血管紧张素II AT1受体拮抗和CD44基因表达沉默通过调节TGF-β1/Smad信号通路抑制心脏成纤维细胞活化

摘要：已知血管紧张素 II (Ang II) 通过激活体内模型中的 AT1 受体和 CD44 表达来引发心脏纤维化。然而，心脏纤维化的细胞/分子机制仍未得到很好的理解。本研究通过 Ang II 刺激的心脏成纤维细胞检查 AT1 受体和 CD44 基因表达在胶原合成中的作用。从新生大鼠心脏中分离出成纤维细胞；使用细胞活力和迁移测定评估成纤维细胞的活化，并用小干扰RNA（siRNA）进行CD44基因表达的沉默。结果表明，Ang II显着增加细胞增殖并以剂量依赖性方式迁移。激活后，TGF- β1、Smad2、Smad4 和胶原蛋白 I 的蛋白质水平显着增加（与未刺激的细胞相比，所有 p < 0.05），但这些变化被AT1 受体阻滞剂替米沙坦显着下调（所有 p < 0.05与 Ang II 激活的细胞相比）。此外，CD44的mRNA和蛋白水平上调，CD44与TGF- β呈线性相关。1 如 Pearson 相关分析所示 (r = 0.955, p < 0.01)。用 Ad-CD44 siRNA 对成纤维细胞进行基因转染，如低水平的 CD44 mRNA 和蛋白质所证明的那样，显着降低了胶原蛋白 I 的产生。 总之，这些结果表明来自 Ang II 激活的心脏成纤维细胞的增殖、迁移和胶原蛋白产生是可能由 AT1 受体和 CD44 介导。这种信号机制可能对胶原蛋白的产生和心脏组织纤维化的发展至关重要。

关键词

血管紧张素 II AT1 受体, CD44 ,胶原蛋白,成纤维细胞,替米沙坦

一、简介

心脏成纤维细胞，定义为心脏中非心肌细胞的细胞，通常是具有大椭圆形/扁平多形核的梭形细胞，可在心肌的间质空间中找到[ 1 ]。在正常情况下，心脏成纤维细胞通过产生纤维状胶原蛋白作为细胞外基质蛋白的主要成分，为心肌细胞提供结构支架，以维持心脏的结构完整性 [ 2 ] [ 3 ]]。在心肌受到机械或化学损伤后，心脏成纤维细胞的数量会通过常驻成纤维细胞的复制、内皮细胞的转化或骨髓细胞的迁移而增加。心脏成纤维细胞中细胞外基质蛋白的过量产生和沉积导致心脏纤维化的发展，对心肌结构和功能产生不利影响 [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ]。

CD44抗原是一种跨膜糖蛋白，主要在大量哺乳动物细胞类型如炎症细胞和血管细胞中表达，并参与细胞粘附和迁移[ 7 ]。CD44 的主要配体是透明质酸，它是细胞外基质的主要糖胺聚糖成分，在心肌间质中随着心脏成纤维细胞的活化而上调。心脏成纤维细胞上的细胞表面 CD44 是透明质酸的粘附受体，可促进成纤维细胞增殖和迁移到纤维蛋白基质中。活化的心脏成纤维细胞反过来会产生过多的纤维化细胞外基质，并导致心脏纤维化和心肌细胞肥大[ 8 ]。

在血管紧张素 II (Ang II) 输注的大鼠模型中，我们之前报道过用选择性 AT1 受体阻滞剂替米沙坦阻断 Ang II AT1 受体可减少心肌纤维化，这主要是通过下调成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化来介导的。从浸润的巨噬细胞释放的转化生长因子-β1（TGF-β1）的表达。与这种对 AT1 受体的阻断同时，心肌中 CD44 蛋白的表达被下调 [ 9 ]。此外，CD44 缺乏通过抑制炎性细胞因子和氧化应激来减少 Ang II 诱导的心肌纤维化 [ 10]。众所周知，成纤维细胞响应 TGF-β1 刺激而分化为肌成纤维细胞后，在介导纤维化级联反应中起关键作用 [ 9 ]。然而，在包括我们的研究在内的大多数先前观察中，使用来自整个心脏的均质组织块检查了 AT1 受体的阻断，并使用免疫组织化学染色鉴定了微血管和心肌上 CD44 的表达 [ 9 ] [ 10 ] [ 11 ] [ 12 ] [ 13]。此外，尽管已经进行了许多研究，检查了 Ang II 在各个器官中对成纤维细胞的激活，但目前，我们不知道 Ang II 刺激或 CD44 基因表达的上调是否对心脏的激活、增殖和迁移有直接的积极作用。成纤维细胞。因此，使用来自新生儿心脏的分离的心脏成纤维细胞，我们检查了 Ang II 刺激的心脏成纤维细胞的迁移/分化是否可以被 AT1 受体阻滞剂替米沙坦阻断，以及 CD44 基因表达的沉默是否可以抑制心脏成纤维细胞的活化。

2。材料和方法

2.1。抗体

针对心肌肌钙蛋白 I (ab47003)、波形蛋白 (ab8978)、TGF-β1 (ab25121)、胶原蛋白 I (ab90395) 的一抗购自 Abcam（英国）。针对 DDR2 (N-20) (sc7555)、von Willebrand 因子 (vWF) (sc27649) 的一抗购自 Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA)。针对 p-Smad2 (No. 3108) 和 Smad4 (No. 9515) 的一抗购自 Cell Signaling Technology (Boston, MA, USA)。针对 CD44 (bs2507R) 的一抗购自 Bioss Technology (Beijing, China)。驴抗小鼠 IgG、Alexa Fluor 488 (A21202) 和驴抗山羊 IgG、Alexa Fluor 594 (A11058) 购自 Life Technologies (Waltham, MA, USA)。山羊抗兔 IgG (CW0103) 和山羊抗小鼠 IgG (CW0102) 购自 ComWin Biotch Co.（中国北京）。

2.2. 新生大鼠心脏成纤维细胞的分离培养

所有程序均按照美国国立卫生研究院出版并于2011年修订的《实验动物使用护理指南》（第8版）执行。实验方案经山西省实验动物管理委员会批准中国太原大学（批准文号2015-0001）。

1 至 3 日龄 Sprague-Dawley 大鼠获自山西医科大学动物实验中心。如前所述 [ 13 ]，使用改进的差分附着方法从大鼠中分离出心脏成纤维细胞]。简而言之，将完整的心脏迅速取出，放入冷的磷酸盐缓冲盐水中冲洗并冲洗血液3-4次。排除结缔组织和心房后，将心室切碎成 1 立方毫米的组织块，用含有 0.08% 胰蛋白酶和 0.04% II 型胶原酶的混合酶溶液在 37°C 下消化 6 分钟，共 8-10 个循环. 将切碎的组织溶液通过 70 µm 细胞过滤器过滤，并在室温下以 800 g 离心 10 分钟。将收集的细胞接种在添加了 10% FBS 的中等 DMEM 培养基的孔中，然后在 95% O 2和 5% CO 2下孵育37℃以下。两小时后，丢弃未附着的细胞，将附着的细胞在 37°C 下接种在含有 10% FBS 的新鲜 DMEM 培养基中。当细胞融合程度达到约80%时，用胰蛋白酶EDTA消化细胞并传代。使用 2-4 代细胞进行后续实验。在每次测定之前，将分离的心脏成纤维细胞与无血清 DMEM 培养基一起孵育并同步 24 小时。在以下观察中，将细胞暴露于新鲜培养基溶液（对照）、Ang II 激活（10 nM 至 1 µM）或 Ang II（50 nM）加替米沙坦（100 nM）。替米沙坦剂量的选择是基于其对胶原蛋白分泌和 Ang II 刺激的心脏成纤维细胞产生的抑制作用 [ 14 ]。

2.3. 免疫荧光染色

选择用波形蛋白和 DDR2 (N-20) 对成纤维细胞、vWF 对内皮细胞和心肌肌钙蛋白 I 对心肌细胞进行免疫荧光染色，以确定分离的细胞是否是心脏成纤维细胞，而不是内皮细胞和心肌细胞。简而言之，细胞以 1 × 10 4的密度铺板每孔在 96 孔板中，用 4% 多聚甲醛固定，然后用 0.5% Triton X-100 洗涤。免疫荧光染色分别用波形蛋白（1:50 稀释）、DDR2 (N-20)、vWF 和心肌肌钙蛋白 I（均以 1:100 稀释）在 4°C 下孵育过夜。然后相应地在室温下应用包括驴抗小鼠IgG、Alexa Fluor 488或驴抗山羊IgG、Alexa Fluor 594的二抗90分钟。细胞核用 DAPI 染色 10 分钟。最后，观察细胞的形态，并使用数码相机（Olympus，Japan）在荧光显微镜下拍摄照片

2.4. 细胞增殖试验

根据制造商的方案，通过 Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Dojindo, kumamoto, Japan) 评估细胞增殖测定。将心脏成纤维细胞以每孔7×10 3 个细胞的密度接种到96孔板中，并用不同浓度的Ang II处理24小时。然后将 CCK-8 试剂以 1:10 的比例添加到培养基中，在 37°C 下 2 小时，以根据制造商的说明（Dojindo，上海，中国）鉴定细胞增殖。使用酶标仪 (Molecular Devices Corp, San Jose, CA, USA) 测量 450 nm 处的吸光度以估计细胞增殖。

2.5. Transwell 迁移分析

transwell 迁移测定是研究细胞对氧化应激刺激的迁移反应的常用测试。简而言之，测定前的细胞悬液以约 1 × 10 6的密度制备/毫升。在 24 孔板中加入 500 μl 无血清培养基后，放置 transwell 小室（No. 3422, CORNING, NY, USA）；将 200 μl 细胞悬液移入上室并在 37°C 下培养 12 小时，不要接触膜或引入气泡。在孵育期（24 小时）后，通过膜迁移的细胞在室温下使用 4% 多聚甲醛固定 30 分钟。PBS洗2次后，用0.1%结晶紫溶液染色20 min。为了计算细胞迁移，使用倒置显微镜（Olympus，Japan）观察 transwell 小室，并从八个高倍视野（HPF，400 倍放大率）计算迁移细胞的数量，以获得细胞的平均总和.

2.6. 实时聚合酶链式反应 (RT-PCR)

通过实时PCR测量从细胞中检测到的CD44 mRNA水平。简而言之，使用 RNAiso plus (9108, TaKaRa, Shiga, Japan) 从细胞中分离出的 0.5 μg 总 RNA 通过 Prime Script RT Master Mix (DRR036A, TaKaRa, Shiga, Japan) 逆转录为 cDNA。选择 SYBR Premix Ex TaqTM II (rr820A, TaKaRa, Shiga, Japan) 测试 CD44 mRNA 表达。SYBR Green PCR 的热曲线为 95°C 30 秒，然后是 40 个循环，95°C 变性 5 秒，60°C 退火 20 秒。引物序列如下：

CD44（Gen-Bank 登录号，NM_012924.2），正向：5'-CTCAAGTGGGAATCAAGACAGTGG-3' 和反向：5'-TGCAGACGGCAAGAATCAGAG-3'，GAPDH（Gen-Bank ID NM_017008.3），正向：5'-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG -3' 和反向：5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3'。将扩增归一化为 GAPDH 并通过相对定量 2 -ΔΔCt方法定量 CD44 mRNA 的表达。

2.7. 蛋白质印迹分析

用 PBS 洗涤来自不同组的分离细胞，并用含有蛋白酶抑制剂（R0100，Solarbio，北京，中国）和磷酸酶抑制剂（AR1183，Solarbio，北京，中国）的裂解缓冲液（P0013，Beyotime，上海，中国）裂解 30 分钟在冰上。在 4°C 下以 14,000 rpm 离心 15 分钟后收集上清液，并使用 BCA 蛋白质测定试剂盒（23225，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）测定蛋白质浓度。上样蛋白质样品（50 μg），使用 SDS-PAGE 分离，以 15 eV 转移到 PVDF 膜上 15 分钟，并在室温下用 5% 脱脂牛奶封闭 1 小时。然后将膜与一抗（即 CD44、pSmad2、Smad4、TGF- β1, 胶原蛋白 I) 在 4˚C 过夜。洗涤3次后，将膜与偶联有辣根过氧化物酶的二抗（即山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG）一起孵育。最后，根据制造商的说明，用 Bio-Rad 成像系统辅助 ECL 试剂盒检测条带。通过 ImageJ 软件分析条带的灰度值，并在 β-肌动蛋白或 GADPH 上对蛋白质的相对表达进行归一化。

2.8. 腺病毒感染

使用小干扰 RNA (siRNA) 使细胞上的 CD44 沉默。根据由HANBIO公司（中国上海）设计的制造商的建议，分别用靶向大鼠CD44的腺病毒（Ad-CD44 shRNA1，Ad-CD44 shRNA2和Ad-CD44 shRNA3）转染处于对数生长期的细胞。编码 GFP 基因 (Ad-GFP NC) 的类似腺病毒载体用作对照。腺病毒与细胞共培养4 h后，更换新鲜培养基，继续培养细胞32 h。在荧光显微镜下观察显示绿色荧光蛋白（GFP）阳性的靶细胞。选择诱导 CD44 表达最显着降低的病毒用于正在进行的实验。所有涉及病毒操作的程序均在生物安全柜中进行。

2.9。统计分析

SPSS 21.0软件作为统计分析工具。来自六个单独实验的数据被平均为平均值±标准偏差，并通过单向方差分析进行分析。Pearson相关性检验用作相关性分析。p 值小于 0.05 被认为具有统计学意义。

3. 结果

3.1。原代培养的新生大鼠心脏成纤维细胞的鉴定

新生大鼠心脏成纤维细胞的第一次传代在第 1 天迅速生长。第 2 天的细胞传代或成纤维细胞分裂显示其典型的扩散形态，形成融合的单层培养物。非活性成纤维细胞较小，呈梭形或多角形，胞浆不规则分枝，核大卵圆形，边界清晰，屈光度好（图1（A））。使用免疫荧光染色评估细胞制备过程中分离的心脏成纤维细胞的纯度。如图1(B)，大多数细胞在结构域受体 2 (DDR2)（成纤维细胞的标志物）中被波形蛋白和盘状染色阳性。在这些细胞中没有用心肌肌钙蛋白 I 或血管性血友病因子染色表明分离的细胞不是心肌细胞和内皮细胞。为了确定在培养期间心脏成纤维细胞是否附着在板上，应用了 DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)，一种可渗透细胞的荧光 DNA 结合染料。荧光染色强度显示细胞核更小，染色更强烈，表明心脏成纤维细胞均匀分布良好（图1（B））。

图1. 培养的心脏成纤维细胞的表征。(A) 从新生大鼠心脏中分离细胞，并在平面透视条件（上图）和立体视觉条件（下图）下以 100 倍放大率拍摄的明场图像中鉴定出第二代心肌成纤维细胞的形态，分别。(B) 使用特定的成纤维细胞标志物波形蛋白 (Vim, 绿色) 和结构域受体 2 (DDR2, 红色) 中的盘状体对培养的心脏成纤维细胞进行了表征。使用心肌肌钙蛋白 I (cTnI) 和血管性血友病因子 (vWF) 对心肌细胞和内皮细胞进行染色，以确定成纤维细胞分离的纯度。使用 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI, 蓝色) 对细胞核进行染色。没有免疫荧光 cTnI 和 vWF 表明分离的细胞是心脏成纤维细胞。

3.2. Ang II 增强心脏成纤维细胞的增殖和迁移

成纤维细胞最初在第 2 天以等密度铺板后，评估了 Ang II 对心脏成纤维细胞增殖能力的剂量反应效应。与未处理的细胞（对照）相比，用细胞外 Ang II 刺激心脏成纤维细胞 24 小时显着增加了成纤维细胞增殖（50 nM 时为 0.9 ± 0.04，对照组为 0.6 ± 0.07，p < 0.05，图 2 (A)）。在 50-100 nM 的剂量范围内观察到最大增强。尽管 300 nM 或 1 μM 的较高剂量也诱导成纤维细胞增殖，但成纤维细胞的增殖程度开始下降（图 2（乙））。对照计算值显示，不同浓度的 Ang II 分别使成纤维细胞增殖增加 1.31、1.45、1.43、1.19 和 1.16 倍。基于这些结果，选择 50 nM 的 Ang II 进行后续观察。

Transwell 迁移测定用于验证 Ang II 刺激的心脏成纤维细胞的迁移。将细胞接种在 transwell 室的顶部隔室中，并确定通过可渗透聚碳酸酯膜在底部培养基中迁移的细胞数量。如图 2 (C)所示，相比于紫色染色细胞的数量显着增加

图 2。血管紧张素Ⅱ对心脏成纤维细胞增殖和迁移的影响。(A) 通过相差显微镜在暴露于浓度为 50 或 300 nM 的血管紧张素 II (Ang II) 24 小时后观察到成纤维细胞形态。(B) 通过 CCK-8 测定评估 Ang II 对细胞活力的剂量反应，并在 50 nM 时确认最大效果。(C) 在没有 Ang II (对照)、Ang II (50 nM) 和 Ang II 加 AT1 受体阻滞剂替米沙坦 (Telmi, 100 nM) 的情况下孵育 24 小时后，通过 Transwell 测定评估细胞迁移。(D) Telmi 显着阻断了 Ang II 刺激的细胞迁移。值是三个独立实验的平均值±SEM。无干预的细胞增殖率为100%。比例尺为 100 μm。

用 50 nM 的 Ang II 处理后的对照。在 Ang II 刺激前添加 Ang II AT1 受体阻滞剂 100 nM 的替米沙坦显着减少了迁移细胞的数量（图 2 (D)），表明 AT1 受体参与了细胞迁移。

3.3. 阻断 Ang II AT1 受体抑制 TGF-β1、Smads 和胶原蛋白 I 的表达

Ang II 对心脏成纤维细胞的刺激伴随着 TGF-β1 [ 9 ] 表达的变化。随着心脏成纤维细胞增殖和迁移的增强，加入 50 nM Ang II 后，TGF-β1 的蛋白水平增加了 1.57 倍（图 3(A))，它被替米沙坦显着阻断，表明 TGF-β1 从活化的成纤维细胞中的释放是由 AT1 受体介导的。与 Ang II 对成纤维细胞产生 TGF-β1 的调节作用一致，pSmad2、Smad4 和胶原蛋白 I 的蛋白质水平同时被 Ang II 上调。与对照相比，pSmad2、Smad4 和胶原蛋白 I 的蛋白水平分别增加了 1.49、2.21 和 1.97 倍，这些都被替米沙坦处理所阻断（图 3(B)-(D)）。

图 3。血管紧张素 II 对心脏成纤维细胞 TGFβ1、pSmad2、Smad4 和胶原蛋白 I 表达的影响。在没有 Ang II（对照）、Ang II 刺激（50 nM）和 Ang II 加 AT1 受体阻滞剂替米沙坦（Telmi，100 nM）的情况下，使用蛋白质印迹分析分析蛋白质水平。Telmi (A)-(D) 显着阻断了这些由 Ang II 上调的蛋白质水平。结果表示为对照的百分比。数据表示为三个独立实验的平均值±SEM。*p < 0.05 Ang II 与对照， # p < 0.05 Telmi 与 Ang II。

3.4. 阻断 Ang II AT1 受体下调 CD44 mRNA 和蛋白质的表达

为了研究 Ang II AT1 受体的刺激是否与 CD44 mRNA 和蛋白质表达的上调有关，在第 2 天使用设计用于识别成纤维细胞 CD44 基因的引物进行 RT-PCR，以获得细胞转录活性的对照基线值。与对照中基因转录物的预期基础表达相反，与对照相比，RT-PCR 在细胞暴露于 50 nM Ang II 后，在成纤维细胞中扩增了可检测量的显着 CD44 mRNA（图 4 (A)）。从对照水平对 CD44 mRNA 表达的定量显示，Ang II 使 CD44 mRNA 增加了 80.9% ± 4%。与 CD44 mRNA 的上调一致，CD44 蛋白的表达也增加了 37.9% ± 2%，如 Western blot 分析所示（图 4（乙））。添加 AT1 受体阻滞剂，浓度为 100 nM 的替米沙坦显着降低 CD44 转录活性 (47.0% ± 3%) 和蛋白质水平 (26.2% ± 1%)

图 4。Ang II 对心脏成纤维细胞 CD44 表达的影响。在没有 Ang II（对照）、Ang II 刺激（50 nM）和 Ang II 加 AT1 受体阻滞剂替米沙坦（Telmi，100 nM）的情况下，使用 RT-PCR 和蛋白质印迹分析分析 CD44 mRNA 和蛋白质的水平。50 nM 剂量的 Ang II 显着增加 CD44 mRNA (A) 和 CD44 蛋白水平 (B)。Telmi 阻止了这两项更改。Pearson相关性检验用作相关性分析。TGFβ1 和 CD44 蛋白 (C) 之间存在正线性关系。结果表示为对照的百分比。数据表示为三个独立实验的平均值±SEM。*p < 0.05 Ang II 与对照， # p < 0.05 Telmi 与 Ang II。

分别为 Ang II 刺激（所有 p < 0.05，图 4）。此外，Pearson相关分析显示CD44与TGFβ1呈线性正相关，提示CD44在促进TGFβ1上调中的作用（图4（C））。

3.5. 心脏成纤维细胞上 CD44 的沉默消除了胶原蛋白 I 表达的上调

CD44 被 Ad-CD44 shRNA (siCD44) 沉默以进一步证实 CD44 是否参与心脏成纤维细胞的活化。为了验证 siCD44 对心脏成纤维细胞中 CD44 的抑制作用，进行了 RT-PCR 和蛋白质印迹。正如预期的那样，作为阴性对照，荧光特异性 shRNA 阴性（Ad-GFP NC）显示绿色荧光蛋白（GFP）阳性细胞（图 5（A）），这进一步证实了 CD44 mRNA 水平（图 5（B ） )) 和蛋白质表达 (图 5（C））。在三个 shRNA 构建体中，shRNA1 在沉默心脏成纤维细胞上的 CD44 表达方面表现出最高的效率，减少了大约 29.3% ± 1%，而在另外两个中，Ad-GFP shRNA2 和 Ad-GFP shRNA3 没有显示出显着性对绿色荧光蛋白 (GFP) 阳性细胞数量的影响，当它们与非沉默对照 (Ad-GFP NC) 进行比较时 (图 5 (B))。因此，

图 5。CD44 沉默对心脏成纤维细胞中 CD44 mRNA、CD44 蛋白和胶原蛋白 I 的影响。通过分别用不靶向 CD44 的腺病毒 (Ad-GFP NC) 或靶向 CD44 的腺病毒 (Ad-CD44 shRNA1、Ad-CD44 shRNA2 和 Ad-CD44 shRNA3) 转染心脏成纤维细胞，对细胞进行荧光标记 (A)。CD44 mRNA (B) 和 CD44 蛋白水平 (C) 的降低证实了 CD44 沉默的功效。当细胞用 Ad-GFP shRNA1 (D) 沉默时，发现在 Ang II 存在下胶原蛋白 I 的释放没有增加。结果表示为控制水平的百分比（控制百分比）。数据表示为三个独立实验的平均值±SEM。*p < 0.05，Ang II 与对照， # p < 0.05 Ad-GFP shRNA1 加 Ang II 与 Ang II。

选择 Ad-shRNA1 用于连续建立对心脏成纤维细胞的 CD44 敲低。与CD44沉默的结果一致，CD44蛋白水平也被Ad-shRNA1显着下调（图5（C））。

选择胶原蛋白 I 作为参数来证明 CD44 敲低对心脏成纤维细胞活化的影响。如图 5 (D)所示，通过计算机辅助光密度分析对总胶原蛋白 I 的定量显示，与对照组相比，在 50 nM 的 Ang II 处理后胶原蛋白 I 表达显着增加，而 Ad-GFP NC 没有改变. 然而，即使在重新添加 Ang II 后，用 Ad-GFP shRNA1 沉默 CD44 时，胶原蛋白 I 的表达也没有显着变化，这进一步支持了 CD44 在 Ang II 刺激的心脏成纤维细胞中的作用。根据本研究证明的数据，我们提出了 Ang II AT1 受体/CD44 上调介导胶原蛋白产生的信号通路（图 6）。

图 6。在调节 Ang II AT1 受体和 CD44 受体介导的胶原蛋白产生中提出的信号通路。AT1受体的直接刺激增加了成纤维细胞的增殖和迁移。TGFβ1 的释放和 CD44 受体的激活之间存在潜在的相互作用，导致 Smad2/3 的表达增加和成纤维细胞合成胶原蛋白。可以用 AT1 受体拮抗剂或通过沉默 CD44 受体来阻断 Ang II 刺激的成纤维细胞的级联反应。

4。讨论

本研究的目的是确定 Ang II 是否对成纤维细胞增殖/迁移有直接影响，以及该信号通路是如何传递的。本研究的主要发现是：1）数据表明，Ang II 剂量依赖性地增强心脏成纤维细胞的增殖/迁移；2) Ang II AT1 受体的阻断下调 CD44、TGF-β1、Smad2 和 Smad4 的 mRNA 和蛋白水平，表明 AT1 受体与 CD44 在信号传导心脏成纤维细胞刺激中相互作用；3）CD44受体的沉默减少了胶原蛋白I的合成，表明CD44参与了心脏成纤维细胞的活化。

常驻心脏成纤维细胞被认为主要来源于心外膜的上皮细胞，在发育过程中经历了一个称为上皮-间质转化的过程，大约 70% 的非肌细胞和 30% 的心肌细胞，并且代表了最丰富的非肌细胞群。心。其他细胞类型，包括内皮细胞和血管平滑肌细胞，仅占心肌细胞群的一小部分 [ 3 ] [ 15 ]。成纤维细胞分布在整个心肌间质，以介导多种细胞功能，例如发育、分化、迁移和形态变化 [ 16]。在心血管疾病中，成纤维细胞通过细胞迁移/增殖和增殖的成纤维细胞（即肌成纤维细胞）产生/分泌胶原蛋白参与心脏重塑过程的发展[ 16 ] [ 17 ]。在 Ang II 输注的体内大鼠模型中，我们之前报道过 Ang II 引发的纤维化过程是通过刺激上游 AT1 受体介导的，该受体主要位于血管和肌细胞中 [ 9]。在本研究中，心脏成纤维细胞的鉴定基于免疫荧光染色，波形蛋白位于成纤维细胞的中间细丝中，胶原受体盘状蛋白结构域受体 2 (DDR2)。DDR2 对心脏成纤维细胞更具特异性，因为它在心肌细胞和内皮细胞中没有发现。用该方法测定分离的心脏成纤维细胞的纯度大于95%。此外，这些新鲜分离的心脏成纤维细胞没有被肌钙蛋白 I 和血管性血友病因子染色，证实分离的细胞不是心肌细胞和内皮细胞。数据清楚地表明，Ang II 能够刺激成纤维细胞，这被 Ang II AT1 受体拮抗剂替米沙坦阻断，

通过参与心脏成纤维细胞的增殖、转化和分泌功能，TGF-β1 已被证明是最有影响的促纤维化因子 [ 18 ] [ 19 ]。在之前的体内研究中，我们提出心肌细胞外基质中成纤维细胞过度增殖/转化为肌成纤维细胞主要是由 TGF-β1 诱导的，TGF-β1 从源自血液循环的浸润巨噬细胞释放 [ 9]。在本研究中，在培养的大鼠心脏成纤维细胞中，Ang II 刺激后 TGF-β1 的表达上调，表明活化的成纤维细胞也产生 TGF-β1。与 TGFβ-1 过表达一致，Smad2 被磷酸化，Smad4 表达上调。Smad2 与常见的 Smad4 结合形成 Smad 复合物，然后其易位到细胞核中以调节胶原蛋白的合成，如本研究中胶原蛋白 I 表达上调所证明的那样。在这方面，有条件地剥夺 Smad2 的人在 TGFβ-1 刺激后显示出抑制胶原蛋白释放和减少心脏纤维化 [ 20 ]。

CD44 抗原是细胞表面糖蛋白和糖胺聚糖透明质酸 (HA) 的受体，HA 是细胞外基质的主要成分。CD44-HA 相互作用通过细胞粘附、增殖和迁移参与心脏纤维化的产生 [ 7 ]。在以前的体内研究中，已经表明 CD44 过表达在成纤维细胞迁移到损伤部位和成纤维细胞分化成肌成纤维细胞中起关键作用，主要取决于 Ang II 激活的 TGF-β1 信号通路 [ 7 ] [ 13 ] [ 21]。为了确定 CD44 是否直接参与成纤维细胞向肌成纤维细胞的增殖，从而导致心脏纤维化，我们选择了体内 CD44 敲除小鼠模型来证明 CD44 表达的敲除与 TGF-β1 上调、增殖的减少有关成纤维细胞到肌成纤维细胞、胶原蛋白的合成和心脏纤维化的形成 [ 10]。在本研究中，我们从新生大鼠心脏中分离出成纤维细胞，以确定在没有 HA 的情况下，Ang II AT1 受体与 CD44 表达与成纤维细胞活化之间的关系。我们发现 Ang II 上调的 CD44 表达可以被 AT1 受体阻断剂替米沙坦阻断，这表明 AT1 受体也存在于成纤维细胞中。刺激成纤维细胞上的 AT1 受体可进一步增强 CD44 表达，并产生 TGF-β1，CD44 活化与 TGF-β1 表达之间呈正线性关系就证明了这一点。这些数据表明 TGF-β1 的局部作用可能取决于 CD44 控制成纤维细胞增殖/迁移和启动胶原合成的活性。所以，成纤维细胞上 CD44 的上调可能会通过 AT1 受体进一步放大 Ang II 的刺激作用，从而引发细胞间相互作用。为了证实这一假设，我们确定了 Ang II 刺激后的胶原蛋白合成是否与 CD44 激活直接相关，并沉默 CD44 受体以检查对胶原蛋白合成的敲除效应。数据清楚地表明，当 CD44 表达被 Ad-GFP shRNA 沉默时，Ang II 促进的胶原蛋白分泌得到有效抑制，这提供了直接证据表明 CD44 在调节心脏成纤维细胞胶原蛋白合成中的作用。这些数据与之前的报道一致，表明 CD44 参与了 TGF-β1 的激活和成纤维细胞的迁移[ 我们确定了 Ang II 刺激后的胶原合成是否与 CD44 激活直接相关，并沉默 CD44 受体以检查对胶原合成的敲除效应。数据清楚地表明，当 CD44 表达被 Ad-GFP shRNA 沉默时，Ang II 促进的胶原蛋白分泌得到有效抑制，这提供了直接证据表明 CD44 在调节心脏成纤维细胞胶原蛋白合成中的作用。这些数据与之前的报道一致，表明 CD44 参与了 TGF-β1 的激活和成纤维细胞的迁移[ 我们确定了 Ang II 刺激后的胶原合成是否与 CD44 激活直接相关，并沉默 CD44 受体以检查对胶原合成的敲除效应。数据清楚地表明，当 CD44 表达被 Ad-GFP shRNA 沉默时，Ang II 促进的胶原蛋白分泌得到有效抑制，这提供了直接证据表明 CD44 在调节心脏成纤维细胞胶原蛋白合成中的作用。这些数据与之前的报道一致，表明 CD44 参与了 TGF-β1 的激活和成纤维细胞的迁移[ 数据清楚地表明，当 CD44 表达被 Ad-GFP shRNA 沉默时，Ang II 促进的胶原蛋白分泌得到有效抑制，这提供了直接证据表明 CD44 在调节心脏成纤维细胞胶原蛋白合成中的作用。这些数据与之前的报道一致，表明 CD44 参与了 TGF-β1 的激活和成纤维细胞的迁移[ 数据清楚地表明，当 CD44 表达被 Ad-GFP shRNA 沉默时，Ang II 促进的胶原蛋白分泌得到有效抑制，这提供了直接证据表明 CD44 在调节心脏成纤维细胞胶原蛋白合成中的作用。这些数据与之前的报道一致，表明 CD44 参与了 TGF-β1 的激活和成纤维细胞的迁移[9 ] [ 10 ]。

研究限制：血管紧张素 II 通过巨噬细胞衍生的 TGF-β 刺激成纤维细胞，从而启动 Smads 介导的胶原蛋白生成 [ 9 ]。然而，也有报道称，Smads 的磷酸化取决于 p38 丝裂原活化蛋白激酶 (p38MAPK) 的活性，该活性可被 p38MAPK 抑制剂阻断，这表明它是一种独立于 TGF-β 刺激的途径 [ 22 ]。因此，需要更多的研究来进一步测试药物或 siRNA 干预是否可以在不激活细胞水平上的 TGF-β 的情况下干扰胶原蛋白的产生。此外，血管紧张素 II 对 AT1 受体的刺激与成纤维细胞活化有关 [ 9]。尚不清楚 AT1 受体的药物阻断或 AT1 受体的敲除是否可以调节 p38MAPK 信号传导并减少胶原蛋白的产生。有必要对培养的成纤维细胞进行基础研究，以证明 AT1 受体阻滞剂相对于 p38MAPK 抑制剂在减少胶原蛋白生成方面的潜在功效。

5. 结论

总之，当心脏成纤维细胞受到 Ang II 的刺激时，AT1 受体的上调和 CD44 的过度表达会发生在这些细胞上，从而导致胶原蛋白产生过程中多种信号通路的募集。阻断 AT1 受体或沉默 CD44 表达都会减少 TGF-β1/Smads 介导的胶原合成。这些数据提供了细胞和分子证据，表明除了 Ang II 通过刺激包括内皮细胞、巨噬细胞和心肌细胞在内的多种细胞类型诱导心脏纤维化外，Ang II 还直接刺激成纤维细胞。因此，可以通过特异性靶向抗成纤维细胞激活来实现减轻 Ang II 诱导的心肌损伤的治疗进展 [ 23 ]。

致谢

本研究得到山西医科大学博士预科项目（BS0320627）的资助。

利益冲突

作者声明与本文的发表没有利益冲突。

参考

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