番荔枝和番荔枝的幼体和不同外植体类型的离体克隆繁殖
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摘要：Annona muricata L. 和Annona squamosa L. 是热带物种，其肉质果实可食用。它们为社会经济用途提供了真正的可能性，特别是在医药、营养、生态系统保护和扶贫领域。本研究旨在评估幼体材料的不同微繁殖方法用于这些物种的再生。因此，添加[BAP 2 mg·L -1 ]即M2的MS 培养基从A. muricata的子叶节产生了2.87个新芽。A. squamosa的末端为 MMS 培养基，添加[BAP 2 mg·L -1 ]即最有利于新芽形成的 MM2 (3.12)。在M2培养基中添加0.1和0.2 mg·L -1的NAA，使得A. muricata子叶节新芽的伸长率和平均节数可能达到最佳（5.62节为9.11 cm） . 对于A. squamosa，MM7 培养基 [MMS + BAP 1 mg·L -1 + KIN 1 mg·L -1 ]的平均长度为 9.05 cm，顶端芽平均有 5.62 个节。[IBA 50 mg·L -1 ] 和 2 g·L -1在黑暗中进行为期 3 天的发根诱导期 活性炭的生根率为 66.67% 来自A. squamosa子叶节的枝条；而用鼠尾草子叶节的试管 植物，经过5天的生根诱导后获得了更好的生根率（83.33%）。经过30天的驯化，来自A. muricata尖端的植物的成活率达到83.33% ，而对于A. squamosa，来自子叶节的植物具有相同的成活率。
关键词
番荔枝,番荔枝,幼苗,微繁, 6-苄基氨基嘌呤, 6-糠基氨基嘌呤, 1-萘乙酸,吲哚-3-丁酸
一、简介
Annona muricata L. 和Annona squamosa L. 是具有重大社会经济意义的森林物种。他们肉质鲜美的水果深受人们的喜爱。它们的树皮、根和叶在非洲药典中也被广泛用于治疗各种疾病，如睡眠障碍、皮肤病、真菌病、腹泻等。 [ 1 ] [ 2]。在塞内加尔，这些物种在“尼亚耶斯”地区的小型农业花园和果园中被开发，从圣路易斯到小型海洋海岸。南部地区以及塞内加尔中部的花生盆地也有种植。它们是农民创收的自给作物的一部分，尤其是在淡季。然而，迄今为止，它们在萨赫勒地区的开发仅通过常规方法进行，例如幼苗发芽 [ 3 ] [ 4 ]。然而，由于其不规则性和缓慢性，这种方法不足以确保这些物种的良好再生[ 5 ]。通过播种进行繁殖也会产生异质后代，尽管A.的发芽率仍然很高。 鳞状种子 [ 6 ]。这同样适用于其他方法，例如吸盘、嫁接和扦插，这些方法很少使用，因此塞内加尔和非洲开发这些方法的地区需要求助于体外繁殖 方法。借助这项技术，生产者可以从优质树中获得足够数量的克隆植物，以满足市场需求和不受气候危害和季节影响的连续生产。事实上，与传统的种子繁殖方法不同，每颗种子只有一个个体，通过体外培养生产植物可以从单个外植体获得所需的尽可能多的拷贝 [ 7 ]。尽管有许多优点，但通过组织培养技术繁殖番荔枝科在非洲和塞内加尔几乎不存在，特别是。几部主要关注Annona muricata L.和Annona squamosa L.的体外 培养的著作已经由不同的作者在拉丁美洲和亚洲发表，但方法和结果不同。关于这些物种发表的文章主要集中在从各种器官中提取的各种化学物质的药理特性上。体外_ 无性繁殖可以从从种子发芽的幼苗中获得的材料进行，也可以从直接取自老年受试者的成年材料中进行。如今，保护生物体的遗传多样性已成为必要[ 8 ]，特别是对于具有重大社会经济利益的物种而言。
在这种情况下，通过评估体外形态发生能力，开发了一种策略，用于从年轻材料中对这两种物种进行体外无性繁殖 。对于每个物种，它涉及 1) 确定最佳植入物类型；2）检查不同生长调节剂如细胞分裂素和生长素对新生受试者体外形态发生的影响；3）确定最佳的伸长、倍增、生根培养基；4) 最后确定获得的新植物的最佳驯化条件。
2。材料和方法
2.1。植物材料
对于每个物种，测试了 3 种类型的外植体，长 1 到 2 厘米，取自 30 天的无菌幼苗。这些是末端顶点，腋窝和子叶节点。这些不同类型的外植体分别单独转移到装有 20 mL 固化培养基的无菌玻璃培养管 (150 × 25 mm) 中。
2.2. 方法
2.2.1。文化传媒
A. muricata使用的 基础营养培养基是 Murashige & Skoog [ 9 ] 的完全培养基，而A. squamosa外植体的基础培养基是 MMS 培养基；它对应于修改后的 Murashige & Skoog 媒体 [ 10 ]。这些培养基用pH 5.7 的8 g·L -1琼脂固化并含有30 g·L -1的蔗糖。在不同的培养基中添加或不添加生长调节剂。表 1中给出了在不同培养基中单独或组合测试的不同激素的组成。在 2 g·L -1的存在下测试了相同的培养基 活性炭。由于活性炭对植物激素的吸附作用，激素处理增加了 10 倍。
第二个实验包括 3 种其他培养基。这是MS + BAP 2 mg·L -1，其中添加了浓度为0.1、0.2和0.5 mg·L -1的NAA 。将所有培养基分配到培养管 (150 × 25 mm) 中，即每管 20 mL，然后在 110˚C 高压灭菌 20 分钟进行灭菌。
2.2.2。实验装置
对于每种类型的外植体，评估了每种培养基和每种物种 36 个。换句话说，每个处理使用 12 个试管的三个重复。试管首先在 27˚C ± 1˚C 的培养室中避光孵育 5 天，然后在 16 小时白天/8 小时夜间光周期和 4000 勒克斯的入射光下孵育。
在孵育 30 天后对每种类型的外植体进行测量。测量的参数涉及活动是否恢复（反应率）、新形成的枝条的数量和长度以及节点的数量。因此，根据这些数据，计算平均值，确定系数或倍增率，并推导出最佳再生培养基。
A.muricata的媒体命名法
荷尔蒙组合
A.squamosa的媒体命名法
荷尔蒙组合
M0
MS0
MM0
彩信0
M1
MS + BAP 1 mg·L-1
MM1
MMS + BAP 1 mg·L-1
M2
MS + BAP 2 mg·L-1
MM2
MMS + BAP 2 mg·L-1
M3
MS + BAP 5 mg·L-1
MM3
MMS + BAP 5 mg·L-1
M4
MS + KIN 1 mg·L-1
MM4
MMS + KIN 1 mg·L-1
M5
MS + KIN 2 mg·L-1
MM5
MMS + kIN 2 mg·L-1
M6
MS + KIN 5 mg·L-1
MM6
MMS + KIN 5 mg·L-1
M7
MS + BAP 1 mg·L-1+ KIN 1 mg·L-1
MM7
MMS + BAP 1 mg·L-1+ KIN 1 mg·L-1
M8
MS + BAP 2 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1
MM8
MMS + BAP 2 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1
M9
MS + BAP 2 mg·L-1+ NAA 0.2 mg·L-1
MM9
MMS + BAP 2 mg·L-1+ NAA 0.2 mg·L-1
M10
MS + BAP 2 mg·L-1+ NAA 0.5 mg·L-1
MM10
MMS + BAP 2 mg·L-1+ NAA 0.5 mg·L-1
表 1。用于微量繁殖番荔枝 和鳞状 花序的 幼体材料的不同培养基的组成。L.
MS：Murashige 和 Skoog 媒体（1962 年）；MMS：改良的 Murashige & Skoog 培养基（Mathur等人，1995）；BAP：6-苄基氨基嘌呤；KIN：激动素（6-糠基氨基嘌呤）；NAA：1-萘乙酸。
2.2.3。生根程序
在黑暗中在MS/2培养基中诱导新形成的第三代枝条，即由三个连续传代培养物产生，每次持续三十天。将微量元素稀释一半，补充IBA单独使用或分别使用浓度为25 mg·L -1和50 mg·L -1。这些培养基含有2 g·L -1活性炭、20 g·L -1蔗糖并用8 g·L -1琼脂固化。根据 Farooq等人应用的方法，将 pH 值调节至 5.7。[ 11 ] 和 Ba等人。[ 12]。在转移到MS(0)/2表达培养基中的入射光之前，外植体被诱导1、3、5天的持续时间，即。没有激素。对于从每种类型的外植体和每次处理发出的每个体外植体，每个持续时间和诱导培养基都使用了 36 个外植体。在 MS(0)/2 培养基中保持一批 12 个外植体作为对照批次，没有根诱导。30天后，进行测量以确定每个处理的生根率、每个外植体新形成的根数和根的长度。
2.2.4。适应环境
在表达培养基中孵育 4 周后，根据 Ba等人的程序将根系良好的幼苗转移到断奶条件下。[ 12 ]。为每种外植体类型和每种物种选择36株植物，即12株植物的3个重复。用 Hoagland 和 Arnon [ 13 ] 的溶液浇水。从断奶第 2周开始逐渐打开盖罩。计数在适应 15 天和 30 天后存活的幼苗数量并确定存活率。
2.2.5。统计分析
通过方差分析后的平均值的多重比较来区分不同的处理，然后在概率阈值为 5% 时进行 Student-Newman-Keuls 检验（SPSS 19.0 软件）。
3. 结果
3.1。生长调节剂对不同类型幼体外植体体外形态 发生的影响
3.1.1。BAP 和/或 KIN 对幼体外植体形态发生的影响
1)番 荔枝
- Apices：分别在培养基 M3 [MS + BAP 5 mg·L -1 ] 和 M6 [MS + KIN 5 mg·L -1 ] 中获得了最佳反应率。事实上，在这些媒体中，所有的终端顶点都呈现出新的增长，即100%的回收率。M7 培养基 [MS + BAP 1 mg·L -1 + KIN 1 mg·L -1 ] 允许具有最大的平均芽数（2.12），但与 M1 获得的（1.875）没有显着差异和 M2 媒体。该平均芽数显着（p = 0.000）高于使用其他培养基获得的芽数。培养基 M1 [MS + BAP 1 mg·L -1 ] 和 M5 [MS + KIN 2 mg·L -1的平均枝条长度]，分别相当于 5.83 厘米和 5.93 厘米，没有显着差异 (p = 0.270)。这些是获得的最佳伸长率。然而，M7 介质的节点数最多，为 4.37，平均长度为 5.16 厘米（表 2）。
-腋窝 淋巴结：最有利于腋窝淋巴结恢复活动的培养基是M4培养基[MS + KIN 1 mg·L -1 ]，即100％的反应率。与单独补充激动素的培养基（M5 和 M6）相比，BAP 培养基的增殖率最高。2 mg·L -1的 BAP 浓度平均可以产生 2.35 个芽，这与除 M1 培养基外的所有其他培养基（F = 55.04；p = 0.000）获得的芽显着不同。后者平均产生 2.12 个新形成的枝条 (p = 0.282)。对于 5.37 个节点，M2 培养基的伸长率也最高，为 6.03 厘米（F = 62.1；p = 0.00）和最大的平均节点数（F = 10.3；p = 0.00）。
-子叶 节：分别在培养基 M4 [MS + KIN 1 mg·L -1 ] 和 M6 [MS + KIN 5 mg·L -1 ] 中获得最佳反应率 (100%)。M2 培养基 [MS + BAP 2 mg·L -1 ] 的平均芽数最高（F = 83.67；p = 0.000），为 2.87，而伸长率（F = 31.76；p = 0.00）最长（7.46 cm) 和最大 (F = 47.41; p = 0.00) 平均节点数 (5.62) 分别用 M5 媒体和 M3 获得。所有这些平均值与使用其他激素组合获得的平均值仍然存在显着差异。
2)番 荔枝
- Apices ：在MM4培养基[MMS + KIN 1 mg·L -1 ]中观察到最好的回收率，反应率为100%。用于顶端外植体的含有 BAP 和激动素的培养基显着改善了外植体的爆裂，平均芽数远高于对照培养基中获得的芽数。在 MM2 [MMS + BAP 2 mg·L -1 ] 和 MM7 [MMS + BAP 1 mg·L -1 + KIN 1 mg·L -1 ] 培养基中的平均枝条数为 3.12 和 2.87。这些没有显着差异（p = 0.11），但仍然显着高于（F = 40.19；p = 0.00）比使用其他培养基获得的那些。然而，它在 MM7 培养基中 [MMS + BAP 1 mg·L -1 + KIN 1 mg·L -1] 表明体外植物的伸长率最高（9.05 cm），平均节数最高（5.62）。与分别为 3.66 cm 和2.37 个节点（表 2）。
物种
媒体
外植体类型
反应率 (%)
平均发芽数
平均
拍摄长度
（厘米）
平均节点数
物种
媒体
外植体类型
反应性
速度
(%)
平均发芽数
平均
拍摄长度（厘米）
平均数
节点数
番荔枝
M0
APX
66.67
1.12 摄氏度
3.18 摄氏度
2天
番荔枝
毫米
0
APX
91.67
1摄氏度
3.17 e
1.5 克
一个
75
1天
3.83天
1.62 摄氏度
一个
91.67
1.37 b
3.66 e
2.37天
中国
75
1摄氏度
3.8℃
2.25 e
中国
83.33
1.5 抗体
3.32天
2.75 e
M1
APX
91.67
1.87 抗体
5.83 一个
3.87 一个
毫米
1
APX
83.33
1.62 摄氏度
3.88天
2.62 英尺
一个
75
2.12 ab
公元前5.01
4.5 b
一个
66.67
1.12 b
4.98 光盘
3.12 光盘
中国
91.67
1.37 摄氏度
4.06 c
3.12 光盘
中国
100
1.25 抗体
3.98 光盘
3.5 bcd
M2
APX
83.33
1.87 抗体
4.6 b
公元前3.5
毫米
2
APX
75
3.12 一个
5.31 c
公元前4.12
一个
91.67
2.35 一个
6.03一
5.37 一个
一个
83.33
1.62 抗体
6.31 b
4.87 一个
中国
75
2.87 一个
4.02 c
公元前 4 年
中国
91.67
1.87 一个
6.68 一个
5.12 一个
M3
APX
100
1.5 b
公元前4.03
4.12一
毫米
3
APX
91.67
2.37 b
6.57 b
4.75 b
一个
91.67
1.87 b
3.96 天
4 乙
一个
100
2.25 一个
5.2 光盘
公元前3.87
中国
75
2.12 ab
6.57 b
5.62 一个
中国
83.33
1.62 抗体
公元前4.88
公元前3.75
M4
APX
91.67
公元前1.37
5.25 ab
公元前3.62
毫米
4
APX
100
1.25 摄氏度
4.1天
3.5 码
一个
100
公元前1.75
4.88 摄氏度
4.5 b
一个
83.33
1.62 抗体
4.58天
3.12 光盘
中国
100
2.25 抗体
3.71 摄氏度
公元前4.37
中国
75
1个
公元前4.58
2.87 德
M5
APX
83.33
1.62 b
5.93 一个
3.87 一个
毫米
5
APX
91.67
1.37 摄氏度
7.33 b
4.75 b
一个
91.66
1.37 光盘
公元前5.21
4.37 b
一个
91.67
1.37 b
公元前5.58
公元前3.87
中国
91.66
1.37 摄氏度
7.46 一个
4.75 b
中国
100
1.25 抗体
5.68 b
3.5 bcd
M6
APX
100
1.5 b
4.56 b
3.37 摄氏度
毫米
6
APX
83.33
1.62 摄氏度
6.76 b
3.62 光盘
一个
83.33
公元前1.62
公元前5.21
4.25 b
一个
66.67
1.12 b
4.85 光盘
公元前3.62
中国
100
1.25 摄氏度
6.12 b
3.37 光盘
中国
75
1个
公元前5.41
3.12 cde
M7
APX
75
2.12 一个
5.16 ab
4.37一
毫米
7
APX
83.33
2.87 一个
9.05 一个
5.62 一个
一个
91.67
1.37 光盘
5.58 b
3.62 b
一个
83.33
1.87 抗体
7.22一
4.25 ab
中国
75
2.12 ab
4.01 c
2.62 德
中国
83.33
1.62 抗体
5.86 b
4.12 b
表 2。BAP 和 Kinetin 对A. muricata L. 和A. squamosa L.幼体体外 形态发生的影响。
APX：顶点；AN：腋窝淋巴结；CN：子叶节。在同一列中，对于相同类型的外植体，相同字母后的数字在 Newman-Keuls 检验的 5% 阈值下没有显着差异。
-腋窝 淋巴结：在MM3培养基[MMS + BAP 5 mg·L -1 ]中反应率最高，回收率为100%，平均芽数为2.25。这明显高于 MM0 的 1.37（F = 18.36；p = 0.001）。在 MM7 培养基中的腋窝节点上测量新形成的体外植物的最佳伸长率 (7.22 cm)。它显着大于其他培养基的平均枝条长度 (F = 63.44; p = 0.00)。然而，最高的平均节点数 (4.87) 是 MM2 培养基的体外植物。它与 4.25 个节点的 MM7 没有显着差异（F = 107.04；p = 0.00）。
-子叶 节：中等 MM1 和 MM5 提供最佳恢复率 (100%)。最高平均芽数为1.87；它是使用 MM2 培养基获得的，但与使用 MM3 和 MM7 培养基获得的结果没有显着差异，其值为 1.62 (F = 2.48; p = 0.31)。MM2 介质] 允许具有与其他介质显着不同的平均节点数 (5.12) 和平均长度 (6.68 cm)。该培养基对平均节点数 (F = 15.55; p = 0.00) 和平均枝条长度 (F = 13.58; p = 0.00) 有非常显着的影响。
3.1.2。NAA联合BAP对幼体外植体形态发生的影响
表 3和图板 1报告了与两种番荔枝属植物外植体形态发生相关的结果。
图 1. 取自Annona muricata L. (A) 和A. squamosa L. (B) 的幼体新形成的芽的外观。A1、B1：从顶端新形成的体外植物。A2，B2：从腋窝节点新形成的体外植物。A3，B3：从子叶节新形成的体外植物。
物种
媒体
外植体类型
反应率 (%)
平均人数
芽
平均
拍摄长度
（厘米）
平均节点数
物种
媒体
外植体类型
反应性
速度 （％）
平均人数
芽
平均
拍摄长度
（厘米）
平均数
节点数
安诺娜
鼠尾草
M0
APX
66.67
公元前1.12
3.28 摄氏度
2℃
毫米
0
APX
75
1摄氏度
3.17天
1.5 摄氏度
一个
83.33
1摄氏度
3.83天
1.62天
一个
83.33
1.37 b
3.66天
2.37天
中国
75
1个
3.8天
2.25天
安诺娜
鳞片
中国
91.67
1.5 抗体
3.32天
2.75 光盘
M2
APX
91.67
1.87 一个
4.6 b
3.5个
毫米
2
APX
91.67
3.25 一个
公元前5.31
4.12一
一个
91.67
2.35 一个
6.03 b
5.37 一个
一个
中国
91.67
1.62 抗体
6.31 b
4.87 一个
中国
75
2.87 一个
4.02天
4 乙
中国
91.67
1.87 一个
6.68 一个
5.12 一个
M8
APX
83.33
1.87 一个
6.01一
3.25 抗体
毫米
8
APX
91.67
公元前1.37
6.67 一个
4.5一
一个
91.67
公元前1.37
4.92 摄氏度
4.12 b
一个
83.33
1.37 b
7.05 一个
4.25 ab
中国
100
1.25 b
9.11一
5.62 一个
中国
75
1.25 抗体
5.76 b
3.75 b
M9
APX
100
1.75 抗体
4.61 b
2.75 b
毫米
9
APX
100
公元前1.5
5.68 b
3.25 b
一个
91.67
公元前1.37
7.83 一个
公元前3.75
一个
80.33
1.62 抗体
6.01 b
3.12 光盘
中国
75
1个
5.68 b
公元前3.5
中国
100
1.5 抗体
公元前4.51
3.37 bcd
M10
APX
91.67
1摄氏度
2.38天
2.12℃
毫米
10
APX
83.33
1摄氏度
4.43 摄氏度
公元前2.87
一个
91.67
公元前1.25
4.71 摄氏度
3.5 摄氏度
一个
100
1.25 b
4.53 摄氏度
3.37 b
中国
83.33
1个
4.81 摄氏度
公元前3.5
中国
83.33
1.25 抗体
公元前5.1
2.5天
表 3。
NAA 对A. muricata L. 和A. squamosa L.幼体体外 形态发生的影响。
APX：顶点；AN：腋窝淋巴结；CN：子叶节。在同一列中，对于相同类型的外植体，相同字母后的数字在 Newman-Keuls 检验的 5% 阈值下没有显着差异。
1)番 荔枝
- Apices：在 M9 培养基 [MS + BAP 2 mg·L -1 + NAA 0.2 mg·L -1 ]中获得最佳反应率 (100%) 。然而，用 M2 [MS + BAP 2 mg·L -1 ]、M8 [MS + BAP 2 mg·L -1 + NAA 0.1 mg·L -1 ] 和 M9 获得的平均枝条数没有显着差异（ F = 14.6；p = 0.58）。它们分别为 1.87、1.87 和 1.75（表 3）。M8 培养基也提供了最好和显着的伸长率，为 6.01 厘米。在 M2 培养基 [MS + BAP 2 mg·L -1 ]中获得了最佳平均节点数 (3.5) 。然而，它与在 M8 培养基中获得的结果（3.25）没有显着差异（F = 48.76；p = 0.13）。
-腋窝 淋巴结：在 M2、M8、M9 和 M10 培养基中观察到最佳反应率 (91.7%)。M2 培养基[MS + BAP 2 mg·L -1 ]的平均节点数(5.37)明显大于其他培养基的节点数(F = 89.76；p = 0.000)。但是，在 M9 培养基 [MS + BAP 2 mg·L -1 + NAA 0.2 mg·L -1 ]中，体外植物的平均枝条长度（7.83 cm）明显大于其他培养基中的枝条（F = 46.77；p = 0.00)。
-子叶 节：在M8培养基[MS + BAP 2 mg·L -1 + NAA 0.1 mg·L -1 ]中获得最佳反应率(100%) 。在存在 NAA 的情况下，与产生 2.87 个枝条的 M2 培养基相比，枝条的平均数量显着减少。对于以 0.2 和 0.5 mg·L -1补充的 NAA ，平均芽数等于 1（F = 21.34；p = 0.000），这与对照培养基 [MS0] 的相同。M8 介质的伸长率最高 (9.11 cm) 和平均节数最多 (5.62)，仍显着高于其他介质。
2)番 荔枝
- Apices : 使用 MM8 培养基 [MMS + BAP 2 mg·L -1 + NAA 0.1 mg·L -1 ]的最佳回收率为 100% 。当将 NAA 添加到补充有 2 mg·L -1的 BAP 的培养基中时，平均芽数显着减少（表 3 ） （F = 37.23；p = 0.000）。在 MM8 培养基中，体外植物的平均长度 (6.67 cm) 显着大于在 MM2 培养基和 MM9 中获得的平均长度，分别为 5.31 cm (F = 6.78; p = 0.24) 和 5.68 cm (p = 0.036)。MM2 培养基中的平均节点数 (4.12) 和 MM8 培养基中的 4.5 个节点没有显着差异 (F = 3.76; p = 0.435)。
-腋窝 淋巴结：在 MM10 培养基中观察到最佳反应率 (100%) [MMS + BAP 2 mg·L -1 + NAA 0.5 mg·L -1 ]。使用不同激素组合获得的平均芽数没有显着差异（F = 1.24；p = 0.056）。最佳伸长率 (7.05 cm) 是在 MM8 培养基中获得的。它显着大于其他培养基 (F = 14.45; p = 0.00)，即使该培养基中的平均节点数 (4.25) 与培养基 MM2 中的芽数没有显着差异，即 4.87 (F = 7.43；p = 0.00)。
-子叶 节：最好的恢复率（100%）由 MM9 培养基提供。在 MM2 培养基中获得的最佳平均芽数 (1.87) 与其他培养基没有显着差异，特别是平均芽数为 1.5 的 MM0。MM2 培养基也产生了最好的平均长度（6.68 厘米）和最大的平均节点数（5.12）。这个平均长度仍然显着大于（F = 13.06；p = 0.00）比来自其他媒体的芽。对于平均节点数，当 NAA 添加到媒体时，它显着减少（F = 6.31；p = 0.00）（表 3）。
3.2. IBA 诱导 1、3 和 5 天对体外植物生根的影响
参见表4，根据 IBA 浓度和诱导时间，对于每个物种，结果如下：
3.2.1。番荔枝
在补充有 25 mg·L -1的 IBA 的培养基中孵育一天 (1)，无论外植体的类型如何，都不允许任何根生长。在 3 天的诱导期，随后在游离激素培养基 (MS(0)/2) 中表达，从顶端获得的芽生根率为 8.33%，平均长度为 0.8 厘米。对于 5 天的诱导期，该比率上升至 16.67%
物种
媒体
诱导时间（天）
外植体类型
生根率
(%)
平均根数
平均根长（厘米）
物种
媒体
就职
时间（天）
外植体类型
生根率
(%)
平均根数
平均根
长度（厘米）
安诺娜
鼠尾草
多发性硬化症/2
0
APX
0
0
0
0 b
0℃
0℃
0℃
0 b
0 b
番荔枝
多发性硬化症/2
0
APX
0
0
0
0 b
0 b
0℃
0天
0 b
0 b
一个
一个
中国
中国
多发性硬化症/2
+ AIB
25
毫克·升-1
1
APX
0
0
0
0 b
0℃
0℃
0℃
0 b
0 b
多发性硬化症/2
+ AIB
25
毫克·升-1
1
APX
0
0
0
0 b
0 b
0℃
0天
0 b
0 b
一个
一个
中国
中国
3
APX
8.33
16.67
0
1个
1.5 摄氏度
0℃
0.8 b
1.2 乙
0 b
3
APX
0
16.67
8.33
0 b
1个
1个
0天
1.4个
1.2个
一个
一个
中国
中国
5
APX
16.67
16.67
8.33
1个
1个
2 乙
1.9 抗体
1.6个
1.2个
5
APX
16.67
25
0
1个抗体
1.5个
0℃
0.9 摄氏度
1.4个
0 b
一个
一个
中国
中国
多发性硬化症/2
+ AIB
50
毫克·升-1
1
APX
41.67
0
16.67
1.25个
0℃
2.5 b
0.7 b
0 b
1.5个
多发性硬化症/2
+ AIB
50
毫克·升-1
1
APX
33.33
16.67
0
2个
2.4一
0℃
2.25 b
1.8个
0 b
一个
一个
中国
中国
3
APX
33.33
25
33.33
1.5个
2抗体
4个
2.25 一个
1.1一
1.25个
3
APX
41.67
33.33
66.67
1.37 一个
2个
3.37一
3.5个
1.9个
1.33 一个
一个
一个
中国
中国
5
APX
0
41.67
83.33
0 b
2.5个
2.56 b
0℃
1.4个
1.3个
5
APX
16.67
8.33
33.33
2个
1个
3.25 一个
1.48 b
1.2个
2.5个
一个
一个
中国
中国
表 4。IBA 诱导浓度和持续时间对A. muricata L. 和A. squamosa L.
APX：顶点。AN：腋窝淋巴结；CN：子叶节。在同一列中，对于相同类型的外植体，相同字母后的数字在 Newman-Keuls 检验的 5% 阈值下没有显着差异。
来自顶端和腋窝节点的体外植物；平均根数等于 1。对于后者，平均长度为 1.6 厘米，而对于来自顶端的体外植物，平均长度为 1.9 厘米（p = 0.001）并且明显更大（F = 2.74；p = 0.021）来自顶端起源的芽的根（0.8 厘米）孵育 3 天。对于子叶节，只有8.33%的体外植物生根，每个外植体有2根，平均长度为1.2厘米（表4）。
[IBA 50 mg·L -1存在下]，子叶节培养5天的体外植物生根率最高（83.33%），平均生根2.55根，伸长1.3 cm。在 3 天孵化期后获得的最大平均根数 (4) 也是如此；它显着高于其他诱导时间 (F = 5.87; p = 0.001)。腋节新形成的试管植物的生根率最高，为41.67%，平均每芽2.5根，平均根长1.4厘米，显着更高。这些结果是在 5 天的诱导期之后获得的，然后在无激素 MS(0)/2 培养基中表达 30 天。另一方面，当诱导持续时间仅为 1 天 (1) 时，41.67% 的由顶端产生的试管植物生根，平均 1.25 根和 0 根。7厘米的伸长率。在 1 天的诱导期后获得的这种生根率仍然是此类外植体的最高值（表 4）。
3.2.2. 番荔枝
子叶节体外植物在[IBA 25 mg·L -1 ]存在下进行诱导预处理时，仅在3天的潜伏期后才出现根，发生率为8.33%，长度为1.2 cm。腋窝新生体外植体的发生率为16.67%。对于从顶端形成的那些，在[IBA 25 mg·L -1 ]存在下需要5天的诱导期才能看到根的出现。因此，来自顶端和腋生节点的试管植物的生根率分别为 16.67% 和 25%（表 4）。
由于3天的诱导期，子叶节的试管植物也获得了最好的生根率（66.67%），平均有3.37根和1.33厘米的长度。根尖试管的生根率为41.67%，平均生根1.37根，伸长3.5厘米。对于这种类型的试管植物，除了对照培养基和[IBA 25 mg·L -1诱导时间分别为1天和3天外，平均根数没有显着差异。] (F = 7.02; p = 0.00) 而由于 3 天的诱导期获得的平均长度明显大于其他 (F = 3.70; p = 0.02)。对于来自腋窝的试管植物，生根率仍然很低。对于 1、3 和 5 天的诱导时间，它们分别为 16.67%、33.33% 和 8.33%。诱导时间为 1 天和 3 天的平均根数（F = 1.32；p = 0.087）以及平均根长（F = 3.47；p = 0.054）没有显着差异（表 4） .
3.3. 适应环境
将不同类型的外植体移植到装有无菌沙土混合物的杯子中，然后在百叶窗完全关闭的迷你温室中储存一周。这个过程将体外生产的植物保持在相对湿度较高的气氛中，但迷你温室配备了一个可调节开口的有机玻璃钟。前 2 周每 2 天用 Hoagland 和 Arnon 的营养液 (1938) 浇水一次，然后用自来水浇水。在驯化的第 12天，对于A. muricata来说，注意到腋窝和子叶节产生的外植体的腐烂率为 8.33%。对于A. squamosa , 来自顶端和腋节的植株为 16.67%, 而来自子叶节的植株为 8.33%。第14天起，半开百叶窗，避免长时间禁闭。第21天，树脂钟完全打开。小苗首先在长凳下的阴凉处保持3天，然后放在长凳上。因此，第30天，从子叶和腋节发出的植物的成活率为75%，而从A. muricata的顶端发出的成活率为83.33%。从顶端、腋生和子叶节的鳞甲 树植物中，成活率分别为75%、66.67%和83.33%（表 5，图板 2)。
存活率 （％）
物种
外植体类型
15天后
30天后
A.muricata
APX
100个
公元前83.33
一个
91.67 ab
75℃
中国
91.67 ab
75℃
A.squamosa
APX
83.33 b
75℃
一个
83.33 b
公元前66.67
中国
91.67 一个
83.33 b
表 5。从A. muricata L. 和A. squamosa L.幼体材料中离 体断奶幼苗15 天和 30 天后的存活率
APX：顶点；AN：腋窝淋巴结；CN：子叶节。在同一列中，对于相同类型的外植体，相同字母后的数字在 Newman-Keuls 检验的 5% 阈值下没有显着差异。
图 2. 在阴凉处断奶 30 天后由幼体材料产生的幼苗。A：番 荔枝；B: A. squamosa ; A1、B1：来自顶端的植物；A2、B2：来自腋窝的植物；A3、B3：来自子叶节的植物。
4。讨论
4.1。生长调节剂对不同类型外植体体外 形态发生的影响
在第一次体外引入不同的外植 体一周后，注意到由于多酚的存在而出现褐变。这可能是由于发芽产生的幼苗暴露在光线下，这会促进多酚的合成。根据[ 14 ]，在 体外光照条件下生长的幼苗根在秋季比成年植物的叶子产生更多的多酚。作者 [ 15 ] 已经报道了A. muricata中材料的褐变当它是 16 到 24 天时，这对其生存能力产生了负面影响。此外，极端温度、干旱、洪水等非生物胁迫在很大程度上影响植物发育和作物生产力 [ 16 ]。众所周知，酚类化合物的生物合成通常由某些非生物因素激活，例如极端温度、盐度、重金属污染、光，尤其是紫外线辐射 [ 17 ] [ 18 ]。结果，两个物种的外植体被转移到不同的培养基中，其中掺入了2 g·L -1的活性炭。
培养6天后，新形成的枝条轮廓在子叶和腋节水平可见，并且在富含用于A. muricata外植体的激素的培养基中更多。A. squamosa的顶端从第8天开始出现。在插入子叶的区域发生新芽形成。事实上，植物的生长和发育可以通过生长素和细胞分裂素的协同作用来调节 [ 19 ]。作者 [ 20 ] 已经表明豇豆 子叶节的器官发生潜力受生长调节剂类型、生长和使用的激素组合的强烈影响。细胞分裂素的器官发生特性部分地通过它们与培养基中存在的蔗糖的相互作用来解释[ 21 ]。
对于所研究的 2 个物种，发现单独使用 BAP 或与 Kinetin 组合使用比对照培养基或单独使用 Kinetin 更有效地促进新芽的生长和节数。单独的 Kinetin 对伸长率的影响比 BAP 更好，尽管这允许更好的芽突破。[ 22 ] 在Ferronia limonia中也得到了同样的结果。据[ 23 ]报道，BAP比Kinetin更能有效地促进大叶山茱萸的再生和枝条伸长 。[ 24 ] ) 对Balanites aegyptiaca和 [ 25 ] 对Vigna radiata进行了同样的观察。 . [ 26 ] 对丁香枇杷 科的研究表明，BAP 促进了顶端活性的恢复。这些作者[ 27 ] 表明，最适合Annona annua枝条繁殖的培养基是添加1 mg·L -1 BAP的MS 培养基。正如 [ 25 ]所报道的，将 BAP 掺入培养基中通常会改善外植体的再生。另一方面，Kinetin 本质上促进了芽的伸长 [ 28 ]。值得注意的是，细胞分裂素含量的增加伴随着枝条伸长率的减少和A. squamosa的平均节数，而在A. muricata外植体，5 mg·L -1的 BAP允许新形成的枝条伸长和节数增加，但仅限于子叶节。根据[ 29 ]，细胞分裂素浓度大于2 mg·L -1对大多数番荔枝科的繁殖和生根有不利影响。因此，[ 30 ] 使用不超过 1 mg·L -1的细胞分裂素浓度进行Annona glabra的 体外增殖。高剂量细胞分裂素对番荔枝体外形态发生的作用 物种 似乎 证实 了 [ 28 ] 对Vigna unguiculata的观察。高浓度的 BAP 将有利于Ixora margaretae [ 31 ] 和Morinda sp. 的顶端优势。 十一月 A [ 32 ]。[ 33 ] 的工作表明，在培养基中添加 BAP 会在Mentha spicata H.（薄荷）顶端部分的体外培养过程中 诱导顶端优势，因此会加强植物的高度生长。此外，[ 34 ] 注意到在Annona glabra BAP 浓度大于 0.5 mg·L -1，添加到不含活性炭的培养基中，会导致外植体的强骨化和玻璃化。这最终导致我们在A. muricata和A. squamosa中观察到的茎尖坏死和叶片脱落。这些生理障碍在其他番荔枝属物种的 体外培养中经常被提及[ 35 ]；它们与A. squamosa中的钙缺乏 [ 36 ] 或乙烯积累 [ 37 ] 有关 . 钙的缺乏显着影响分生区水平的细胞分裂以及果胶的合成[ 38 ]。然而，[ 39 ] 已经表明，高浓度的细胞分裂素会影响番荔枝科微繁过程中体外植物对钙的积累和利用。增加细胞分裂素浓度会导致外植体再生率降低 [ 40 ]。此外，在高剂量下，细胞分裂素会促进许多番荔枝科果实物种中铁的积累，从而促进体外增殖过程中的 氧化[ 30]。然而，使用的小瓶类型和采用的密封技术是导致这些疾病发展的因素；它们会导致容器内的空气保持较高的相对湿度，防止钙到达植物木质部所需的植物蒸腾作用，并且它们会使与外部大气的气体交换变得不可能，因此，促进组织产生的气体在生理活性水平上的积累 [ 35 ]。
与单独用于 2 个番荔枝属物种的细胞分裂素相比，将 NAA 与细胞分裂素一起添加到培养基中不会增加新形成的枝条的数量。然而，BAP 与 NAA 的组合似乎更有效地刺激枝条伸长和增加A. muricata节点的数量。细胞分裂素 - 生长素组合对年轻材料形态发生的这种有利作用在 [ 41 ] 上提到了Santolina canescens， [ 42 ] 在Bupleurum fruticosum， [ 24 ] 在Balanites aegyptiaca和 [ 23 ] 在 大叶山茱萸。几位作者已经报道了 NAA 对枝条伸长的有益作用 [ 32 ] [ 43 ] [ 44 ]。其他作者 [ 45 ] 则声称相反，NAA 会极大地影响Plumbago rosae的芽形成。几项研究报告说，BAP-NAA 组合会导致再生芽的数量减少 [ 20 ] [ 25 ] [ 46 ]。然而，在某些情况下，NAA 可以促进风信子科[ 47 ] 和雪莲 [ 48 ]的许多物种的枝条增殖。上Plantago lanceolata，[ 49 ]在添加BAP（0.75 mg·L -1）和NAA（0.2 mg·L -1 ）的MS培养基中获得了良好的下胚轴和子叶外植体芽再生。
然而，NAA-BAP 组合在许多外植体体外培养的外植体基部引起愈伤组织 形成。[ 50 ] 关于Nigella sativa、[ 25 ] 关于Vigna unguiculata和 [ 51 ] 关于Nigella damascena已经报道了这种胼胝体发生。愈伤组织形成的强度随着生长培养基中 NAA 浓度的增加而增加，这显着限制了豇豆的 枝条再生[ 52 ]。根据 [ 53]，它经常在具有明显顶端优势的物种中观察到。这是由于顶端外植体基部生长素的积累[ 54 ]。在细胞分裂素存在的情况下，生长素会刺激位于外植体损伤区域的细胞增殖。愈伤组织的存在构成了限制根际发生的因素。事实上，在培养一个月后，有人在某些外植体上观察到愈伤组织变褐，这使外植体与培养基的接触表面变差，因此似乎减缓了它的生长。
4.2. 生根
在A. muricata中，在 MS/2 培养基中经过 5 天的生根诱导后，由腋生 (41.67%) 和子叶节 (83.33%) 新形成的试管植物获得了最佳生根率。补充[IBA 50 mg·L -1 ]并在2 g·L -1活性炭存在的情况下，诱导24小时使得从顶端新形成的试管植物具有41.67％的比率成为可能。在A. squamosa中，用[IBA 50 mg·L -1进行 3 天的生根诱导后，从顶端（41.67%）和来自子叶节（66.67%）的试管植物获得了最好的生根率。] 而对于来自腋窝的体外植物，该速率是在用 [IBA 25 mg·L -1 ] 诱导 5 天后获得的。正如 [ 23 ] 在Parkia biglobosa中指出的那样，木本植物的生根通常依赖于激素处理。作者 [ 55 ] 还注意到Acacia tortilis subsp.的生根率为 80% 。与 NAA 相比，用 IBA 治疗后的raddiana 。因此，IBA 将更有利于木本植物的发根诱导，后者难以在 体外生根[ 22 ] [ 56 ] [ 57 ]。此外，[ 27]与使用 NAA 相比，在 IBA 存在的情况下，Artemisia hololeuca获得了更好的根际发生。
生根培养基的稠度，如高浓度的生长素，似乎也强烈影响外植体基部愈伤组织的外观，就像在高浓度 IBA 的存在下， Annona muricata和A. squamosa的外植体一样。同样，[ 58 ] 发现苹果树的生根可以在固体或液体培养基中使用蛭石来实现，在后一种情况下效果更好。作者 [ 59 ] 用纸和蛭石支撑的固体和液体培养基对 M106 苹果树砧木进行了过度发育，即40% 的生根在固体培养基中，而使用液体培养基将生根率提高到 80%，并导致愈伤组织发育明显减少。这种显着差异可以通过外植体更容易获得营养这一事实来解释 [ 60 ]。此外，琼脂会产生临界膨胀压力，使细胞处于压力之下。这种压力会诱导乙烯的产生，乙烯的浓度会在限制条件下增加，这也会刺激生长素的产生。相反，[ 61 ] 和 [ 62 ] 表明糖浓度的降低和琼脂的存在有利于根际发生。
我们还注意到生根率仍然很高，尤其是A. muricata，其最佳生根率为 83.33%。对鳞翅目 而言，该生根率等于66.67%。一般而言，在由子叶节产生的体外植物的水平上，根更发达，其中观察到两个物种的更多侧枝。此外，[ 63 ] 不能超过 50% 生根于巨杉。这可以解释为，木本植物比草本植物更难生根 [ 64]。高生根率可能是由于使用的基础培养基 (MS/2)、暗培养、活性炭的加入和高浓度生长素诱导的综合有益效果。作者 [ 65 ] 和 [ 66 ] 指出了生长素在改善根系发育中的重要性。作者 [ 67 ] 报告说，将常量营养素减半促进了许多物种的生根。这种效应被认为是由于培养基中氮含量的减少[ 68 ]。MS/2 培养基对牛油果的根际发育也有有益作用[ 69 ]。另一方面，[ 70] 表明，在 IBA 存在的情况下，在黑暗中孵育可以提高Pistacia vera体外植物的生根率。在苹果 [ 71 ] 和Quercus rubra [ 72 ]上也观察到这种黑暗对生根的有益影响。除了它对多酚的作用，它抑制多酚的产生和氧化 [ 73 ]，由于黄化 [ 74 ] ，黑暗增加了能够诱导根部出现和发育的细胞数量，从而避免了对生长的破坏通过降低过氧化物酶活性将调节剂包含在培养基中 [ 72 ]。根据 [ 75]，在黑暗中孵育 5 天，使根诱导细胞在栎树上 分化。然而，在该物种中，在黑暗中孵化期间，新芽会出现衰老和坏死 [ 76 ]。根据[ 72 ]，活性炭不仅能刺激根系发育，同时还能吸附多余的生长调节剂。它还可以防止多酚的有害作用，并有助于掩盖有利于发根诱导的外植体环境 [ 77 ] [ 78 ]。
4.3. 适应环境
体外繁殖导致的 幼苗驯化过程中的低存活率是限制该技术对许多具有经济重要性的物种进行经济开发的因素之一[ 79 ]。
在小温室中适应环境，从第一周开始逐渐与周围环境接触，使得在A. muricata上，83.33% 的幼苗从存活的顶端获得，而对于那些来自腋生和子叶节的幼苗，存活率为75%。A. squamosa的顶端、子叶和腋节的幼株成活率分别为75%、83.33%和66.67% 。[ 80 ] 在逐渐适应环境大气的角豆 ( Ceratonia siliqua L.) 微型植物上也报道了类似的结果。在断奶开始时将幼苗限制在湿度饱和（90% 至 100%）的大气中即在高温下接近体外 条件，已被证明有利于它们的成功驯化。事实上，根据[ 24 ]，离体培养产生的植物通常具有比母株更薄的角质层，当通过离体传代迅速降低相对湿度时，这会导致它们快速干燥。因此，[ 81 ] 注意到 43% 的Prosopis juliflora和P. chilensis植物在驯化过程中死亡。另一方面，在体外，管内的相对湿度非常高 与适应体内条件 的成年植物相比，栽培导致幼苗的叶子具有非常多的非功能性气孔[ 82 ]，[ 83 ]。因此，在小型温室中逐渐断奶可以让植物获得解剖学、生理学和代谢特征，使它们能够在自然条件下的移植过程中更好地适应和生存。
5. 结论
这项工作表明了激素组合在这些番荔枝科物种的微繁殖中的重要性。重要的是要注意 BAP 在新芽形成中的有益作用及其与 NAA 在芽伸长方面的积极协同作用，但这些激素的作用取决于体外引入的幼年外植体 的类型。在外植体中，子叶节对新芽的形成反应最为活跃。似乎 IBA 在体外植物的发根诱导方面优于 NAA，并改善了它们在侧根中的分枝。小温室中的体外植物逐渐断奶，开口可调，更有利于植物离 体的驯化无论外植体的最初来源是什么。
利益冲突
作者声明与本文的发表没有利益冲突。
参考
[ 1 ] Kerharo, J. 和 Adam, JG (1974) 塞内加拉药典传统。植物药和毒物 [compte-rendu]。Journal d'Agriculture Traditionnelle et de Botanique Appliquée，21-1-3、76-77。
[ 2 ] Burkill, HM (1985) 西热带非洲的有用植物。第 1 卷，第 2 版，皇家植物园，Kew，伦敦。
[ 3 ] Campbell, CW 和 Phillips, RL (1983) 糖苹果。水果作物概况介绍。佛罗里达大学合作推广服务，佛罗里达州盖恩斯维尔，1-3。
[ 4 ] Bejoy, M. 和 Hariharan, M. (1992) 番荔枝的体外植物分化。植物细胞组织和器官培养，31, 245-247。
[ 5 ] de Q. Pinto、AC、Cordeiro、MCR、de Andrade、SRM 等。(2005) 番荔枝物种。在：Williams, JT, et al., Eds., International Centre for Underutilized Crops, University of Southampton, Southampton, UK, 268 p.
[ 6 ] Rasai, S., George, AP 和 Kantharajah, AS (1995) 番荔枝属的组织培养。（Cherimoya、Atemoya、Sugar Apple 和 Soursop）：回顾。园艺科学，62，1-14。
[ 7 ] Rancillac, M. (1977) Mise au point d'une méthode de multiplication végétative in vitro du Pin marine (Pinus pinaster Sol.) pour la 宪法 de clones à partir de semences。阿福塞尔, 12, 41-48。
[ 8 ] Chokheli, VA, Kagan, D., Rajput, V. 等。（2018 年）。使用 ISSR 标记对俄罗斯罗斯托夫地区有梗橡树 (Quercus robur) 种群的遗传变异性。国际农业与生物学杂志，20, 2544-2548。
[ 9 ] Murashige, T. 和 Skoog, F. (1962) 用于烟草组织培养物快速生长和生物测定的修订培养基。植物生理学，15, 473-497。
[ 10 ] Mathur, N., Ramawat, KG 和 Dilip, N. (1995) Multiplication rapide in vitro de jujube part tige 成熟。Culture de Cellules Végétales, de Tissus et d'Organes, 43, 75-77。
[ 11 ] Farooq, SA, Farooq, TT 和 Rao, TV (2002) 番荔枝的微繁殖。使用节点外植体。巴基斯坦生物科学杂志，5, 43-46。
[ 12 ] Ba, O.、Dieme, A. 和 Sy, MO (2021) 具有社会经济重要性的萨凡纳物种成体材料的体外克隆繁殖：番荔枝。农业科学，12，370-386。
[ 13 ] Hoagland, DR 和 Arnon, DI (1938) 无土栽培植物的水培方法。加州农业实验站循环，347, 32。
[ 14 ] Ncube, B.、Finnie, JF 和 Van Staden, J. (2011) 南非常用药用球茎植物抗菌和植物化学特性的季节性变化。南非 Boany 杂志，77，387-396。
[ 15 ] Velásquez, M.、González, T.、Mata, F.、León de Sierralta, S.、Esparza, D. 和 Ramírez, M.（2004 年）库存植物遮光和芽的横向生长时间对番荔枝 L 生存力的影响. 外植体。Revista de la Facultad de Agronomía de la Universidad del Zulia (LUZ), 21, 12-17。
[ 16 ] Šamec, D., Karalija, E., Šola, I. 等。（2021）多酚在非生物应激反应中的作用：分子结构的影响。植物, 10, 118.
[ 17 ] Sharma, A.、Shahzad, B.、Rehman, A.、Bhardwaj, R.、Landi, M. 和 Zheng, B. (2019) 苯丙素途径的反应和多酚在非生物胁迫下植物中的作用。分子, 24, 2452.
[ 18 ] Linić, I., Šamec, D., Grúz, J. 等。（2019）酚酸参与短期适应盐分胁迫是十字花科的物种特异性。植物（巴塞尔），8、155。
[ 19 ] 侯赛因，S.，南达，S.，张，J.，等人。（2021）叶片形态发生和叶序过程中生长素和细胞分裂素的相互作用。植物, 10, 1732.
[ 20 ] Guru Prasad, M.、Shridevi, V. 和 Kumar, SM（2014 年）Blackgram 子叶节点的高效植物再生（Vigna mungo (I.) Hepper）。国际先进生物技术与研究杂志，15, 20-24。
