荧光染色法评价马铃薯囊线虫（Globodera pallida）和麻黄线虫（G.ellingtonae）的生活力

摘要：马铃薯胞囊线虫 (PCN)、苍白球藻和Globodera rostochiensis是马铃薯的检疫性害虫，对全世界的生产和农场收入造成重大损害。准确评估 PCN 卵的生存能力对于根除和管理计划很重要。本研究的目的是开发一种快速可靠的荧光染色方法来评估G的生存能力。pallida和Globodera ellingtonae卵。使用G评估八种荧光染料的染色效率。苍白蛋比较 使用传统的 Meldola's Blue (MB) 染色方法。荧光染料的染色效率范围为 80.33 ± 2.99 (Sytox Green) 到 100% (吖啶橙) 对无活力的鸡蛋。进一步评估了两种染色剂在评估来自五种不同温室饲养的G的包囊卵的活力方面的效率。苍白球囊肿来源，其中包含有活力和无活力的卵子。对于G。当用吖啶橙 (AO) 染色时，被囊卵的生存力估计为 41.02 ± 3.81至62.66 % ± 3.12%，而对G的生存力估计为 79.52 % ± 1.54% 。艾灵顿科 . 染色时间和染色浓度对于释放和包囊卵的染色效率都很重要。AO的染色时间和浓度分别针对 4 小时 10 μg/ml 的释放卵和16小时 25 μg/ml 的包囊卵优化。荧光染料准确快速地评估了卵子的存活率，并被确定为与使用 Meldola 的蓝色染色方法进行 7 天的孵化一样敏感。

关键词

苍白球藻, Globodera ellingtonae ,线虫活力评估,荧光染料, Meldola Blue

一、简介

生物营养性孢囊线虫是对全球种植系统造成经济损失最大的害虫之一 [ 1 ]。据估计，马铃薯胞囊线虫 (PCNs) Globodera pallida (Stone) Behrens 和 Globodera rostochiensis (Wollenweber) Behrens 在英国造成 9% 的马铃薯产量损失 [ 2 ] [ 3 ]。G. pallida 和 G. rostochiensis 都起源于南美洲，并传播到世界上几乎所有主要的马铃薯种植区。由于易于传播和经济重要性，马铃薯胞囊线虫被列为检疫性害虫，并在许多国家受到严格监管 [ 4 ] [ 5 ]。

在美国，G. pallida 于 2006 年在爱达荷州被发现 [ 6 ]，是美国农业部动植物卫生检验局 (USDA-APHIS) 和爱达荷州农业部 ( ISDA) [ 7 ] [ 8 ]。爱达荷州当前的虫害地图可通过 USDA-APHIS 网站获得：https ://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/planthealth/plant-pest-and-disease-programs/pests-and-diseases /线虫/pcn）。植物检疫法规限制在受侵染的田地中种植马铃薯或任何其他寄主作物 [ 7]。它只需要从两个不同的土壤样本中提取两个孢囊，其中一个孢囊含有可存活的 PCN 卵，就可以认为该田地被侵染了。当 Meldola 的蓝色活力染色方法不再检测到可存活的卵并且马铃薯生物测定未检测到 PCN [ 7 ] 的繁殖时，受感染的田地有资格取消一些限制。G. pallida 控制面临的一个挑战是带囊卵在土壤中长时间（超过 20 年）保持活力的能力，以及它们在长时间静止期后感染马铃薯的能力 [ 9 ] - [ 11 ] 从而进行控制按轮作困难。

量化 G. pallida 卵的生存能力对于有效管理和根除计划都很重要。不幸的是，除了费时费力的染色和线虫的显微镜评估外，没有有效的方法可用于此目的。传统的 PCN 活力评估方法是通过使用重要染色剂进行的，例如 Meldola 蓝和尼罗蓝 A [ 12 ] - [ 14 ]。加拿大和美国关于 G. pallida 和 G. rosctochiensis 的监测和植物检疫行动指南以及欧洲植物保护组织 (EPPO) 推荐使用 Meldola's Blue 方法对土壤样本中的种群密度进行常规测定 [ 4 ] [ 7]。但这种方法需要 7 天才能充分染色鸡蛋。除了使用重要染色剂外，体外卵孵化试验 [ 15 ] 也可用于评估卵子的活力，但这种方法不考虑可能存活但处于滞育状态的未孵化卵子 [ 16 ]。

荧光染料很少用于评估线虫卵的活力，但它们广泛用于精确诊断细胞活力和细胞死亡 [ 17 ] - [ 20 ]。细胞渗透性和非渗透性荧光染料均可用于评估细胞活力以及活细胞和死细胞的差异染色。细胞渗透染料可以自由扩散通过活细胞的膜，而非渗透荧光染料只能通过受损的细胞膜扩散 [ 21 ]。与非荧光染料相比，荧光染料提供更高的光稳定性和亮度，并且不需要延长孵育时间 [ 22]。对于线虫，染色方法的成功取决于其角质层和脂蛋白膜的染色渗透性 [ 12 ] [ 23 ]。渗透性受到年龄、温度、化学杀线虫剂、线虫病原体等环境因素的影响[ 24 ]。在较早的尝试中，Perry 和 Feil [ 25 ] 使用荧光染料吖啶橙 (AO) 来确定 G. rostochiensis 的活力，Twomey 等人 [ 26 ] 使用 AO 作为 G. rostochiensis 卵子渗透性的指标。与马铃薯根部渗出液接触引起的rostochiensis。同样，AO 已被用于区分 Heterodera 甘氨酸的活卵和死卵 [ 24 ] [ 27] 并研究幼体孵化与 H. glycines 卵的荧光之间的关系 [ 28 ]。最近，Hajihassani 和 Dandurand [ 29 ] 评估了荧光染料 Sytox Green 和 Sytox Live/Dead green 试剂盒染色用于大颗粒流式细胞术中苍白球菌的活力染色。

在本研究中，评估了细胞不透性荧光染料的 PCN 卵活力。本研究的目的是开发一种快速可靠的荧光染色方法，用于评估 PCN 卵子的活力。将荧光染料的有效性与经典的 Meldola 蓝染色方法进行了比较。

2。材料和方法

2.1。马铃薯囊肿线虫囊肿

研究中使用了两种Globodera 物种，G. pallida 和 G. ellingtonae。使用了来自爱达荷州在两种不同易感马铃薯品种 Desirée 或 Russet Burbank 上饲养的 G. pallida 种群的五种不同温室饲养的孢囊来源 (AE)。在侵染和种植 16 周后，使用淘洗器从土壤中提取包囊，并将收获的包囊储存在 4˚C 直至实验使用 [ 30 ] [ 31 ]。对苍白球囊肿的形态和分子种类进行了确认 [ 32 ]。Globodera ellingtonae 囊肿由 Inga Zasada 博士 (USDA-ARS, Corvallis, Oregon) 提供。

2.2. 荧光染色和显微镜

八种细胞不透性荧光染料吖啶橙 (AO)、Laser Dye Styryl 751 (LDS 751)、SYTO Orange 81、SYTO Orange 82、SYTO Orange 83、SYTO Orange 84、SYTO Orange 85 和 Sytox Green 用于评估 PCN 卵子可行性。所有荧光染料均购自美国俄勒冈州尤金市的 Thermo Fisher Scientific。用于荧光染色方法评价的生命染料 Meldola's Blue (8-dimethylamino-2,3-benzophenoxazine hemi (zinc chloride) salt) 购自 Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, USA。

使用配备有金属卤化物灯（Lumen 200 荧光照明系统，Prior Scientific Inc.，Rockland，MA，USA）光源的 Leica DMi8 荧光显微镜（Leica microsystems CMS GmbH，Wetzlar，Germany）对染色的鸡蛋进行检查。带有过滤立方体的手动过滤转塔，4',6-Diamidino-2-Phenylindole, dihydrochloride (DAPI) (Ex:390/70-DC:455-EM:470), fluorescein isothiocyanate (FITC) (Ex:470/40) -DC:495-EM:525/50)、罗丹明 (Ex:546/10-DC:560-EM:585/40) 和 Y5 (Ex:620/60-DC:660-EM:700/76)用于可视化具有不同荧光发射最佳值的不同污渍。在明场下分析 Meldola 蓝色染色的鸡蛋。计算每种染色剂的荧光数据，并用焦点检查荧光显微镜测试载玻片#3 (Thermo Fisher Scientific)校准荧光显微镜。

2.3. PCN 卵和囊肿染色的染色剂优化

为了优化染色方案 20 表面消毒和预浸泡（在水中 24 小时）G.苍白球囊肿用于每个染色。将包囊转移到装有 50 µl Barnstead GenPure 水（Barnstead GenPure UV-TOC xCAD plus，Thermo electron LRD GmbH，Stockland 3，Germany）的 2 ml eppendorf 管中，使用 Tenbroeck 全玻璃组织匀浆器（Fisher Scientific，USA）粉碎. 使蛋悬浮液在室温下静置 5 分钟，然后使用冷冻台式离心机（Eppendorf 离心机 5810R，Eppendorf AG，22331，汉堡，德国）在 4°C 下以 4800 g 离心 3 分钟。去除上清液并将卵重新悬浮在 1.5 ml GenPure 水中。四种不同浓度的染色剂，5、10、25 和 50 µg/ml，用于 AO 和 LDS 751；和 5、10、使用浓度为 25 和 50 µM/ml 的 SYTO Orange 81 - 85 和 Sytox Green 染料。所有染色稀释液均使用无菌 GenPure 水进行。为了优化污渍，使用 Christoforo 等人的改进方法将 G. pallida 卵加热杀死，[33]。使用加热块在 70°C 下对释放的鸡蛋进行 2 小时的热处理，然后在染色前在冰上冷却。对于每个浓度，将 100 µl 具有等体积染色溶液的鸡蛋悬浮液移液到 1.5 ml eppendorf 管中，并在室温下避光孵育。在 1、2、4 和 8 小时孵育时间进行染色效率评估。为了去除残留的污渍，将 50 µl 鸡蛋悬浮液以 4800 g 离心 3 分钟，然后用 100 µl GenPure 水洗涤。将颗粒状的鸡蛋重新悬浮在 10 µl GenPure 水中，然后分装到载玻片上进行显微镜检查。平均每个重复计数 65 个卵子，每个处理重复 3 次，并重复实验。荧光卵百分比的计算公式为：

进一步评估了来自上述实验的两种染色剂 AO 和 LDS 751 用于染色来自整个 G. pallida 和 G. ellingtonae 包囊的卵。全热灭活（将包囊在沸水中孵育 7 分钟并在冰浴上冷却） 将来源 A 的包囊在室温下于黑暗中以 10、25 和 50 µg/ml 浓度孵育 4、8、16 和 24 小时AO 和 LDS 751 的最终浓度分别为 25、50 和 100 µg/ml。对每种处理的 36 个囊肿进行染色，并在每种浓度的每个时间间隔评估来自 9 个囊肿的卵。将包囊压碎、清洗以去除多余的污渍，然后将释放的卵重新悬浮在 50 µl GenPure 水中。将每次处理的每份含有约 140 个鸡蛋的 3-10 微升等份分配到载玻片中，在显微镜下观察并评分。

2.4. 使用荧光染料进行 PCN 活力评估

使用 AO 和 LDS 751 测试了五种不同的 G. pallida 和一种 G. ellingtonae 包囊来源，以使用优化的染色参数进行活力评估。从包囊来源中保持包囊的卵子被荧光染色，并与 Meldola 的蓝色染色测定法进行比较 [ 13]。每个来源的表面灭菌、预浸泡的包囊在每个处理中重复 5 次，并重复实验。染色后，将每个复制品的包囊压碎，清洗以去除多余的污渍，重新悬浮在 50 ul GenPure 水中，然后分配和计数平均含有 158 个卵的 10 µl 等分试样。来自每个包囊来源的热灭活包囊用作阳性对照。在 7 天的孵育时间后评估 Meldola's Blue 染色的活力。使用公式计算鸡蛋存活率百分比：鸡蛋存活率百分比 =（未染色鸡蛋/（染色鸡蛋 + 未染色鸡蛋））×100。

2.5. 统计分析

为了评估重要荧光染料的染色效率，采用 SAS 统计软件包的广义线性混合模型 (Proc GLIMMIX) 程序分析了 9 种染色剂的随机完整设计 (RCD)、4 种不同浓度的染色剂的 4 种不同优化时间。34 ]假设染色鸡蛋数量的二项分布和logit链接函数。将不同的染色剂、染色剂浓度和染色时间视为固定效应，并测试主要（染色百分比）和交互作用（染色剂、浓度、染色*浓度的相互作用）随时间的显着性。显着性水平设置为 p ≤ 0.05。

3. 结果

3.1。热杀鸡蛋的染色效率

所有测试的荧光染色表明 80% 或更多的非存活卵群，而 Meldola's Blue 表明平均 51.5% 的非存活卵群。当用 Sytox green 或 AO 染色时，无活力的鸡蛋会发出强烈的绿色荧光（图 1）；用 LDS 751 染色时呈红色；或用 SYTO Orange 系列染色时呈橙色。空鸡蛋与完整鸡蛋很容易区分，因为空鸡蛋的蛋壳膜被染色，留下一个空心透明的蛋壳，在显微镜下很容易区分（图1）。在我们的研究中，无活力的鸡蛋与死鸡蛋一样明显区别于活鸡蛋

图 1。吖啶橙染色的 G. pallida 卵。死鸡蛋的特点是深染绿色荧光，而活鸡蛋没有强烈的荧光。活蛋和空蛋壳通过粒度来区分（空蛋壳没有内部结构）。比例尺 = 50 μM。

始终给出 255 的最大荧光检测值，而活卵使用 LAS 软件的平均值 < 80。

所有荧光染料都需要染色 4 小时，孵育 8 小时后效率没有增加（表1)。在测试的各种染色剂中，AO 是最有效的染色剂，因为在测试的最低浓度 (5 µg/ml) 下 4 小时后，87.61% ± 1.12% 的无活力卵被染色；100% 的无活力卵在 25 µg/ml 浓度下 4 小时后被染色（表1)。当 AO 以较高浓度（25 和 50 µg/ml）使用时，需要额外清洗以从背景中去除高荧光。平均 98. 45% ± 0.86% 的无活力卵在 4 小时内被 LDS 751 (25 µg/ml) 染色（表1)。SYTO Orange 系列 81 到 85 和 Sytox Green 染色剂 (50 µM/ml) 的效率较低，因为只有 83% - 93% 的无活力、热灭活的鸡蛋在孵化 4 小时后被染色（表1)。增加 SYTO 染料浓度和孵育时间不会增加染色效率（表1)。图 2显示了用荧光染料 AO、LDS 751 和 SYTO Orange 85 与对照 Meldola's Blue 染料染色的苍白球藻卵和幼鱼的荧光。染色时间、浓度和染色*浓度*时间之间的相互作用是显着的 (p ≤ 0.0001)。作为补充表S1 和表S2提供了染色浓度和染色时间对释放的无活力 G. pallida 卵的染色百分比的相互作用。

3.2. 热杀死囊肿的染色效率

进一步评估了两种染色剂 AO 和 LDS 751 的效率，以估计

弄脏

浓

染色百分比

1小时

2小时

4小时

8 小时

吖啶橙

5微克/毫升

80.98 ± 2.02

83.20 ± 1.38

87.61 ± 1.12

87.93 ± 1.10

10微克/毫升

90.82±0.56

98.24±0.16

99.45 ± 0.39

99.56 ± 0.31

25 微克/毫升

92.84 ± 0.73

98.79 ± 0.45

100.00 ± 00

100.00 ± 00

50微克/毫升

93.73 ± 0.48

99.05 ± 0.67

100.00 ± 00

100.00 ± 00

LDS 751

5微克/毫升

44.30 ± 2.29

52.19 ± 2.71

61.47 ± 3.51

59.01 ± 2.60

10微克/毫升

54.62 ± 3.40

80.85 ± 1.63

89.94 ± 2.23

83.63 ± 1.06

25 微克/毫升

64.45 ± 2.31

90.29 ± 0.49

98.93 ± 0.76

97.84 ± 0.94

50微克/毫升

71.56 ± 2.01

91.45 ± 1.27

98.45 ± 0.86

98.10 ± 1.13

SYTO橙81

5微米

20.94 ± 2.28

24.03 ± 2.38

25.63 ± 4.23

22.06 ± 2.35

10微米

33.35 ± 1.92

51.90 ± 2.03

59.09 ± 3.56

54.62 ± 1.71

25微米

48.23 ± 2.32

72.69 ± 1.54

81.15 ± 1.75

78.72 ± 1.69

50微米

54.80 ± 2.69

76.26±2.56

88.83 ± 1.00

85.90 ± 1.21

SYTO橙82

5微米

21.28 ± 2.08

21.26 ± 2.89

19.76 ± 1.95

20.38 ± 2.54

10微米

31.20 ± 2.00

46.65 ± 1.89

56.16 ± 4.09

64.68 ± 1.86

25微米

47.02 ± 1.06

70.67 ± 1.64

81.42 ± 1.34

73.73 ± 1.39

50微米

55.22 ± 1.22

81.24 ± 1.20

89.92 ± 0.85

85.77 ± 1.54

SYTO橙83

5微米

35.24 ± 2.94

40.64 ± 2.29

39.91 ± 1.60

40.41±1.65

10微米

60.08 ± 1.50

72.85 ± 1.60

77.16 ± 1.19

76.79 ± 1.70

25微米

65.41 ± 1.97

80.99 ± 0.48

93.34 ± 1.82

92.95 ± 0.92

50微米

71.85 ± 3.56

85.33 ± 2.26

93.43 ± 2.00

92.89 ± 1.60

SYTO橙84

5微米

27.76 ± 2.17

27.60 ± 2.39

28.57 ± 2.86

27.57 ± 2.27

10微米

41.69±0.52

60.73 ± 1.52

60.47 ± 3.07

63.75 ± 1.69

25微米

51.00 ± 3.67

79.69 ± 0.73

85.76 ± 1.81

82.85 ± 1.68

50微米

68.08 ± 3.20

82.28 ± 1.07

88.93 ± 1.34

88.92 ± 2.49

SYTO 橙 85

5微米

55.89 ± 2.02

58.38 ± 3.45

57.43 ± 2.09

59.86 ± 0.79

10微米

73.66 ± 1.92

79.22 ± 1.95

82.17 ± 1.58

82.15±0.62

25微米

85.36±1.23

88.29 ± 2.61

90.09 ± 2.01

89.20 ± 1.99

50微米

86.28 ± 1.72

86.18 ± 0.87

92.28 ± 1.69

90.14 ± 1.72

SYTOX 绿

5微米

34.41 ± 1.62

36.17 ± 2.50

37.65±0.85

39.62 ± 2.87

10微米

58.67±0.82

63.99 ± 3.24

66.33 ± 3.10

68.83 ± 3.08

25微米

68.48 ± 1.46

76.40 ± 1.84

83.33 ± 1.43

77.80 ± 1.65

50微米

73.43 ± 2.25

79.37 ± 1.52

83.23 ± 1.14

80.33 ± 2.99

梅尔多拉的蓝

0.05% w/v

26.04 ± 1.60

33.88 ± 1.77

42.08 ± 1.56

51.62 ± 1.43

表 1。八种荧光染料和 Meldola's Blue 对 G. pallida 卵的染色效率百分比*。

*值是两个独立实验的平均值，每个实验三个重复，后面跟着标准误差。

弄脏

浓

染色百分比

4小时

8 小时

16 小时

24 小时

吖啶橙

10微克/毫升

84.06 ± 1.63

91.18 ± 0.86

93.71 ± 1.54

92.88 ± 1.75

25 微克/毫升

90.90 ± 0.88

96.01 ± 1.16

100.00 ± 00

100.00 ± 00

50微克/毫升

94.03 ± 0.63

99.63±0.26

100.00 ± 00

100.00 ± 00

LDS 751

25 微克/毫升

75.22 ± 2.75

83.40 ± 1.72

86.17 ± 2.34

85.95 ± 2.46

50微克/毫升

79.70 ± 1.31

88.60 ± 1.57

95.94 ± 0.35

95.11±0.85

100 微克/毫升

80.28 ± 1.75

89.30 ± 0.84

96.58 ± 0.99

95.15 ± 0.63

梅尔多拉的蓝

0.05% w/v

41.96 ± 1.21

49.06 ± 2.84

70.04 ± 2.41

76.99 ± 1.95

表 2。AO 和 LDS 751 对苍白球孢子囊肿的染色效率*。

*值是两个独立实验的平均值，每个实验三个重复，后面跟着标准误差。

图 2。荧光染色与 Meldola 蓝色染色的比较。(a)-(c) 是分别用 AO、LDS 751 和 SYTO Orange 85 染色剂染色的热灭活 G. pallida 卵，(d)-(f) 是相应卵的明场图像，G 是 Meldola 蓝染色蛋。AO 对死苍白球菌卵产生深绿色荧光，而 LDS 751 和 SYTO Orange 系列染色剂对死卵分别发出红色和橙色荧光。比例尺 = 50 μM。

无活力、热杀死的 G. pallida 包囊卵的百分比。无论卵在染色前是释放还是保持包囊，这两种染色的效率都没有发现差异。然而，与 LDS 751 或 Meldola's Blue 相比，当使用 AO 时，明显更高百分比的鸡蛋被染色。与游离卵不同，全包囊需要更高浓度的 AO 和 LDS 751（分别为 25 µg/ml 和 50 µg/ml）。在 16 小时内，只有 93.7% 的无活力、热杀死的鸡蛋在 10 µg/ml 浓度下被染色，但当使用 25 µg/ml AO 浓度时，染色率增加到 100%。当使用浓度为 25 µg/ml 时，用 LDS 751 染色的无活力卵百分比为 86.1%，而将浓度增加到 50 µg/ml 时，染色效率为 95.9%（表2)。发现染色时间、浓度和染色*浓度*时间之间存在显着的相互作用（p ≤ 0.0001）（补充表S3 和表S4）。

弄脏

浓

时间

全科医生

来源 A

全科医生

来源 B

全科医生

来源 C

全科医生

来源 D

全科医生

来源 E

通用电气

吖啶橙

25 微克/毫升

16 小时

41.02 ± 3.81

44.36 ± 3.59

51.46 ± 3.87

57.85 ± 5.14

62.66 ± 3.12

79.52 ± 1.54

LDS 751

50微克/毫升

16 小时

47.34 ± 1.30

53.20 ± 1.82

55.53 ± 4.23

61.89 ± 3.85

65.20 ± 3.44

86.25 ± 1.78

梅尔多拉的蓝

0.05% w/v

7天

39.21 ± 6.24

41.00 ± 1.96

43.58 ± 4.78

51.95 ± 5.62

52.55 ± 4.03

90.10 ± 1.10

表 3。比较使用 AO、LDS 751 和 MB 染色方法测定的 5 个苍白球囊肿源和 G. ellingtonae 的存活率百分比。

*值是两个独立实验的平均值，每个实验三个重复，后面跟着标准误差。GP—G。帕利达，GE—G。艾灵顿科。

可行性评估方法

染色浓度

生存能力百分比

吖啶橙

25 微克/毫升

51.47 ± 1.43 a*

LDS 751

50微克/毫升

56.63± 1.43 一个

梅尔多拉的蓝

0.05% w/v

45.66 ± 1.43 b

表 4。不同 G. pallida 包囊来源和染色剂在评估活力时的相互作用。

*数据基于 5 种不同的苍白球囊肿来源，不同字母的平均值由 Tukey 的 HSD 比较测试确定，p < 0.05。

3.3. 荧光染料与 Meldola 蓝在评估 PCN 卵子活力方面的比较

将使用 AO 或 LDS 751 的活力测定与 Meldola 的 Blue 方案进行了比较。当用 AO 染色时，五个温室饲养的苍白球囊肿源的卵存活率范围为 41.0% ± 3.8%（源 A）至 62.3% ± 3.1%（源 E）；使用 LDS 751 染色时为 47.3% ± 1.3% 至 65.2% ± 3.4%；和 39.2% ± 6.2% 至 52.6% ± 4.0% 与 Meldola's Blue 染色（表 3）。包囊来源和染色剂之间的相互作用不显着（p ≥ 0.15），这表明包囊来源对每种活力评估方法的反应相似。然而，所用染色剂的类型对存活率评估有显着影响（p ≤ 0.001）（表 4）。

4。讨论

准确测定 PCN 卵的活力对于估计因线虫侵染而造成的潜在作物损失以及采取适当的监管和/或管理措施非常重要。尽管有几种染色方法用于检测 PCN 卵子的活力，但使用活体染色及其目视观察被认为是最准确、可靠和被广泛接受的活力评估方法 [ 33 ]。目前用于 PCN 活力评估的重要染色剂 Meldola's Blue 可孵育 7 天，以便对鸡蛋进行充分染色。这是耗时的，并且可能会偏向于无法生存的人口 [ 35]。这种方法也不能成功染色老化标本，通常会产生黄色标本，在某些情况下，标本可能在头部区域或尾部被部分染色 [ 12 ]。本研究中检查的八种荧光染料表明，使用荧光染料对 PCN 卵子活力评估是可靠的。

吖啶橙是一种强大的染色剂，可用于测量细胞凋亡，并可用于固定组织和细胞 [ 36 ]。Twomey 等人。[ 26 ] 使用荧光染色 AO 作为密切相关的 PCN 物种 G. rostochiensis 中由马铃薯根扩散液引发的卵渗透性的指标。在本研究中，几乎 100% 的热杀死的 G. pallida 和 G. ellingtonae 卵被 AO 染色，这与 Twomey 等人的观点一致。[ 26 ]。用 AO 染色准确估计了 G. pallida 和 G. ellingtonae 的无活力卵。迈耶等人。[ 24] 报道称，AO 可用于区分有活力和无活力的 Heterodera glycines 卵。LDS 751 在 4 小时内染色超过 98% 的热致死鸡蛋。LDS 751 在与核酸结合时会发生荧光增强，但在与用于区分完整和受损细胞的蛋白质结合时荧光增强可忽略不计。具有受损膜的无活力鸡蛋允许染料有效地将鸡蛋染成深读数，而蛋膜染色最少。此外，LDS 751 用于区分凋亡细胞和非凋亡细胞 [ 37]。LDS 751 染色剂的这一特性可进一步用于对老龄化的苍白球菌卵进行染色。由于 AO 和 LDS 751 都是可固定的核酸染色剂，因此这些染色剂会更加稳定，随着时间的推移很少或没有光漂白。

SYTO 荧光染料家族在结合核酸时表现出 450 到 1000 倍的荧光增强 [ 22 ]，并广泛用于确定各种细胞系的活力/凋亡 [ 37 ] - [ 39 ]。SYTO 染料相对较高的染色效率可用于实验室条件下 PCN 的活力评估。SYTO 染色剂的低细胞毒性作用 [ 39 ] 可能是用于下游加工的优势，例如孵化试验。然而，与其他荧光染料相比，SYTO 染料的一个缺点是它们对储存条件的敏感性。在之前的一项研究中，Hajihassani 和 Dandurand [ 29] 使用 Sytox Green 染料进行荧光染色，并使用流式细胞仪分选苍白球藻，观察到随着孵化时间的增加，卵的存活率增加。该研究还报告说，G. pallida 卵的生存力估计值比 Meldola 的蓝色染色高 7% - 14.6%。在凋亡级联启动后 SYTO 染色剂的荧光损失已得到充分证明 [ 40 ] [ 41]。在细胞死亡过程中 SYTO 分子的自猝灭会导致荧光丧失和对生存能力的高估。凋亡染色质凝聚，SYTO 结合位点数量减少，如凋亡过程中染色质凝聚和/或 RNA 降解，SYTO 与线粒体 DNA 结合的改变和 SYTO 分子的线粒体摄取减少，细胞死亡过程中质膜完整性的丧失都可能是 SYTO 染色造成荧光损失的可能原因 [ 38 ] - [ 44 ]。

这项研究的结果清楚地表明，荧光染料可以可靠地评估 G. pallida 和 G. ellingtonae 的生存能力。与 Meldola's Blue 染色相比，评估的荧光染色所需的染色时间最短。荧光染料的使用可以进一步开发用于 PCN 生命阶段的基于荧光的高通量分选，例如通过使用自动细胞成像系统和/或大颗粒流式细胞仪来评估现场衍生的包囊卵的生存能力。

致谢

我们感谢 Inga Zasada 博士（USDA-ARS，Corvallis）提供 G. ellingtonae 囊肿，William Price，爱达荷大学统计项目主任提供统计数据分析建议，以及 PCN 实验室成员 Amanda Gray 和 Emily Forsberg 在爱达荷大学的帮助。

补充

弄脏

5微克/毫升

10微克/毫升

25 微克/毫升

50微克/毫升

AO

85.32 ± 1.02一个

97.63 ± 0.46一个

98.31 ± 0.39一个

98.25 ± 0.39一个

LDS751

53.83 ± 1.55b

79.38 ± 1.42b

93.93 ± 0.92b

94.49 ± 0.80b

SYTO81

22.82 ± 1.25e

49.62 ± 1.85英尺

71.48 ± 1.33e

78.45 ± 1.22e

SYTO82

20.67 ± 1.20e

49.57± 1.86 英尺

69.25 ± 1.35e

80.15 ± 1.20e

SYTO83

38.98±1.50℃

72.13±1.58℃

85.87±1.11℃

87.35±0.98℃

SYTO84

27.86 ± 1.37天

57.22 ± 1.82e

76.72 ± 1.25天

83.36 ± 1.11天

SYTO85

57.78 ± 1.54b

79.43 ± 1.34b

88.08±0.91℃

89.08±0.86℃

西毒绿

36.95±1.50℃

64.64 ± 1.72天

76.90 ± 1.12天

79.35 ± 1.13e

MB

-

-

-

37.87 ± 1.14英尺

表 S1。污渍浓度对释放的无活力 G. pallida 卵的染色百分比的影响。

染色最小二乘法的 T 分组均值 (Alpha = 0.05)。MB 染色剂的单一标准浓度 (0.05% w/v) 用于研究。具有相同字母的 LS-means 没有显着差异。

时间

5微克/毫升

10微克/毫升

25 微克/毫升

50微克/毫升

1小时

39.50 ± 1.15b

57.51±1.37℃

68.24 ± 1.06天

69.66±0.97℃

2小时

42.61 ± 1.17抗体

74.15 ± 1.29b

85.14±0.86℃

83.69 ± 0.88b

4小时

44.91 ± 1.21一个

79.93 ± 1.29一个

92.95 ± 0.75一个

91.36 ± 0.71一个

8 小时

44.86 ± 1.22一个

79.86 ± 1.31一个

90.69 ± 0.79b

90.69 ± 0.73一个

表 S2。染色时间对不同浓度释放的无活力的苍白球藻卵的染色百分比的影响。

T 时间最小二乘均值分组 (Alpha = 0.05)。具有相同字母的 LS-means 没有显着差异。

弄脏

10微克/毫升

25 微克/毫升

50微克/毫升

AO

91.11 ± 0.71一个

97.86 ± 0.33一个

98.66 ± 0.23一个

LDS751

83.35 ± 1.08b

91.43 ± 0.63b

92.08 ± 0.56b

MB

-

-

60.81±1.20℃

表 S3。污渍浓度对被包裹的无活力 G. pallida 卵的染色百分比的影响。

染色最小二乘法的 T 分组均值 (Alpha = 0.05)。具有相同字母的 LS-means 没有显着差异。MB 染色剂的单一标准浓度 (0.05% w/v) 用于研究。

时间

10微克/毫升

25 微克/毫升

50微克/毫升

4小时

69.48 ± 1.67摄氏度

86.21±1.15℃

88.92±0.90℃

8 小时

78.74 ± 1.39b

92.93 ± 0.76b

96.74 ± 0.60b

24 小时

86.10 ± 1.06一个

98.30 ± 0.39一个

98.38 ± 0.37抗体

48 小时

86.76 ± 0.99一个

98.05 ±0.43

98.06 ± 0.43b

表 S4。染色时间对不同浓度包囊的无活力 G. pallida 卵的染色百分比的影响。

T 时间最小二乘均值分组 (Alpha = 0.05)。具有相同字母的 LS-means 没有显着差异。

利益冲突

作者声明与本文的发表没有利益冲突。

参考

[ 1 ] Nicol, JM, Turner, SJ, Coyne, DL, Nijs, L., Hockland, S. 和 Maafi, ZT (2011) 当前对世界农业的线虫威胁。在：Jones, J.、Gheysen, G. 和 Fenoll, C., Eds.，植物线虫相互作用的基因组学和分子遗传学，Springer, Dordrecht, 21-43。

[ 2 ] Turner, SJ 和 Evans, K. (1998) 马铃薯包囊线虫 (Globodera rostochiensis (Woll.) 和 Globodera pallida (Stone) 的起源、全球分布和生物学。在：Marks, RJ and Brodie, BB, Eds., Potato囊肿线虫：生物学、分布和控制，CABI，Wallingford，7-26。

[ 3 ] Turner, SJ 和 Rowe, JA (2006) 囊肿线虫。在：Perry, RN 和 Moens, M., Eds., 植物线虫学, CABI, Wallingford, 91-122。

[ 4 ] Seehofer, H. (2007) 2007 年 6 月 11 日理事会指令 2007/33/EC，关于控制马铃薯包囊线虫和废除指令 69/465/EEC。欧盟官方公报，156, 12-22。

[ 5 ] Hockland, S., Niere, B., Grenier, E., Blok, VC, Phillips, MS, DenNijs, L., Anthoine, G., Pickup, J. 和 Viaene, N. (2012) 影响评估欧洲马铃薯种植中非欧洲种群的毒力研究。线虫学, 14, 1-13。

[ 6 ] Hafez, SL, Sundararaj, P., Handoo, ZA, Skantar, AM, Carta, LK 和 Chitwood, DJ (2007) 美国苍白囊肿线虫第一份报告。植物病害，91, 325.

[ 7 ] 匿名 (2014) 加拿大和美国：马铃薯囊肿线虫 Globodera rostochiensis 和 Globodera pallida 的监测和植物检疫行动指南。

https://www.aphis.usda.gov/plant_health/plant_pest_info/nematode/downloads/potato_guidelines.pdf

[ 8 ] Kooliyottil, R., Dandurand, LM, Govindan, BN 和 Knudsen, GR (2016) 显微镜法比较不同植物种类的包囊线虫感染。生物科学与生物技术进展，7，311-318。

https://doi.org/10.4236/abb.2016.76029

[ 9 ] Grainger, J. (1964) 影响鳗虫病控制的因素。线虫学, 10, 5-20。

[ 10 ] Jones, FGW (1970) 马铃薯包囊线虫的控制。皇家艺术学会杂志，118, 179-199。

[ 11 ] Turner, SJ (1996) 北爱尔兰田间土壤中马铃薯包囊线虫 (Globodera rostochiensis, G. pallida) 的种群减少。应用生物学年鉴，129，315-322。