膜酶的活性没有被测量，因为它超出了协议的范围。

APM 治疗的小鼠显示血红蛋白百分比显着下降，这在临床上是指血液疾病，例如红细胞破坏 [溶血] 导致贫血 [ 28 ] [ 38 ]。因此，Hb% 的下降可能归因于 APM 代谢物的影响，即甲醇，它破坏了血红蛋白的蛋白质键 [ 39] . Hb% 的这种下降确实引发了一些临床问题，血液学家需要进一步解决 APM 对血液成分的作用机制及其后果。本研究涉及 APM 对血小鼠的短期低剂量和高剂量影响。因此，目前的结果可能表明 APM 对某些血液参数的早期影响，而从长远来看，可能会对其他血液成分造成进一步的危害。

5. 结论

得出的结论是，APM 的影响对血液成分具有急性、直接和各种副作用，这些副作用似乎与剂量无关，但从长远来看可能表明健康风险，具体取决于几个因素。也许需要进一步的实验，即长期实验来研究 APM 对体内这两个重要组织的破坏性影响。

致谢

这项研究已获得科学学院科学委员会的批准，该项目为 Norah S. Urwi Aljohany 女士提供理学硕士项目，这意味着伦理委员会批准对实验动物进行科学实验。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

参考

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