印楝生物银纳米颗粒的抗血管生成和抗转移作用

摘要：背景：纳米技术象征着一门广泛的学科，在癌症治疗方面具有巨大的潜力，它弥补了癌症治疗中传统方法的瓶颈之一，即无法将足够数量的抗癌药物输送到肿瘤区域。对纳米粒子的研究表明它们在癌症血管生成和转移中的重要性。目的：本研究评估了从印度楝树植物 ( Azadirachta indica )合成的生物银纳米粒子 (AgNPs) 的抗血管生成和抗转移作用。方法：鸡绒毛尿囊膜 (CAM) 和二维 (2D) 伤口愈合试验分别用于研究 AgNPs 的抗血管生成和抗转移作用。将 24 个受精卵分为 4 组：100 μg/ml 和 200 μg/ml 两种生物源 AgNPs 处理；阴性对照（1% DMSO）和阳性对照（环磷酰胺）。在孵化的第 8 天，将浸渍有不同浓度水平的处理剂的滤盘放在 CAM 上。在孵化的第 12 天，使用立体显微镜对 CAM 进行成像，使用 ImageJ 进行缩放，并使用 AngioTool 软件计算不同的形态和空间参数。测量血管面积、血管百分比面积、接头总数、总血管长度、平均血管长度、平均腔隙和接头密度。在孵化第 16 天还记录了头臀长 (CRL) 和胎儿体重。为了确定 iNOS 和 VEGF 的相对基因表达谱，从 C 中提取总 RNAAM，以β-肌动蛋白为参考基因进行qRT-PCR 。对于 2D 伤口愈合测定，DU145 人前列腺细胞在添加了 10% 胎牛血清的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基中生长。结果：在从 CAM 图像生成的参数中，生物 AgNPs 以剂量依赖性方式显示出抗血管生成作用。此外，qRT-PCR显示 iNOS 和 VEGF 基因的下调。二维伤口愈合测定显示，在 72 小时的评估中，DU145 细胞的迁移和运动受到抑制。结论：本研究假设生物源性 AgNPs 可以通过灭活 VEGF-NO 和 VEGF/VEGF-R 通路来阻止血管生成，同时抑制细胞迁移和转移。

关键词

生物 AgNPs ,癌症,血管 生成,转移, CAM

一、简介

癌症已成为非洲的主要健康问题之一，需要立即采取适当的措施来应对其不断增加的发病率和死亡率 [ 1 ]。到 2030 年，大约 70% 的新增癌症病例将归因于人口增长和老龄化 [ 1 ]。目前的癌症治疗方法包括手术、化学疗法、放射疗法、基因疗法、干细胞疗法和基于激素的疗法，其中大多数已经经历了治疗失败。癌症治疗失败的最大原因是癌细胞从原发性肿瘤扩散到其他组织再播种继发性肿瘤，称为转移 [ 2]。其次，可用药物受到低递送和高毒性问题的阻碍，导致整个治疗方案无效。

由于植物衍生产品在治疗不同类型的癌症（如结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、食道癌和肝癌等）方面已显示出前景 [ 3 ]，因此人们对基于植物的疗法的兴趣和使用有所增加。许多植物物种已被用于治疗或预防癌症的发展 [ 3 ] [ 4 ]。据报道，印楝植物 ( Azadirachta indica ) 具有多种活性，例如抗菌、抗糖尿病、抗生育、心脏保护和抗癌等特性 [ 5 ]。印楝植物中的植物化学物质也被证明对宫颈癌、乳腺癌、前列腺癌和结肠直肠癌都有抗癌活性体外和体内[ 5 ] [ 6 ]。然而，在癌症治疗中使用植物衍生产品面临着许多瓶颈，例如活性植物化学物质对靶细胞的生物利用度有限和毒性[ 7 ]。这促使需要靶向治疗来改善药物输送系统并通过纳米技术最大限度地减少副作用 [ 8 ]。后者需要使用生物相容性和可生物降解的系统，这些系统可以提高常规药物在所需部位的生物利用度和浓度，并改善肿瘤区域的释放曲线 [ 9 ]。

纳米技术已被用于针对与癌症生长和进展相关的不同机制，例如转移和血管生成 [ 10 ] [ 11 ]。后者是由预先存在的血管产生的生理过程，对胚胎发生和维持体内平衡至关重要，包括受损组织的修复和再生 [ 12 ]。尽管该过程在某些疾病条件下可以放松管制，但由于肿瘤血管生成因子 (TAF) 等血管生成刺激物的增加，它可以在恶性肿瘤期间开启。这是肿瘤细胞分泌的，以响应对促进癌症生长和进展的营养和氧气的需求[ 12]。因此，靶向血管生成被视为医疗环境中的重要治疗策略，尤其是癌症治疗。一些分子机制和途径已被牵连并被认为是潜在的靶点，包括 VEGF/VEGFR、PDGFB/PDGFR-b、iNOS 途径和血管生成素 [ 13 ] [ 14 ]。在哺乳动物细胞合成的三种一氧化氮合酶 (NOS) 中，细胞因子暴露后表达的 iNOS 比其他组成成员 nNOS 和 eNOS 产生更多的 NO，并调节重要的癌症相关过程，如血管生成和转移 [ 15]。一氧化氮合酶 (NOS) 的上调促进了许多促血管生成因子，例如 VEGF、成纤维细胞生长因子 (FGF2) 和 Ang2，其中发现抑制 eNOS 或 iNOS 可以阻止大鼠模型中的血管生成 [ 16 ]。血管生成有助于转移；肿瘤细胞侵入血管、循环并在远处重新侵入并增殖的过程。这是因为癌细胞形成的血管网络不仅为肿瘤提供营养，而且还作为肿瘤细胞进入循环的逃逸途径[ 17 ]。

鉴于现有抗癌药物的局限性，文献中报道的纳米材料表明癌症转移和血管生成的潜力 [ 18 ]。大量的纳米粒子已被证明在体外和体内都具有良好的抗血管生成和抗转移特性[ 11 ] [ 12 ] [ 13 ]。然而，除了众所周知的抗菌特性外，银纳米粒子 (AgNPs) 的血管生成和转移调节以及所涉及的机制尚待完全了解。然而，据报道，在地衣芽孢杆菌中生物合成的银纳米颗粒生物质抑制添加外源性 VEGF 的牛视网膜内皮细胞的增殖和迁移，以及小鼠模型中的微血管形成，这归因于 PI3K/Akt 信号通路的失活 [ 19 ]。

印楝提取物也被包裹在各种金属纳米粒子 (NPs) 中，例如银和金 [ 20 ]。银纳米粒子 (AgNPs) 是药物制剂中研究和使用最多的纳米粒子之一，因为它具有强大的广谱活性、极大的表面积、强渗透性和低耐药性 [ 6 ] [ 21 ]。最近，我们使用平均大小为 58 nm 的印楝树皮甲醇提取物配制和表征了银纳米颗粒，该提取物在DU145 人前列腺癌的抗增殖和对正常细胞 Vero E7 的低细胞毒性方面显示出良好的活性 [ 22]。与对照药物（多柔比星）相比，NPs 还具有优越的选择性指数，因此显示出作为合适的抗癌剂的前景。本研究分别通过鸡绒毛尿囊膜 (CAM) 测定和伤口愈合测定进一步阐明了 NPs 在抑制血管生成和转移方面的潜力。此外，本研究探讨了 NPs 在血管生成相关基因（iNOS 和 VEGF）表达中的活性，以揭示参与血管生成的可能分子机制。

2。材料和方法

2.1。材料

银纳米粒子 (AgNPs) 以前是从印度楝树 ( Azadirachta indica ) 茎皮的甲醇提取物中生物合成的，并使用 FTIR、紫外可见光谱、zeta sizer 和 zeta 电位进行表征；Kitimu等人在我们小组之前的研究中报道，[ 22 ] 被用于本研究。此外，肯尼亚农业和畜牧业研究组织 (KALRO) 开发的当地改良鸡 ( Gallus domesticus )的新鲜受精蛋购自肯尼亚 Neochicks Poultry Limited。

2.2. 鸡绒毛尿囊膜测定

遵循 Lokman等人使用的协议。[ 23]，经过修改，将受精卵用浸泡在蒸馏水中的白色干净毛巾清洁并风干，然后在 37°C、60% 湿度的 Eteyo 孵化器（型号：JN5-60）中孵化。在孵化过程中，鸡蛋每天至少手动旋转两次。在孵化的第 3 天，使用手术刀刀片和镊子在无菌条件下在外壳上制作一个小窗口。在此之前，使用 5 ml 皮下注射器以 45° 角从鸡蛋的尖端抽吸 2 - 3 ml 白蛋白，以滴落发育中的鸡尿囊尿囊膜并简化窗口打开。用胶带重新密封窗口，将鸡蛋放回孵化器，直到鸡胚胎发育的第 8 天。第 8 天，打开窗户，将先前用不同浓度的生物 AgNPs 添加到 CAM 中处理过的无菌滤盘。阴性对照接受载体 1% DMSO，阳性对照接受 100 µg/ml 环磷酰胺 (Sigma Aldrich) 和两种不同浓度 100 µg/ml 和 200 µg/ml 的生物源 AgNPs 的两次处理。鸡蛋在第 12 天被重新密封并放回孵化器（每次处理 n = 6 个鸡胚）。在第 12 天，在无菌条件下去除密封件，并使用安装在 Olympus SZ61 立体显微镜（Olympus Corporation，Japan）目镜上的 Nicon D5100（Nicon，Corporation）相机对所有病例进行拍照。使用 ImageJ 和 Angiotool 软件分析图像。根据图像中的像素与样本中的替代单位长度之间的相关性计算分数，其中 AngioTool 使用毫米作为长度单位。获得的血管生成参数包括血管面积、血管百分比面积、接头总数、总血管长度、平均血管长度、平均腔隙和接头密度。

此外，按照 Baharara等人[ 24 ] 和 Bokariya等人[ 25 ] 的协议，卵再次重新密封并放回孵化器中，直到第 16 天形态测量数据（冠臀长度和胎儿重量）被记录下来。在此过程中，偶尔会通过烛光检查鸡蛋的死亡率，并取出死胚胎。胎儿体重是使用数字称重天平测量的，而冠臀长度的测量方法是从喙的根部沿背部穿过尾骨尖端，然后使用尺子测量相应的线长度以厘米 (cm) 为单位。

2.3. 二维伤口愈合试验

2.3.1。细胞

使用从 ATCC (Manassas, VA, USA) 获得的 DU 145 人前列腺癌细胞。如在 Kitimu等人[ 22 ] 中，细胞在 T75 培养瓶中在补充有 10% 胎牛血清 (FBS)、1% L-谷氨酰胺和 1% 抗生素（青霉素/链霉素）的 MEM 培养基中生长并孵育在 37˚C 和 5% CO 2下达到 80% 的汇合度。将细胞在 12 孔板中继代培养用于伤口愈合测定。

2.3.2. 伤口施加和测量

正如 Abdille等人先前所述，[ 26 ]，DU-145 细胞被计数并接种在 12 孔板中，细胞密度为 5 × 10 4细胞/孔。监测细胞生长直至细胞达到 95% 汇合，其中使用无菌 200 μl 尖端在细胞单层上造成伤口。在向孔中加入 1.5 ml 含有生物 AgNP（15 µg/ml 和 30 µg/ml）和阳性对照（环磷酰胺，100 µg/ml）的培养基之前，去除带有相关碎片的培养基并用 PBS 洗涤。阴性对照接受培养基和 1% DMSO 溶剂。使用的生物 AgNPs 浓度，即15 µg/ml 和 30 µg/ml，分别为 2IC 50和 4IC 50分别为预先确定的 IC 50和先前报道的 [ 22 ]。处理后，监测细胞的进展，并使用安装在倒置显微镜目镜上的 Nicon D5100 (Nicon, Corporation) 相机以 0、24、48 和 72 小时的时间间隔拍摄照片。在治疗的时间点评估伤口恢复（由伤口大小描绘）。

2.4. 相对基因表达

2.4.1。RNA提取

使用如前所述的采用鸡绒毛尿囊膜 (CAM) 测定的一组不同的实验，在第 8 天用生物源 AgNP（100 µg/ml 和 200 µg/ml）或阳性对照（环磷酰胺）处理 CAM，同时接受阴性对照1% DMSO 载体。24 小时后（第 9 天），收集 CAM 并在液氮中速冻并转移到 -80˚C 冰箱中。整个 CAM 在液氮中研磨，约 50 mg 的一部分用于使用制造商所述的Quick -RNA Miniprep Kit (Zymo Research) 提取 RNA。通过分光光度分析确定总RNA的量和纯度。RNA 的质量通过 1% 琼脂糖电泳确认。

2.4.2. cDNA合成

使用 FIREScript RT cDNA 合成试剂盒（Solis BioDyne，爱沙尼亚）按照制造商的说明进行 cDNA 合成，之前 Nirmali等人使用过。[ 27 ]。简而言之，将 10 µl (100 µg/ml) RNA、1 µl Oligo (dT) 引物 (100 µM)、2 µl 10x RT Reaction Buffer with DTT、0.5 µl dNTP Mix ( 20 mM)、1 µl FIREScript RT、0.5 µl RNase Inhibitor (40 U/µl) 和 5 µl 无核酸酶水。混合物在 55°C 下孵育 30 分钟，酶在 85°C 下失活 5 分钟。

2.4.3。引物设计

使用的引物是使用美国国家生物技术信息中心 (NCBI) 的 Primer Blast 工具 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) 设计的，而基因的参考序列是从 GenBank 中检索到的。 FASTA 格式。序列操作套件 (https://www.bioinformatics.org/sms2/pcr_primer_stats.html) 用于测试考虑到 GC 含量、引物熔解温度 (Tm) 和发夹形成而获得的每对引物。目标产品大小为 80 至 250 bp。使用 oligoCalc (http://biotools.nubic.northwestern.edu/OligoCalc.html) 检查所有具有通过记录的引物的 Tm。在 qRTPCR 之前，使用常规 PCR 优化引物，在凝胶电泳后，呈现预期产物大小的引物用于下游应用（表1）。

2.4.4。定量逆转录聚合酶链反应

使用 qRT-PCR 实时热循环仪 qTOWER3 84 GmbH (Analytik Jena) 研究相对基因表达。qRT-PCR 反应使用 2X qRT-PCR Master Mix (Beijing Solarbio Science & Technology Co.,

基因名称

序列 5'-3'

退火温度

PCR 产物大小 (bp)

基因库编号

β-肌动蛋白

F CTGAGAGTAGCCCCTGAGGA

61

185

EU309690.1

R CACAGCCTGGATGGCTACAT

iNOS

F TTGGAAACCAAAGTGTGT

61

95

JQ280464.1

R CCCTGGCCATGCGTACAT

血管内皮生长因子

F CGGTACAAACCACCCAGCTT

61

139

AY168004.1

R TGTCCAGGCGAGAAATCAGG

表 1。用于 qRT-PCR 的引物。

缩写：F：向前；R：反向；iNOS：诱导型一氧化氮合酶；VEGF：血管内皮生长因子。

Ltd) 遵循制造商的说明。25 µl 反应包含 12.5 µl 2X 预混液、1 µl 正向和反向引物 (10 pmol/µl)、1 µl cDNA 和 9.5 µl 无核酸酶水。所有反应一式三份进行。qRTPCR 是使用该程序完成的；初始变性：95˚C 10 分钟；95°C 变性 20 秒，61°C 退火 45 秒，72°C 5 分钟 35 个循环后最终延伸。此外，熔解曲线是在 60°C 至 95°C 的温度范围内生成的。表 1显示了用于实时 PCR 分析的引物列表。β-肌动蛋白用作诱导型一氧化氮合酶 (iNOS) 和血管内皮生长因子 (VEGF) 表达的内部对照。

2.5. 数据分析

ImageJ 软件用于图像缩放，而 AngioTool 软件 (AngioTool v 0.6a (02.18.14)) 用于计算几个形态和空间参数。使用 GraphPad Prism 8.4.3 软件 (Graph-Pad Software, San Diego, CA) 对实验数据进行统计分析。数据记录为数字并表示为平均值±SEM。使用 t 检验 (Mann-Whitney) 进行了进一步的统计调查。另一方面，目标基因的相对表达水平使用 delta-delta Ct (2 - ΔΔCt ) 方法计算，结果进行单向方差分析，然后进行 Tukey 测试后关节分析以进行多重比较。看家基因β-肌动蛋白用作参考基因以标准化靶基因的表达。在每种情况下，小于 0.05 的p值被认为是显着的。

2.6. 道德批准

内罗毕大学动物伦理委员会在兽医生理学和解剖学系批准了实验，并在一封信中发出了参考号：FVM BAUEC/2021/308。

3. 结果

3.1。鸡绒毛尿囊膜测定

我们比较了两种生物 AgNP（200 µg/ml 和 100 µg/ml）处理产生的 CAM 图像，包括阴性（载体 1% DMSO）和阳性（环磷酰胺）对照。使用 ImageJ 为图像分配比例，并使用 AngioTool v 0.6a (02.18.14) 软件进行分析。原始图像和经过处理（骨架化）的图像如图 1所示。显示了血管面积、血管百分比面积、接头总数、总血管长度和平均血管长度的测量值（图 2) 其中生物源性 AgNPs 的抗血管生成作用呈剂量依赖性。治疗组和阴性对照组的接头总数、总血管长度和平均血管长度存在显着差异（p < 0.05）。相反，除平均长度外，阳性对照与其他处理之间的所有参数均存在显着差异（p < 0.05）。

图 1。生物源 AgNPs 处理 CAM 中血管生成的分析。(1): 来自阴性对照 (1% DMSO) 的 CAM 代表性图像；(2)：100 µg/ml 生物 AgNPs 治疗组；(3)：用 200 µg/ml 生物源 AgNPs 治疗组；(4)：来自阳性对照（环磷酰胺）的 CAM 的代表性图像；(A)：带刻度的原始 CAM 图像（左）；(B)：处理后的结果图像（右）。根据 AngioTool v 0.6a (02.18.14) 软件计算，血管轮廓以黄色显示，骨骼以红色显示，分支点以蓝色显示。

通过使用连接密度和空隙测量的分形分析，对治疗抑制血管生成的程度进行了进一步评估。血管生成以剂量依赖性方式受到抑制，治疗组和对照组之间存在显着差异（p < 0.05）（图 3）。在这种情况下，血管密度越大，则认为发生的血管生成越多。另一方面，空缺性表征了分形中间隙的分布，其中具有高空缺性的分形具有较大的间隙。在这种情况下，与其他治疗相比，阳性对照具有较低的血管，表明对照具有抗血管生成活性。更高剂量的生物 AgNPs (200

图 2。对不同组（N = 6）进行的分析的图形表示。字母差异表示组间差异显着（p < 0.05） 统计分析。

图 3。分形分析表明不同处理的结密度和平均空隙。抗血管生成活性是剂量依赖性的，阳性对照表现出更多活性。

µg/ml) 的血管密度低于 100 µg/ml。与其他处理相比，阳性对照的空隙度值更高，其中较高剂量的生物 AgNPs (200 µg/ml) 与较低剂量 (100 µg/ml) 相比显示出更高的空隙度。

还分析了处理对形态学参数的影响，其中测量了胎儿的体重和头臀长，图形表示如图 4和图 5 所示。胎儿体重

图 4。生物源 AgNPs 对胎儿体重的影响。

图 5。生物源 AgNPs 对冠臀长度 (CRL) 的影响。CRL 以剂量依赖性方式降低，其中阳性对照与星号所示的阴性对照有显着差异 (p < 0.05)。

括号内为不同的处理方法；阴性对照 (15.58 ± 0.57 cm)、100 µg/ml (14.2 ± 1.4 cm)、200 µg/ml (13.04 ± 1.51 cm) 和阳性对照 (14.2 ± 0.9 cm)。治疗组和对照组之间没有显着差异（p > 0.05）。此外，冠臀长度（CRL）在阴性对照的处理之间没有显示出显着差异。然而，阳性对照显着降低了阴性对照的 CRL。

3.2. 伤口愈合试验

使用细胞迁移测定（伤口愈合）与阳性对照（环磷酰胺）一起研究了生物 AgNP 的抗转移作用，结果如图 6 所示。结果表明，生物源 AgNPs 能够

图 6。伤口愈合试验。生物源 AgNPs 在 0 到 72 小时内对细胞迁移的影响。箭头表示整个持续时间内伤口的大小（每张图像在倒置显微镜下以 10 倍放大倍率拍摄）。

抑制细胞迁移到开口处，从而延迟伤口的恢复。从图像中可以明显看出，在阴性对照中，伤口在 72 小时后能够发生闭合。当使用最高浓度的 30 µg/ml 生物 AgNPs 时，观察到更强的效果。在这种情况下，AgNPs 会导致一些细胞死亡，因为它们可以看到漂浮在培养基上。

3.3. 相对基因表达

探讨了生物源 AgNPs 对 iNOS 和 VEGF 表达谱的影响。生物源 AgNPs 和阳性（环磷酰胺）均显着下调所有靶标的表达（图 7和图 8）。每个条形图上的不同字母表示由单向 AVOVA 和 Tukey 在 Graph Pad Prism 软件 (v8.4.3) 中进行的多重比较事后分析产生的显着差异 (p < 0.05)。星号 (*) 表示在事后分析后与阴性对照的显着差异 (p < 0.05)。在最高剂量的生物 AgNPs (200 µg/ml) 中观察到更高的倍数变化。因此，NPs 浓度的增加增加了药物在靶基因下调中的活性（表 2）。

4。讨论

由于缺乏有效的治疗方法，癌症仍然是全球健康负担。现有抗癌药物的无效归因于癌细胞从原发性肿瘤扩散到其他组织，并且还受到低递送和高毒性的阻碍。因此，人们的兴趣和使用增加

图 7。用生物 AgNPs 处理的 CAM 上的 iNOS 表达。AgNPs 抑制鸡绒毛尿囊膜上的血管生成特异性基因表达。每个条上的不同字母表示由单向 AVOVA 产生的显着差异 (p < 0.05)。星号 (*) 表示在事后分析后与阴性对照有显着差异 (p < 0.05)。

图 8。用生物AgNPs处理的CAM上的VEGF表达。AgNPs 抑制鸡绒毛尿囊膜上的血管生成特异性基因表达。每个条上的不同字母表示由单向 AVOVA 产生的显着差异 (p < 0.05)。星号 (*) 表示在事后分析后与阴性对照有显着差异 (p < 0.05)。

团体

阴性对照

阳性对照

AgNPs (100 µg/ml)

AgNPs (200 µg/ml)

2^-ddct (iNOS)

1.00 ± 0.016

0.153 ± 0.004

0.68 ± 0.048

0.089 ± 0.014

2^-ddct (VEGF)

1 ± 0.02

0.13 ± 0.004

0.36±0.01

0.24±0.04

倍数变化 (iNOS)

1

6.54

1.47

11.25

倍数变化 (VEGF)

1

7.61

2.76

4.14

表 2。用生物源 AgNPs 处理后靶基因（iNOS 和 VEGF）的相对基因表达。

基于植物的疗法，因为植物衍生产品已显示出治疗不同癌症类型的前景。据报道，印度楝树 ( Azadirachta indica ) 在其他植物中具有抗癌活性 [ 6 ] [ 22 ] [ 28 ]。然而，在癌症治疗中使用植物衍生产品面临着许多瓶颈，例如活性植物化学物质对靶细胞的生物利用度有限和毒性[ 7 ]。因此，它促进了靶向治疗，可以通过纳米技术改善药物输送系统并最大限度地减少副作用 [ 8 ]。

目前的研究分别使用鸡绒毛尿囊膜 (CAM) 测定和伤口愈合测定研究了从印楝树茎皮甲醇提取物合成的生物源 AgNPs 的抗血管生成和抗转移活性。此外，使用 CAM 分析，我们使用环磷酰胺作为阳性对照，探索了 NPs 对与血管生成（iNOS 和 VEGF）有关的基因表达的影响。结果表明，生物源 AgNPs 对 CAM 具有抗血管生成作用，并且对 DU-145 人前列腺癌细胞具有抗转移活性。

血管生成是一个生理过程，涉及从预先存在的血管床形成新血管。它也是癌症的标志之一，与肿瘤生长、侵袭和转移有关 [ 12 ]。鉴于此，由于肿瘤血管在遗传上不稳定且与正常血管不同，因此它们是治疗所有类型癌症的潜在靶点。CAM已被广泛用于研究血管生成、肿瘤细胞侵袭和转移，由于其高度血管化的性质，促进肿瘤细胞移植的效率，高重复性，优于其他方法；简单性和成本效益 [ 23 ] [ 29]。在这项研究中，在空间参数（包括血管面积、血管百分比面积、接头总数、总血管长度、平均血管长度和接头密度）以剂量依赖性方式显着减少后，抗血管生成明显。此外，与阳性对照（环磷酰胺）一起，在此评估的血管生成相关基因被生物源 AgNPs 显着下调，表明其潜在的抗癌活性靶向血管生成过程中与这些基因有关的途径。对于表征分形中间隙分布的空隙，与阴性对照相比，高浓度 (200 µg/ml) NPs 治疗组和阳性对照显着增加，这表明高剂量的生物源 AgNPs 具有抗血管生成特性。

本研究分析了形态学参数，以揭示处理对胚胎发育的影响。结果显示胚胎体重以剂量依赖性方式降低。然而，在所有组中没有观察到显着差异。此外，除了显着降低 CRL 的阳性对照之外，与阴性对照相比，冠臀长度 (CRL) 没有显示出显着差异。因此，生物源 AgNPs 不影响胚胎发育并且对胚胎没有毒性。一些研究报告了 NPs 的毒性，可导致大量产生活性氧 (ROS) 和上调与细胞应激和毒性有关的基因 [ 30] 这可能会导致体重下降。在用高浓度金纳米粒子处理的肉鸡中报道了这样的观察结果 [ 31 ]。当前研究的形态学分析旨在通过改变测量的参数来检查生物 AgNP 可能施加的毒性。情况并非如此，因为没有记录到毒性的证据，因此，来自印楝树树皮甲醇提取物的生物 AgNPs可以被认为是安全的抗癌剂。

我们的研究结果与其他报告一致，其中使用唾液合成的生物 AgNPs通过显着减少血管的平均数量和长度来阐明 CAM 的抗血管生成特性 [ 24 ]。结果也与在地衣芽孢杆菌生物质（平均大小为 500 nm）中生物合成的 AgNPs 的结果一致，表现出补充外源 VEGF 的牛视网膜内皮细胞的抗血管生成、抗增殖和抗迁移活性，这归因于NPs 对 PI3K/Akt 信号通路的失活 [ 19 ]]。然而，该结果与另一项研究相冲突，其中聚（乙烯基吡咯烷酮）涂层的AgNP（尺寸为 2.3 nm）通过产生活性氧（ROS）和血管生成因子（如VEGF 和一氧化氮 (NO) [ 32 ]。此外，银纳米粒子上调了 FAK、Akt、ERK1/2 和 p38，这些都参与了 VEGFR 介导的信号通路。报告的促血管生成作用可能是由于表面聚合物涂层的存在和 NPs 的较小尺寸，而其他研究报告了 AgNPs [ 12 ]的抗血管生成潜力，包括本研究使用平均尺寸为 58 的 NPs纳米。

在这项研究中，血管生成相关基因（iNOS 和 VEGF）随着明显剂量依赖性的倍数变化而下调。结果与在癌症中用 Res-纳米颗粒治疗后血管生成标志物 iNOS 和 VEGF-A 的减少一致，富含干细胞样的口腔癌细胞生态位的倍数变化分别为 2.5 和 5.1 [ 33 ]。肿瘤血管生成研究发现了肿瘤血管生成的主要分子驱动因素，血管内皮生长因子 (VEGF) 家族由于其无处不在的性质而成为抗血管生成药物的主要靶标，更重要的是在大多数人类癌症中上调 [ 13 ]。VEGF 通过激活 VEGF/VEGF 受体途径阐明促血管生成作用 [ 34]。当前研究的结果证明了生物源 AgNPs 通过可能使 VEGF/VEGF 受体通路失活而在下调 VEGF 中发挥的作用。从油菜花粉中生物合成的 AgNPs 也能够下调 VEGF，从而抑制乳腺癌的发生 [ 35 ]。此外，古鲁纳坦等人。[ 19 ]，报道了从地衣芽孢 杆菌生物质生物合成的 AgNPs在小鼠模型中抑制 VEGF 诱导的牛视网膜内皮细胞增殖和迁移以及微血管形成的潜力，这归因于 PI3K/Akt 信号通路的失活[ 19 ]。

另一方面，在细胞因子暴露后表达的 iNOS 会产生一氧化氮，一氧化氮是一些重要的癌症相关过程（如血管生成和转移）的重要调节剂 [ 15 ]。众所周知，一氧化氮合酶 (NOS) 的上调会促进许多促血管生成因子，例如 VEGF、成纤维细胞生长因子 (FGF2) 和 Ang2，其中发现抑制 iNOS 会阻止大鼠模型中的血管生成 [ 16]。本研究中 iNOS 的下调描述了树皮甲醇提取物的生物源性 AgNPs 可以通过下调 NOS 的活性，从而减少一氧化氮的产生量，从而减少促血管生成的量，从而在分子水平上发挥潜在抗癌剂的作用。细胞释放的因子。iNOS 对 VEGF 表达有深远的影响，它们之间的相互关系形成一个 NO-VEGF 轴，该轴形成抗癌剂抑制肿瘤血管生成、生长和进展的靶点 [ 14 ]。VEGF 通过 iNOS 合成的 NO 与 NO 敏感的鸟苷酸环化酶的相互作用促进血管生成，从而产生环磷酸鸟苷 (cGMP)，通过 VEGF-NO 通路向下游传递信号 [ 36]。例如，VEGF-NO 通路的激活改善了大鼠后肢缺血诱导的血管生成 [ 37 ]。通常，从 CAM 测定中观察到的抗血管生成作用并得到本研究中 iNOS 和 VEGF 下调的支持，部分表明生物源性 AgNPs 的活性是通过灭活与血管生成有关的 VEGF-NO 和 VEGF/VEGF 受体途径来实现的。

关于生物源 AgNPs 的抗转移作用，进行了伤口愈合试验。我们的研究结果表明，与阴性对照相比，在 2D 伤口愈合试验中，生物源 AgNPs 对 DU-145 前列腺癌细胞的细胞迁移具有抑制作用。在孵育 72 小时后，阴性对照的伤口完全闭合，而处理过的 NPs 和阳性对照的伤口没有闭合。我们的结果与其他发现一致，其中AgNPs描述了从番荔枝果实提取物中生物合成的 AgNPs 对 HeLa 细胞的抗迁移作用[ 38 ]。随着细胞从原发性肿瘤扩散到远处，转移会导致癌症预后不良和存活率下降 [ 39]。因此，新的治疗剂对于防止发生转移很重要。我们的结果表明，Biogenic AgNPs 对 DU-145 具有抗转移作用，被认为是一种潜在的抗癌药物。这些结果与上面观察到的抗血管生成活性同步，因为血管生成和伤口愈合之间存在相关性。出于这个原因，大多数促血管生成纳米纤维已被用于加速组织修复和再生，尤其是刺激伤口愈合 [ 40 ]。当细胞无法从所造成的伤口中恢复时，表明细胞间通讯受到抑制，从而干扰了它们的转移潜能 [ 39]。当使用最高剂量 (30 µg/ml) 时，观察到一些漂浮细胞的伤口大小部分增加，这可能是由于细胞毒性作用。因此，我们建议使用印楝树茎皮的甲醇提取物合成的生物源 AgNPs 可以被认为是一种抗癌剂候选物，因为它具有良好的抗转移特性。

5. 结论

来自印楝树皮甲醇提取物的生物 AgNPs分别使用鸡绒毛尿囊膜和伤口愈合试验阐明了良好的抗血管生成和抗转移活性。基因表达的进一步分析揭示了 NPs 下调血管生成相关基因（iNOS 和 VEGF）的潜力。基因表达分析提示了 NPs 用于抑制血管生成的可能机制，即 VEGF-NO 和 VEGF/VEGF-R 通路的失活。从目前工作中呈现的结果来看，鉴于现有抗癌药物的局限性，我们主张对该产品进行进一步研究，包括其体内功效和安全性评估为了产生可靠的信息，可以推动其作为纳米技术产生的新型抗癌剂之一进行临床试验。

资金

这项研究得到了泛非大学基础科学技术与创新研究所 (PAUSTI) 下的非洲联盟的财政支持。

致谢

作者感谢泛非大学支持这项研究。还要感谢肯尼亚医学研究所 (KEMRI) 传统医学和药物开发中心的 Mercy Jepkorir 女士和 Nicholas Adipo 先生，以及内罗毕大学兽医生理学和解剖学系的 Milkah Wanjohi 女士慷慨的技术支持。

利益冲突

作者声明与本文的发表没有利益冲突。

参考

[ 1 ] Jemal，A.，等人。(2012) 非洲的癌症负担和预防机会。癌症，118, 4372-4384。

[ 2 ] Martin, TA, Ye, L., Sanders, AJ, Lane, J. 和 Jiang, WG (2013) 居里夫人生物科学数据库。兰德斯生物科学，奥斯汀。

[ 3 ] Roy, ​​A. 和 Bharadvaja, N. (2017) 治疗癌症的药用植物：综述。国际补充与替代医学杂志，9，第 291 号文章

[ 4 ] Greenwell, M. 和 Rahman, P. (2015) 药用植物：它们在抗癌治疗中的应用。国际药物科学研究杂志，6, 4103-4112。

[ 5 ] Rahmani, A.、Almatroudi, A.、Alrumaihi, F. 和 Khan, A. (2018) 印楝 (Azadirachta indica) 的药理和治疗潜力。生药学评论，12, 250-255。

[ 6 ] Sokei, J. (2018) 印楝树皮提取物稳定的银纳米颗粒：抗增殖活性、急性毒性研究和抗肿瘤活性。泛非大学基础科学技术与创新研究所 (PAUSTI)，肯尼亚内罗毕。

[ 7 ] Siddiqui, IA 和 Sanna, V. (2016) 纳米技术对提供用于癌症预防和治疗的天然产品的影响。分子营养与食品研究，60, 1330-1341。

[ 8 ] Vazhappilly，CG 等。(2021) 改进植物类黄酮在癌症治疗中的生物利用度、递送和治疗功效的当前方法。营养生物化学杂志，94，文章 ID：108623。

[ 9 ] Pucci, C.、Martinelli, C. 和 Ciofani, G. (2019) 癌症治疗的创新方法：当前观点和新挑战。Ecancermedicalscience，13，第 961 条。

[ 10 ] Feng, B.、Zhou, F.、Wang, D.、Xu, Z.、Yu, H. 和 Li, Y. (2016) 用于治疗转移性癌症的金纳米材料。中国科学化学, 59, 984-990.