将真菌Fusarium sp.产生的富含木聚糖酶的混合物固定在球体中

摘要：第二代乙醇是通过使用酶作为催化剂降解木质纤维素生物质生产的，重点是木聚糖酶。这些生物催化剂通常价格昂贵，但在高温下稳定，并且它们的重复使用具有很大的价值，因此酶的固定化可以增加它们在工业规模上的适用性。我们试图固定由真菌镰刀菌产生的富含木聚糖酶的混合物。EA 1.3.1 在藻酸盐球中，优化固定化方法，表征固定化衍生物，改善其物理化学特性，并进行甘蔗渣水解以释放糖。镰刀菌属。EA 1.3.1 已被鉴定并用于富含木聚糖酶生产的混合物，该混合物固定在藻酸盐球中。在此过程中，对滴注设备以及海藻酸钠和氯化钙溶液的浓度进行了评估。玻璃棒和溶液浓度分别为 3.14% 和 2.10% 时获得了最好的结果。研究了pH和温度反应的表观最佳条件，得到了pH 6.5和60℃的值。与可溶性混合物相比，固定化缀合物在该温度下也表现出更高的稳定性。该偶联物最多可循环使用 6 次，其活性在储存 75 天后仍可保持。最终实现了在天然甘蔗渣中的水解，并且在与缀合物的反应中获得了更大量的还原糖。因此，真菌产生的富含木聚糖酶的鸡尾酒镰刀菌属 EA1.3.1 成功地固定在藻酸盐球上，并具有在工业过程中用作催化剂的潜力，例如木质纤维素乙醇工业。

关键词

.木聚糖 酶 鸡尾酒,球体 固定化,木质 纤维素 分解 酶,生物质 水解

一、简介

化石燃料是一种可枯竭的能源，其大规模开采和随之而来的可用自然储备枯竭对环境保护造成负面影响[ 1 ]。减少这种影响的一种尝试是使用替代能源。生物燃料因其对环境有利且高效节能、可与化石燃料竞争或用作化石燃料的添加剂而脱颖而出 [ 2 ]。例如，在巴西，自 1993 年以来，汽油中必须使用 27% 乙醇的混合物 [ 3 ]。

人口的持续增长，以及“食物与燃料”的争论，已将研究导向从不用于食品目的的原材料生产生物燃料 [ 4 ] [ 5 ]。因此，木质纤维素生物质是最碳中和且可回收的资源之一，已被用于生产可再生能源，因此也用于生产生物乙醇。已经进行了研究，以使第二代乙醇 (2G) 或纤维素乙醇能够从工业废物（例如甘蔗渣）中商业化生产 [ 6 ] [ 7 ]。

木质纤维素生物质中糖类的丰富聚合物成分是其在生物能源转化方面具有高潜力的因素，这是一种复杂的结构，主要由三个具有高能量含量的部分组成，称为纤维素（40% 至 45%）、半纤维素（30 % 至 35%) 和木质素 (20% 至 30%)。然而，这种结构的复杂性也为其水解带来了困难[ 6 ]。基于酶的水解是一种生产可转化为生物燃料的小糖的环保程序 [ 7 ] [ 8]，例如使用木聚糖酶将半纤维素的主要成分木聚糖分解成木糖，木糖可以被专门用于发酵 5 碳糖的酵母转化为乙醇。这是对第二代工艺的经济可行性的重大挑战，因为酶的生产成本很高 [ 9 ] [ 10 ]。

生物乙醇的常规生产通常使用游离酶系统完成。为了提高该过程的效率，已提出酶固定化以确保酶的稳定性，从而改进该工业过程。此外，回收和再利用的可能性使得该技术的应用在经济上是可行的 [ 11 ] [ 12 ]。

固定化酶的其他优点是对反应环境变化的高耐受性、高热稳定性和 pH 稳定性、更容易分离催化剂和反应产物、提高生产率和乙醇产量、提高对高浓度底物的耐受性、减少最终产物的抑制，比可溶性酶更高的特异性和更高的储存稳定性。此外，酶不直接暴露于可引起变性和抑制的外部试剂 [ 13 ] - [ 18 ]。海藻酸钠是最容易获得、快速、无毒的固定支持物之一，具有良好的机械阻力和较便宜的程序。它是通过在氯化钙存在下封装酶来固定的 [ 19] [ 20 ] [ 21 ]。

基于这些信息，本研究旨在固定一种富含由丝状真菌镰刀菌产生的木聚糖酶的酶混合物。EA 1.3.1 在藻酸盐球中，标准化固定化方法，对固定化衍生物进行生化表征，并验证衍生物在天然甘蔗渣中水解的效率。结果是释放出对酒精发酵敏感的糖，用于纤维素乙醇工业。

二、材料与方法

这些测试是在巴西米纳斯吉拉斯州迪亚曼蒂纳的杰基蒂尼翁哈和穆库里谷联邦大学 (UFVJM) 科学技术研究所 (ICT) 的真菌学、酶学和产品开发实验室 (LMEDP) 进行的。该微生物已在国家遗传遗产和相关传统知识管理系统 (SisGen) 中注册，编号为 A64AD93。

2.1。丝状真菌镰刀菌属的维护。EA 1.3.1

丝状真菌镰刀菌属。EA 1.3.1 保存在含有 4% (w/v) Quaker ®​​ 燕麦固体培养基和 2% (w/v) 细菌琼脂 [ 22 ] 的试管中，温度为 4˚C。将真菌菌株保存在硅胶上，其中在3 mL奶粉（200 g·L -1蒸馏水）中制备孢子悬浮液。将大约 1 mL 这种悬浮液加入到装有 7 g 硅胶的试管中，搅拌，密封，并在 4°C 下储存。

2.2. 接种物

将储存在含有固体培养基 [ 22 ] 的试管中的真菌培养物悬浮在 8 mL 无菌蒸馏水中，然后将 1 mL 等份的孢子悬浮液（2.5 × 10 7分生孢子 mL -1）接种在 125 mL 锥形瓶中含有 25 mL 改良的 Khanna 培养基（1.00 g 麦麸；0.10 g 酵母提取物；0.03 g KH 2 PO 4；0.05 g Mg·SO 4 ·7H 2 O 和蒸馏水至 100 mL），初始pH 值为 8.5。样品在 30˚C 的静态条件下保存在细菌培养箱中四天 [ 23 ] [ 24]。在 Prismatec ®真空泵的帮助下，通过布氏漏斗过滤获得粗可溶性酶提取物，并储存在 4°C 以供以后固定。

2.3. 糖化法测定木聚糖分解活性

通过测量用作底物的 Sigma ®山毛榉木聚糖的酶水解形成的还原糖的量来确定活性[ 25]。将固定在藻酸盐球上的酶与 1000 µL 浓度为 1% (m/v) 的山毛榉木聚糖在 100 mM 磷酸钠缓冲液（pH 6.5）中在 60°C 的水浴中孵育 5 分钟。此后，取出 200 μL 等分试样并添加到 200 μL DNS 试剂中。在加入固定化酶提取物和底物后，立即取出一份混合物并加入到 200 μL DNS 试剂中。该样本代表零时间。随后，将试管煮沸5分钟，冷却后加入2mL蒸馏水。在 RayLeigh UV-2601 ®中在 540 nm 处进行读数分光光度计，针对零反应时间，其中底物的自发水解最小。使用 0.1 至 0.6 mg/mL 的木糖标准曲线对该系统进行标准化。酶活的单位对应于试验条件下每分钟形成的还原糖的微摩尔数，酶活以mU表示。

淀粉分解和纤维素分解活性也通过相同的方法测定，在 100 mM 醋酸钠缓冲液中使用 1% (w/v) 淀粉底物，淀粉酶的 pH 值为 5.0，在 100 mM 柠檬酸钠缓冲液中使用 2% (m/v) CMC 底物pH 4.8 和 1% (m/v) Avicel em 100 mM 100 mM 柠檬酸钠缓冲液 pH 4.8 用于纤维素酶。

2.4. 在藻酸盐球中固定富含木聚糖酶的鸡尾酒

2.4.1。氯化钙溶液中海藻酸盐球的形成过程

在机械搅拌下将含有 3% (m/v) Isofar ®海藻酸钠 (NaAlg) 和粗可溶性酶提取物的 10 mL 溶液滴入 20 mL 4% (m/v) 氯化钙水溶液中。在形成含有木聚糖分解混合物的固定球后，将珠子从氯化钙溶液中分离出来，使用 10 mM 磷酸钠缓冲液（pH 6.5）洗涤，并在 4°C 下储存。

2.4.2. 测试滴定仪形成固定球体

测试了不同的滴液和珠子形成仪器，这些是刻度容量移液器 (10 mL)、巴斯德塑料移液器、粗玻璃棒 (直径 1.0 cm) 和细玻璃棒 (直径 0.5 cm)。根据方法2.4.1形成球体并经受木聚糖酶的活性剂量。

2.4.3。通过析因计划确定海藻酸钠和氯化钙浓度对固定化过程的影响

通过具有两个自变量（DCCR 2）的中心旋转复合设计的实验设计，分析了海藻酸钠和氯化钙的浓度对固定球形成的影响， X 1：海藻酸钠的浓度，X 2：氯化钙浓度，总共11个测试，3个中心点和4个测试在距中心点的距离α处旋转分布（轴向点）。正交α值为1.41 [ 26 ] [ 27 ]。变量在其上 (+1) 和下 (-1) 水平上使用，中心点为X 1[Alg] = 2.5% 和X 2 [Cl] = 5.0%。使用 Protimiza Experimental Design ® 软件对活动获得的结果进行了分析（表 1）。

2.5. pH 和温度对酶活性的影响

使用具有两个自变量 (DCCR 2 ) 的中心旋转复合设计的实验计划对固定化木水解混合物进行生化表征，这些变量是反应介质的X 1 = pH 和X 2 = 温度 (˚C)，总共 11 次测试，3中心点和 4 个测试在距中心点 α 处旋转分布（轴向点）。中心pH值为6.5，间隔1.5，温度60℃，间隔20℃（表2）。

2.6. 温度稳定性

通过在 50°C、60°C 和 70°C 下在没有底物的情况下将它们孵育 1、5、7、14 和 24 小时来评估温度稳定性。取出样品，置于冰浴中，在理想的 pH 和温度条件下测定每个样品的酶活性。

设计师

X1

X2

X1= 海藻酸钠浓度（%）

X2= 氯化钙浓度 (%)

1

-1

-1

1.50

3.00

2

1

-1

3.50

3.00

3

-1

1

1.50

7.00

4

1

1

3.50

7.00

5

-1.41

0

1.09

5.00

6

+1.41

0

3.91

5.00

7

0

-1.41

2.50

2.17

8

0

+1.41

2.50

7.83

9

0

0

2.50

5.00

10

0

0

2.50

5.00

11

0

0

2.50

5.00

表 1。具有溶液浓度值的实验设计。

设计师

X1

X2

X1= 酸碱度

X2= T (°C)

1

-1

-1

5.0

40

2

1

-1

8.0

40

3

-1

1

5.0

80

4

1

1

8.0

80

5

-1.41

0

4.4

60

6

+1.41

0

8.6

60

7

0

-1.41

6.5

32

8

0

+1.41

6.5

88

9

0

0

6.5

60

10

0

0

6.5

60

11

0

0

6.5

60

表 2。具有pH值和温度值的实验设计。

2.7. 葡萄糖和木糖对富含木聚糖酶的固定化鸡尾酒活性的影响分析

在以山毛榉木聚糖为底物的反应过程中，在不同浓度的 5 和 10 mM D-木糖 Sigma-Aldrich ®和 D-葡萄糖 Isofar ®存在下激活或抑制活性。对照是不存在木糖或葡萄糖的反应。

2.8. 固定在藻酸盐球上的富含木聚糖酶的鸡尾酒的回收试验

确定了具有固定化混合物的藻酸盐球可以在酶促反应中重复使用的次数。反应后，过滤珠子，使用 10 mM 磷酸钠缓冲液（pH 6.5）洗涤，并在相同溶液中孵育一分钟，然后重新测量木聚糖分解活性。

2.9。4℃保存后木聚糖分解活性分析

为了验证酶的游离形式和固定形式的稳定性，两者都在 4°C 下储存长达 75 天，并测量了活性。

2.10。原甘蔗渣水解

甘蔗渣的水解是通过在 125 mL 锥形瓶中在 60˚C 下搅拌样品 24 小时实现的，其中使用：1) 可溶性酶，和 2) 固定在藻酸盐中的酶。第一个样品含有 0.2 g 粗甘蔗渣和 10 mL 100 mM 醋酸钠缓冲溶液，pH 5.5，和 10 mL 可溶性粗酶提取物。第二个反应包含 0.2 g 甘蔗渣、20 mL 100 mM 磷酸钠缓冲溶液，pH 6.5，加上 80 球藻酸盐和固定的富含木聚糖酶的混合物。

在甘蔗渣的酶水解之后，使用真空泵过滤固体部分，干燥并带到扫描电子显微镜（SEM）上。使用在 15 kV 下操作的 HITACHI TM3000 SEM（日本）评估样品的颗粒形态。将样品贴在直径为 2 厘米、高度为 1 厘米的短柱上的双面胶带上。

3. 结果与讨论

3.1。用于形成含有富含木聚糖酶的鸡尾酒的固定球体的滴灌仪的测定

使用直径为 1.0 厘米的粗玻璃棒是滴加含有木聚糖分解混合物和海藻酸钠的溶液以形成球体的最佳方法，这一因素由缀合物的木聚糖分解活性的较高产率决定，对应于 52.3%可溶性酶的活性。第二个最有效的方法是使用巴斯德塑料吸管，其产生的活性相当于可溶性酶的 8.8%。使用刻度玻璃移液管获得的活性是可溶性酶的 4.53%。细玻璃棒未用固定化衍生物进行验证。此外，使用粗玻璃棒形成的球体比使用其他设备获得的球体更均匀、更球形（图 1）。

从理论上讲，球形海藻酸钙颗粒的生产似乎很简单，但在实践中却是一个复杂的过程。对于要在尺寸、形状、表面形态和机械稳定性方面标准化的球体，必须分析干扰其形成的几个因素。我们可以提及用于滴注的设备、滴注的高度和速度、海藻酸盐和凝胶溶液的配方、制备和浓度、生产条件和生产后处理[ 23 ][ 24 ]。

挤压滴注是在液态空气系统中形成海藻酸钙球的最广泛应用和最简单的方法 [ 26 ] [ 27 ] [ 28 ]。在不违背作者认为挤出将是最广泛应用的方法的想法的情况下，在这项研究中，我们选择测试更简单的设备，例如粗玻璃棒、细玻璃棒、巴斯德吸管和刻度玻璃吸管。这些当然不适合大规模生产，但出于实验室研究的目的，球体形成的结果是令人满意的。此外，无需投资购置材料或设备。

图 1。用滴灌器械形成的固定球体。(A) 粗玻璃棒，(B) 刻度玻璃移液器，(C) 巴斯德塑料移液器，(D) 细玻璃棒。

3.2. 固定化富含木聚糖酶的鸡尾酒中海藻酸钠和氯化钙的浓度分析

通过改变含有可溶性木聚糖粗提取物的海藻酸钠溶液和氯化钙水溶液的浓度，获得了 222 mU 的活性（表 1），其中 NaAlg 为 2.50%，CaCl 2为 2.17%。另一方面，在 NaAlg 和 CaCl 2的浓度分别为 1.50% 和 7.00% 时获得了最低的活性，即 58 mU。

对固定的富含木聚糖酶的混合物的催化行为进行了统计分析。显着性和非显着性参数以及显着性水平见表3。

通过方程式 (1) 中表示的回归分析评估实验结果，方程式 (1) 评估木聚糖分解活性 (U/mL) 作为海藻酸钠 ( x 1 ) 和氯化钙 ( x 2 ) 浓度的函数。显着性和非显着性参数，以及显着性水平值如表 3所示。消除 p 值大于 0.05 的非显着参数是​​简化模型的有趣替代方法，因为它们对最终调整结果的影响很小或没有影响。因此，在分析表 3和帕累托图中 表示的结果时，X22, e X1-X2已从模型中删除，并在中央综合规划评估的区域内重新进行数学计算。

是1= 149.47 + 24.31X1- 18.25X21- 46.93X2(1)

为二次回归模型计算的 F 值为 65.3，即大于 95% 置信区间中的列表 F3.7 值 (4.35) ( F Calc > F tab )。从方差分析中去除了回归自由度和残差，并且根据 F 检验，该模型被认为具有统计学意义。此外，该模型具有良好的决定系数，R 2接近0.98%，表明实验结果与预测理论值接近。

姓名

系数

标准误差

T 计算

p 值

前

后

前

后

前

后

前

后

平均

142.16

149.47

5.64

4.69

25.20

31.88

0.0000

0.0000

X1

24.31

24.31

3.46

3.95

7.04

6.15

0.0009

0.0005

X12

−15.97

−18.25

4.11

4.49

-3.88

−4.07

0.0116

0.0048

X2

−46.93

−46.93

3.46

3.95

−13.58

-11.89

0.0000

0.0000

X22

7.76

-

4.11

-

1.89

-

0.1177

-

X1-X2

3.69

-

4.89

-

0.75

-

0.4844

-

表 3。木聚糖酶偶联物活性响应的回归系数。

软件 Protimiza。

NaAlg和CaCl 2浓度对固定化过程影响的响应面表明，NaAlg的最高活性在2%~4%范围内，最高活性值为3.14%，CaCl 2值为2.10 %（图 2）。

在非常低的 NaAlg 浓度下没有形成球体。此外，在其他因子设计中，溶液在非常高浓度的 NaAlg 下变得非常粘稠，这使得滴落变得困难。NaAlg 溶液的浓度变化范围为 1.00% 至 6.00%。CaCl 2溶液的浓度也干扰了球体的形成，因为在形成许多球体时溶液会饱和。

根据李等人的说法。[ 23 ]，高粘度海藻酸盐溶液不适合封装应用，因为在球体形成过程中存在困难。另一方面，在较低粘度下不会形成球形海藻酸钙颗粒，因为液滴在与胶凝溶液碰撞时会变形。当液滴进入胶凝溶液时，液滴内的粘性力会保持其球形，而周围溶液施加在液滴表面的阻力往往会阻碍颗粒的形成 [ 29]。具有较低粘度的藻酸盐溶液液滴在与氯化钙浴表面碰撞后抵抗阻力的能力较弱。

Sukri 和 Sakinah [ 30 ] 表明，在 0.3 M CaCl 2浓度下，NaAlg 浓度对酶活性和固定化产率的影响在 3.0% NaAlg 浓度时最大，当海藻酸盐浓度增加到 4.0% 和5.0%，这证实了该研究中发现的结果。与 Kumar等人观察到的值相似。[ 31 ]，固定解淀粉芽孢杆菌产生的木聚糖酶时，NaAlg的最佳浓度为3.0%，CaCl 2的最佳浓度为0.2 M。

Jampala 和合作者 [ 20 ] 对包括海藻酸钠和氯化钙浓度在内的多个变量进行了因子设计，得出的结论是，海藻酸钠的所有轮廓相对于其他变量略有倾斜，表明 NaAlg 具有更显着的影响比氯化钙浓度、固化时间和珠粒大小。发现的值为 NaAlg 的 2.13% 和 CaCl 2的 2.14% 。

海藻酸钠的浓度会影响球体的孔隙率，因此会影响固定化率 [ 15 ] [ 32 ]，NaAlg 浓度低于 3% 时会形成更脆弱的水凝胶球体，从而导致固定化率较低。易碎的球体同样导致较少的酶在珠子的多孔结构中截留和较大的孔径，这会导致酶的损失，尤其是在珠子的洗涤过程中。相比之下，Rajagopalan 及其同事 [ 33] 说，较高浓度的 NaAlg 会导致形成更致密的基质，从而使富含木聚糖酶的混合物的捕获更有效。另一方面，更密集的基质也意味着更小的孔，这可能意味着基质扩散到基质中的显着减少。

图 2。NaAlg和CaCl 2浓度对固定化过程影响的响应面

Voo 和合作者 [ 34 ]分析了氯化钙浓度的影响。据作者介绍，在低 CaCl 2浓度下，藻酸盐聚合物的扩散比 Ca 2+离子快。因此，藻酸盐聚合物扩散到交联液滴的表面，但藻酸盐聚合物在颗粒中的分布不均匀。另一方面，在高CaCl 2浓度下，Ca 2+离子的扩散比藻酸盐聚合物快。因此，藻酸盐聚合物向表面的扩散受到限制，形成了更均匀的凝胶结构。Garai 和 Kumar [ 35] 在 3.00% 的藻酸盐浓度下观察到最大的木聚糖酶活性，当氯化物浓度降低到 2.00% 时活性没有显着变化。

Kumar 及其同事 [ 36 ] 研究了不同浓度 (0.05 - 0.5 M) 的 CaCl 2用于固定解淀粉芽孢杆菌SK-3产生的纯化木聚糖酶，结果表明 0.2 M CaCl 2产生了最大的固定。作者指出，进一步增加 CaCl 2浓度会导致固定产率下降。Segale 和合作者 [ 26 ] 还观察到球体的大小随着 CaCl 2浓度的增加而减小。

3.3. 温度和 pH 值对固定在藻酸盐球中的衍生物活性的影响

使用中心旋转复合设计 (DCCR 2 ) 来确定自变量的 pH 值和温度对固定在藻酸盐球上的富含木聚糖酶的酶混合物的活性的影响。在中心点（pH = 6.5 和 T = 60˚C）的实验中观察到较高的酶活性值，在实验 4 中观察到固定化衍生物的较低活性，在 pH 8.0 和温度为 80˚C （图 3）。

两个因变量都以二次形式影响活性，并且在中央复合计划评估的区域内，最能代表酶活性作为温度和 pH 值函数的行为的数学模型在等式 (2) 中表示回归值和帕累托图。通过ANOVA方差分析，F值=14.9高于表中值（4.46），表明模型具有统计学意义。

是1= 203.26 - 56.22X21- 102.39X22(2)

每种酶都有一个温度限制，超过该温度限制会逐渐观察到蛋白质加热变性。活动水平最高的温度通常被称为最佳温度 [ 37 ]。

Bibi 和合作者 [ 15 ] 观察到，海藻酸盐球中游离和固定化内切-β -1,4-木聚糖酶的最大催化理想温度没有变化。其值为 50°C。Pal 和 Khanum [ 19 ] 记录了黑曲霉DFR -5产生的木聚糖酶的最佳温度为 40°C 和 45°C ，它们分别可溶于和共价固定在与戊二醛的藻酸盐中。理想温度的升高可能是通过共价键固定后酶刚性提高的结果。在其他研究中也观察到了这种行为，但置换程度因基质而异，也因酶与基质之间相互作用的类型而异。38 ] [ 39 ]。

图 3。pH 和温度对固定在藻酸盐球中的衍生物活性影响的响应面。

对丝状真菌的研究已经描述了在 40°C 和 60°C [ 40 ]附近木聚糖分解活性的最佳温度。一些商业木聚糖酶，如 Sumizyme、Multifect XL、Pulpzyme 和 Cartazyme，也是由真菌产生的，在此温度范围内表现出优异的活性 [ 37 ]。比较本研究中获得的结果，60°C 的温度在商业酶文献中获得的值的上限范围内。

Pal 和 Khanum [ 19 ] 发现用戊二醛激活的藻酸盐球中游离和固定化木聚糖酶的最佳 pH 值分别为 5.0 和 5.5。根据 Ortega等人的说法，固定化酶的最佳 pH 值 0.5 pH 单位的变化可能是支持环境变化的结果，这进一步影响了蛋白质-支持物的相互作用和活性。[ 41 ]。由于载体材料与酶的带电氨基酸的相互作用，在固定化过程中观察到对酶的最适pH的影响。

3.4. 温度对固定在海藻酸盐球上的木聚糖分解酶稳定性的影响

当在 50°C 下孵育可溶性和固定化酶提取物时，可溶性酶在第一个小时内保持其活性的 80%，到第三个小时保持 60%，在接近第五个小时时降低到初始活性的 20%。这种活动几乎贯穿整个实验，直到孵化 24 小时。固定在藻酸盐球体中的酶在孵育的第一小时内降低到初始活性的 60%，在孵育 7 小时后达到接近 10% 的值。该值在 24 小时内保持不变。通常，富含木聚糖酶的可溶性和固定化混合物在此温度下具有相对相似的行为（图 4（A））。

在 60˚C 测试两种系统的稳定性时，可溶性酶的残留活性在孵育 5 小时后几乎消失，而固定化酶保留了初始活性的 70%，在 14 小时后呈现出接近 40% 的相对活性值孵育时间和 24 小时内的小幅下降（图 4 (B)）。

溶液中的酶在 70˚C 孵育 10 次后表现相似。然而，固定化酶在前五个小时内保留了约 50% 的活性。可溶性酶活性的降低更加突出，在此期间结束时没有观察到明显的活性（图4（C））。

酶在较高温度下的稳定性仍然是不同行业更有效地重复使用催化剂的重要要求。酶稳定性是指酶在操作和储存过程中保持一定的催化空间结构的能力[ 42 ]。

综合研究表明，影响酶稳定性的机制因多种相互作用而复杂化，包括疏水键、氢键、离子键、蛋白质表面电荷、二硫键和金属

图 4。温度对固定在藻酸盐球上的木聚糖分解酶稳定性的影响。(A) 50°C，(B) 60°C，(C) 70°C。

离子。这些相互作用是由酶的氨基酸组成和其他几个因素共同作用的结果。由于酶的稳定性受多种因素影响，因此没有统一的规则来指导其改进策略 [ 43 ]。改善的热稳定性可归因于基质的性质和类型，这可以防止构象变化，进而稳定酶在不同温度下的活性 [ 36 ]。

陈等人。[ 43 ]观察到固定在用戊二醛活化的壳聚糖中的木聚糖酶在50℃和55℃的温度下比游离酶具有更大的残留活性。Milessi等人获得了相同的结果。[ 44 ] 当他们固定来自枯草芽孢杆菌的重组木聚糖内切酶时。

詹帕拉等人。[ 20 ] 表明，固定在海藻酸盐中的木聚糖酶活性在 50°C 和 90°C 之间降低可能是由于酶的构象变化。令人惊讶的是，与其他测试的基质相比，作者能够在极端温度下保持 75% 的活性，这表明木聚糖酶在藻酸盐基质中具有高活性和稳定性。

库马尔等人。[ 36 ] 观察到由解淀粉芽孢杆菌SK-3产生的木聚糖酶在高温下的相对活性逐渐下降，无论是在其可溶形式还是固定在藻酸盐球体中。然而，观察到固定化木聚糖酶能够比游离酶在相对较长的时间内承受宽范围的温度。据作者介绍，固定化酶的温度稳定性提高可能是通过共价键固定化后酶的刚性提高的结果。

研究了来自嗜热脂肪地芽孢杆菌KIBGE-IB29的游离和固定化内切-β -1,4-木聚糖酶的热稳定性。游离酶在 40°C 下更稳定，而固定化偶联物在 50°C 和 60°C 下观察到更好的结果。在 70˚C 和 80˚C 的温度下，两种形式的活性都会丧失 [ 15 ]。

3.5. 葡萄糖和木糖对固定在藻酸盐球上的富含木聚糖酶的鸡尾酒活性的影响

对于 5 mM 木糖的浓度，富含木聚糖酶的固定化混合物的活性被激活了 23%，而对于 0.5 mM 葡萄糖，没有观察到活性的变化。在所有其他情况下，酶催化的抑制发生，最突出的值是 10 mM 木糖，这将参考活性降低了 50%，也就是说，没有向酶介质中添加单糖（图 5）。

在木聚糖和纤维素等木质纤维素材料水解的情况下，形成的单体是木糖和葡萄糖，它们是本研究的目标。根据 Amani等人的说法。[ 45 ]，在容易代谢的底物存在的情况下，某些酶的活性降低称为分解代谢抑制。作者报告说，添加葡萄糖抑制了短小芽孢杆菌木聚糖酶的活性。抑制程度取决于反应中使用的浓度。

图 5。葡萄糖和木糖对固定在藻酸盐球上的富含木聚糖酶的混合物活性的影响。

3.6. 回收富含木聚糖酶的固定化鸡尾酒

当回收的固定化衍生物用于水解木聚糖时，第一次循环后活性相对于初始活性下降了40%。六个周期后，活性下降到 10%（图 6）。

库马尔等人。[ 36 ] 获得了 50% 的固定球体的活性保留长达五个周期；活动在额外的周期中减少。包埋酶的活性丧失可能是由于在每个循环结束时清洗球体导致酶从海藻酸钙球体中泄漏或重复使用导致的构象变化[ 46 ]。

通过将木聚糖酶固定在改性的超顺磁性氧化石墨烯纳米复合材料中，在八次循环后获得了 40% 的剩余活性，以获得最佳系统条件。作者观察到在所研究的所有条件下，在第二个循环中酶活性急剧下降，这可能与酶的浸出有关。浸出是由于重复使用导致固定化成分（酶和载体）之间缺乏结合力。此外，底物与固定化酶的活性位点不断接触会导致扭曲并导致活性丧失 [ 47 ]。

布山等人。[ 27 ] 对固定在藻酸盐球体和用戊二醛活化的藻酸盐球体中的木聚糖酶进行了研究。他们观察到最多四个周期没有明显的活动损失，但随后活动开始减少到十二个周期。基于木聚糖酶活性，Rajagopalan等人。[ 33 ] 估计，固定在球体上的木聚糖酶活性的 65% 以上在三个反应循环后被浸出。为了减少木聚糖酶的浸出并提高海藻酸盐珠的刚性，可以测试硅胶、壳聚糖和果胶等添加剂。

图 6。回收富含木聚糖酶的固定化 cochtail。

3.7. 存储测试

在 4℃ 储存 75 天后测定可溶性和固定化木聚糖酶的活性，可溶性木聚糖酶的活性约为初始活性的 80%，而固定在海藻酸盐中的提取物的活性增加了 50%（图 7） .

根据 Jampala等人的说法。[ 20 ]，木聚糖酶在储存过程中活性下降的主要原因可能是由于活性木聚糖酶位点的构象变化。在他们的研究中，超过 70% 的残留活性在储存 90 天后得以保留。因此，木聚糖酶在 NaAlg 球体中的包封显着防止了酶的变性并保持了活性。纳杰法巴迪等人。[ 47 ] 储存可溶性和固定化酶，90 天后保留 35% 的固定化木聚糖酶和 20% 的可溶性木聚糖酶活性。

3.8. 用富含木聚糖酶并固定在藻酸盐球体中的可溶性混合物水解甘蔗渣

固定在藻酸盐球中的富含木聚糖酶的混合物对天然甘蔗渣的水解产生了更大量的还原糖。此外，在孵化的前 8 小时内，甘蔗渣的降解更加突出（图 8）。在酶水解之后，由固定化混合物催化的反应产生的甘蔗渣比与可溶性提取物接触的甘蔗渣具有更浅的颜色。这一事实表明在纸浆和造纸工业的漂白过程中可能有应用。

最后，对新鲜甘蔗渣进行显微镜分析，用可溶性混合物处理并固定在藻酸盐球中，以验证甘蔗纤维的状态。照片来自扫描电子显微镜。甘蔗纤维在天然甘蔗渣中几乎完好无损（图 9（A）），而用酶提取物或藻酸盐球处理的残渣中的纤维不太均匀，即更广泛地降解（图 9（B）和图 9 (C))。由丝状真菌镰刀菌产生的木聚糖混合物。固定在藻酸盐球中的 EA 1.3.1 具有水解木质纤维素材料的潜力，无需预处理，形成可发酵产生第二代乙醇的糖。

图 7。在 4°C 下储存后，测定藻酸盐球中可溶性和固定化木聚糖分解活性。

图 8。通过富含木聚糖酶并固定在藻酸盐球中的可溶性混合物水解甘蔗渣。

图 9。扫描电子显微镜中的甘蔗渣图像。(A) 在自然界中，(B) 用可溶性酶水解后，(C) 用固定化酶水解后。

4。结论

固定由真菌镰刀菌产生的富含木聚糖酶的混合物的可能性。EA 1.3.1 在海藻酸盐球中以一种简单且廉价的方式，使用粗玻璃棒，分别具有 3.14% 和 2.10% 浓度的海藻酸钠和氯化钙，进行了演示。从因子设计中获得的固定化木聚糖酶的酶促反应的最佳温度和 pH 值分别为 65°C 和 6.5°C。结果表明，固定在藻酸盐球中的木聚糖酶在 60˚C 时比可溶性酶更稳定，并且木糖和葡萄糖在浓度高于 5 mM 时会抑制固定木聚糖酶的酶活性。固定化球最多可重复使用六次，在 4°C 下储存 75 天后固定化酶的活性增加，而可溶性酶保持其初始活性。事实上，测试的酶在温度和 pH 值下保持其稳定性，接近实际工业过程中使用的那些（50˚C 至 65˚C；5.5 pH 至 6.5 pH），此外在其重复使用中的增益不会发生在当前方法中，由于酶在溶液中是游离的，因此从工业角度来看是具有表现力的和有利的结果。当在天然甘蔗渣中进行酶水解时，当甘蔗渣在固定化偶联物存在下反应时，获得了更大量的还原糖，表明使用所提出的固定化方法及其在第二代乙醇中的应用可能获得催化收益制造过程。由于酶在溶液中是游离的，因此在目前的方法中不会发生这种情况，从工业的角度来看，这是有表现力的和有利的结果。当在天然甘蔗渣中进行酶水解时，当甘蔗渣在固定化偶联物存在下反应时，获得了更大量的还原糖，表明使用所提出的固定化方法及其在第二代乙醇中的应用可能获得催化收益制造过程。由于酶在溶液中是游离的，因此在目前的方法中不会发生这种情况，从工业的角度来看，这是有表现力的和有利的结果。当在天然甘蔗渣中进行酶水解时，当甘蔗渣在固定化偶联物存在下反应时，获得了更大量的还原糖，表明使用所提出的固定化方法及其在第二代乙醇中的应用可能获得催化收益制造过程。

致谢

这项研究的部分资金来自 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Finance Code 001。作者感谢 FAPEMIG (CEX-112-10)、SECTES/MG 和 RQ-赞助的 LMMA 的支持。 MG（FAPEMIG：CEX-RED-00010-14）。

利益冲突

作者声明与本文的发表没有利益冲突。

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