银屑病患者皮肤组织、外周血单个核细胞和血清中miR-155和miR-146a的表达及其临床意义

摘要：目的：探讨miR-155和miR-146a在不同来源银屑病患者中的表达及临床意义。方法：采用QRT-PCR法检测30例寻常型银屑病患者和30例健康人作为正常对照组的寻常型银屑病组织、外周血单个核细胞和血清中miR-155和miR-146a的表达水平，并分析了不同来源银屑病样本中miR-155和miR-146a表达水平的相关性。以及治疗后外周血单个核细胞和血清中miR-155和miR-146a的表达水平。结果：银屑病患者皮肤组织、外周血单个核细胞和血清中miR-155和miR-146a的表达明显高于正常对照组（P<0.01）。miR-155和miR-146a在银屑病实验组皮肤组织、外周血单个核细胞和血清中高表达（P < 0.01）。治疗后外周血单个核细胞和血清中miR-155和miR-146a的表达降低（P < 0.05）。结论：不同来源银屑病样本中miR-155和miR-146a水平显着升高可能介导银屑病活动过程中涉及的免疫机制。

关键词

银屑病, miR-155 , miR-146a

一、简介

牛皮癣是一种慢性炎症性皮肤病，容易复发，病程较长。全身皮肤可出现红斑、鳞屑，严重影响患者的生活质量[ 1 ]。目前银屑病的患病率约为1.5%～3%，且呈逐年上升趋势。银屑病的发病机制复杂多样，与遗传、环境、免疫、内分泌、神经精神等因素有关[ 2] MicroRNA（miRNA）作为内源性基因编码的调控因子，可参与细胞生命活动的各种过程，与免疫炎症性疾病密切相关。使用生物信息学方法，我们发现银屑病患者血清中 miR-155 和 miR-146a 的表达水平存在显着差异。作为miRNA家族的重要成员，miRNA-155在T淋巴细胞的调节中发挥重要作用，据报道在特应性皮炎、人类免疫缺陷病毒感染、类风湿性关节炎等免疫相关疾病中发挥重要作用。miR-146a 是 microRNA 家族的成员。大多数脊椎动物有两个编码miR-146的基因，即miR-146a和miR-146b。其中，miR-146a基因位于Q33.3，miR-146b基因位于10Q24.32。3 ]。miR-155在寻常型银屑病患者皮肤组织中高表达[ 4 ]，miR-146a也高表达[ 5 ]。然而，大多数研究集中在银屑病皮肤组织、外周血单个核细胞中的表达验证，而在血清中表达的研究较少，本文系统研究了寻常型银屑病患者皮肤组织和外周血单个核细胞、血清 miR- 155、miR-146——一种表达方式及其相关性，以及治疗前后关系的变化，探讨其临床意义。

2.对象和方法

2.1。科目

选取2016年7月至2017年7月在海南省琼海市人民医院皮肤科和重庆市中医院皮肤科收治的30例寻常型银屑病患者作为银屑病实验组。所有患者均有典型的临床表现并经病理证实。诊断符合临床标准[ 6]。样本在收集前至少 1 个月未用糖皮质激素、类维生素 A、免疫抑制剂或补骨脂素或紫外线（UVA，波长 320-420 nm）处理。采血前肝肾功能及尿常规均在正常范围内。患者年龄在20-65岁之间，病程6-9年。排除标准：伴有其他类型皮肤病，尤其是系统性红斑狼疮、皮肤肿瘤等；患有类风湿性关节炎、肝肾功能异常等其他严重疾病的患者；孕妇和哺乳期妇女、经期妇女，有白内障和光疗禁忌症。选取同期无全身性疾病或其他自身免疫性疾病的健康受试者30例作为正常对照组，年龄 20 - 65 岁。本研究经琼海市人民医院伦理委员会批准，所有标本来源的患者和健康对照均签署知情同意书。

2.2. 主要试剂和仪器

SYBR Perfect Real-Time Kit、M-MLV(Moloney Murine Leukemia Virus) Reverse Transcriptase、M-MLV Reverse Transcriptase和RNAiso for Small RNA提取试剂购自北京宝日博士材料科技有限公司。TransScript ⅱFirst-strand cDNA Synthesis SuperMix Kit 购自北京 Whole Type Gold，IL-17A Human ELISA Kit 购自 Thermo Fisher Scientific。荧光定量PCR仪LightCycler 480，Roche Pharmaceuticals，Switzerland；高压灭菌器，Tomi Corporation，日本；通用PCR仪，美国博乐公司；低温高速离心机，德国艾本德。

2.3. 实验方法

2.3.1。样品采集

皮肤组织：0.5 × 0.5 cm 2银屑病皮肤组织和 0.5 × 0.5 cm 2收集外周皮肤组织并用液氮冷冻并储存在-80°C。外周血单个核细胞：抽取肘静脉血10mL（柠檬酸钠抗凝），生理盐水等量稀释。使用细胞培养购买的15mL无菌离心管。先向内加入5mL淋巴细胞分离液，然后用无菌滴管沿试管壁缓慢加入稀释后的血液。在此过程中，必须保持界面清晰，将稀释后的血液分两次加入淋巴细胞分离液中。将溶液以 2500 r/min 水平离心 25 min，分成三层。使用无菌移液器，将位于中间液体层的单核细胞层轻轻吸入新的离心管中。用PBS稀释并洗涤2-3次，再次以3000 r/min离心细胞5分钟。此时，细胞位于离心管底部，加入1 mL RNAiso for Small RNA试剂，-80℃冷冻。

血清：抽取肘静脉血5 mL，室温放置2 h，800×g离心，取上清液作为外周血血清样品，分2份，每份500 μL，80℃冷冻。

2.3.2. RNA 提取和 cDNA 合成

称取组织0.2g，液氮研磨法粉碎。添加了 1 mL RNAiso for Small RNA 试剂。分离外周血单个核细胞后，直接加入1 mL RNAiso for a Small RNA试剂。取血清 500 μL，加小 RNA 试剂 1 mL RNAiso；提取过程严格按照 RNAiso 对 Small RNA 试剂的说明进行。cDNA合成：采用stem-loop法进行逆转录，全程以U6作为内参基因。引物如下表1所示。总系统 20 μL，提取的小 RNA 8 μL，茎环 RT 引物 2 μL（即miR-155 和 miR-146a 分别为 1 μL），U6 逆转录引物 1 μL，RNase 抑制剂 1 μL，逆转录酶 (M-MLV) 1 μL，5 × 1 st Strand Synthesis Buffer 5 μL，dNTP 5 μL，瞬时离心机混合，反应条件为 65℃ 10 分钟。25°C 15 min, 42°C 60 min, 75°C 15 min, 反应后-20°C保存。

2.3.3. 荧光定量PCR

荧光定量PCR检测采用嵌合染料SYBR法。整个过程严格按照SYBR Perfect Real-Time试剂盒的制度和条件进行。引物序列如下表2所示。以U6为参考基因，采用2 - ΔΔCT法计算结果。在每个反应中，每个样品至少重复 3 次。使用荧光分析软件对结果进行自动量化，最后取平均值。

2.4. 统计分析

采用SPSS 22.0软件进行数据统计，数据以均数±标准差表示。具体来说，首先进行方差齐性检验和筛选。根据F值表，如果F检验值>0.05，则t检验值通过等方差二样本检验得到；若F检验值<0.05，则根据异方差二样本检验得到T检验值。采用配对T检验分析皮损及邻近组织中miR-155和146a的表达，P<0.05为差异有统计学意义。

3. 结果

3.1。miR-155和146a的表达检测

结果表明，miR-155和146a的扩增曲线呈s形，

姓名

miRBase

逆转录颈环引物

hsa-miR-155

MIMAT0000646

5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACCCCTAT-3'

hsa-miR-146a

MIMAT0000449

5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAACCCATG-3'

U6

5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'

表 1。逆转录宫颈环引物序列表。

姓名

上游检测引物

下游检测引物

hsa-miR-155

5'-TTAATGCTAATCGTGATA-3'

5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'

hsa-miR-146a

5'-TGAGAACTGAATTCCATGG-3'

5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'

U6

5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'

5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'

表 2。通过实时 PCR 检测的引物。

溶出曲线Tm值单一，说明实现了不同样品来源的miR-155和146a的特异性荧光定量PCR检测，扩增得到的Ct值可用于后续分析。图 1。

3.2. miR-155和146a在银屑病实验组皮肤和副皮肤组织中的表达

实验组皮肤组织中miR-155的表达为（3.57±1.05），显着高于皮肤旁组织（1.27±0.28）（t=8.324，P<0.01）。miR-146a的表达水平为（2.18±0.59），显着高于皮肤旁组织（1.12±0.37），差异极显着（t=5.213，P<0.01），见表3 .

3.3. 银屑病实验组外周血皮肤组织和副皮肤组织中miR-155和146a的表达

实验组外周血单个核细胞中miR-155的表达水平为（5.31±1.23），显着高于正常组。

图 1。miR-155 和 146a 的扩增和溶出曲线。(a) miR-155；(b) miR-146a。

ñ

腋下组织

皮肤组织

miR-155

30

1.27±0.28

3.57 ± 1.05*

miR-146a

30

1.12±0.37

2.18 ± 0.59*

表 3。治疗前后血清miR-155/146a水平检测结果。

注：VS 病灶旁组织，*P < 0.01。

对照组（1.53±0.39）（t=12.561，P<0.01），miR-146a的表达水平为（4.13±1.05）。显着高于正常对照组（1.41±0.62），差异极显着（t=8.647，P<0.01）；实验组血清中miR-155的表达水平为（1.84±0.52），显着高于正常对照组（1.05±0.34）（t=3.152，P<0.01），miR-146a的表达水平显着高于正常对照组（1.05±0.34）。为（2.71±0.37），显着高于正常对照组（1.18±0.27）。差异极显着（t=4.322，P<0.01），如表4所示。

正常对照组

牛皮癣实验组

ñ

单核细胞

血清

单核细胞

血清

miR-155

30

1.53±0.39

1.05±0.34

5.31 ± 1.23*

1.84 ± 0.52*

miR-146a

30

1.41±0.62

1.18 ± 0.27

4.13 ± 1.05*

2.71 ± 0.37*

表 4。各组外周血单个核细胞及血清miR-155、146a的表达水平。

注：VS 正常对照组，*P < 0.01。

3.4. 来自不同银屑病样本的 miR-155 和 146a 的相关性

银屑病组患者皮肤组织、外周血单个核细胞和血清中miR-155表达同时上调，呈正相关（r=0.636、0.524、0.443，P<0.05）。银屑病实验组皮肤组织、外周血单个核细胞和血清中miR-146a的表达也上调，呈正相关（r=0.725、0.661、0.527，P<0.05）。

3.5. 银屑病患者治疗前后外周血单个核细胞及血清miR-155、146a的表达

治疗后，实验组外周血单个核细胞中miR-155的表达水平为（2.31±0.41），显着低于治疗前（5.31±1.23）（t=7.345，P<0.01）。 miR-146a的表达水平为（2.13±0.55）。显着低于治疗前（4.13±1.05）（t=5.334，P<0.01）；实验组血清中miR-155的表达水平为（1.24±0.29），显着低于治疗前的（1.84±0.52）（t=2.18，P<0.05），miR-155的表达水平显着低于治疗前（1.84±0.52）。 146a为（1.69±0.42），明显低于治疗前（2.71±0.37）。差异极显着（t=2.71，P<0.05），见表5。

4。讨论

银屑病具有特定的 miRNA 表达谱，在皮肤中发现了大量的 miRNA。其中一些重要的 miRNA 发挥了作用

牛皮癣实验组治疗前

牛皮癣实验组治疗后

ñ

单核细胞

血清

单核细胞

血清

miR-155

30

5.31±1.23

1.84±0.52

2.31 ± 0.41*

1.24±0.29#

miR-146a

30

4.13±1.05

2.71±0.37

2.13 ± 0.55*

1.69±0.42#

表 5。各组外周血单个核细胞及血清miR-155、146a的表达水平。

注：VS银屑病组治疗前，# P<0.05，*P<0.01。

作为银屑病中的一类转录后基因调节剂。迄今为止，已发现超过 250 种 miRNA 在银屑病患者的外周血或皮肤病变中异常表达 [ 7 ]。miR-155 在皮肤病变和外周血单核细胞中高度表达 [ 8 ]。miR-146a 在皮肤病变和外周血单核细胞中高度表达 [ 5 ] [ 9 ]。本文对不同来源样本中miR-155和miR-146a的表达进行分析，结果显示皮肤组织、外周血单个核细胞和血清重量均高表达，与已发表的结论一致.

miR-146a和miR-155与免疫炎症密切相关，通过靶向炎症介质在体内和体外调节规范性炎症基因表达，以确保适当水平的宿主炎症反应[ 10 ]。研究表明，miR-155可调节寻常型银屑病患者外周血CD4~+T细胞分化为Th17细胞，从而参与炎症反应[ 11 ]。miR-146a 对靶基因 IRAK1 的不受控制的调节也是银屑病病变持续炎症的主要原因 [ 12]。Pearson相关分析显示，miR-155/146a在皮损、外周血单个核细胞和血清中的表达状态一致。因此，miR-155/146a在外周血单个核细胞和血清中的高表达可能是发挥炎症介质的体现。皮肤损伤中 miR-155/146a 的高表达必须由调控靶基因进行。本文并未探讨 miR-155/146a 在组织中的功能研究，但以往研究发现 miR-155 通过 PTEN 信号通路促进银屑病细胞增殖并抑制细胞凋亡 [ 13 ]]。miR-146a可能在翻译水平通过靶基因Smad4调控VEGF的表达，VEGF的过表达促进银屑病的炎症反应和血管生成，促进银屑病的发生和发展[ 14 ]。近年来，已发现血清 miRNA 水平在各种疾病的诊断、预防和治疗中是有用的生物标志物 [ 15 ] [ 16 ]。

5. 结论

本文收集银屑病患者外周血单个核细胞和血清 miRNAs 研究 miR-155/146a，发现银屑病患者外周血单个核细胞和血清 miR-1266-5p 的高表达降低治疗后明显。这些结果提示miR-155/146a参与了银屑病的治疗过程，可能为未来银屑病的治疗提供新思路。

利益冲突

作者声明与本文的发表没有利益冲突。

参考

[ 1 ] Zhang, JZ (2013) 银屑病的流行病学和危险因素。临床外科杂志，10，4-6。

[ 2 ] 王，MX，王，Y.，赵，JX，等。(2017) 银屑病发病机制研究进展。辽宁中医药杂志, 44, 1334-1338.

[ 3 ] Ruksha, TG, Komina, AV 和 Palkina, NV (2017) 皮肤病中的 MicroRNA。欧洲皮肤病学杂志，27，343-352。

[ 4 ] 他，Q.，PI，XM，施，Q.，等。(2016) microRNA-155 在寻常型银屑病中的表达和意义。实用医学杂志，32，900-903。

[ 5 ] 邓，HY，林，L.，周，X.，等。(2016) miR-146a 在寻常型银屑病患者皮肤病变中的表达和意义。中国中西医结合皮肤静脉学杂志，15，142-144。

[ 6 ] Zhao, B. (2017) 中国临床皮肤病学。江苏凤凰科技出版社，南京，12-14。

[ 7 ] Liu, Y. 和 Liu, Q. (2016) MicroRNAs 作为银屑病的调控元件。开放医学（战争），11，336-340。

[ 8 ] 马，L.，高，ML，薛，HB，等。(2017) miR-155 在寻常型银屑病患者外周血和皮肤病变中的表达及其与 Th17 细胞的相关性。中国皮肤性病学杂志, 31, 494-496.

[ 9 ] Luo, Q.、Liu, W.、Zhao, T.、Zhang, F.、Li, W.、Lin, L. 和 Zhang, XB (2015) 银屑病患者外周血单个核细胞中 miR-146a 的表达寻常型及其临床意义。性病诊断和治疗，22, 278-280。

[ 10 ] 段，Q.，毛，X.，肖，Y.，等。(2016) miR-146a 和 miR-155 基因的超级增强剂有助于炎症的自我调节。Biochimica et Biophysica Acta, 1859, 564-571。