改良绿茶多酚EGCG-硬脂酸酯对单纯疱疹病毒1的抑制作用

摘要：没食子酸酯 (EGCG) 是一种绿茶多酚，具有抗氧化、抗菌、抗癌和抗病毒特性。EGCG-硬脂酸酯 (EGCG-S)因其稳定性和亲脂性而受到本研究的关注。EGCG-S的化学修饰增加了它的脂溶性。单纯疱疹病毒 1 (HSV-1)，疱疹病毒科和Alphaherpesvirinae家族的成员 亚科是美国人类病毒性疾病的主要原因。在本研究中，使用 25 μM、50 μM、75 μM 和 100 μM 的 EGCG 和 EGCG-S 进行细胞毒性、细胞活力和细胞增殖测定，以确定培养的 A549 细胞的最大非细胞毒性浓度。结果表明，75 μM EGCG 和 EGCG-S 是进一步研究 HSV-1 感染 A549 细胞的合适浓度。进行感染性、抗病毒性和倒置显微镜检测以研究 EGCG 和 EGCG-S 对 HSV-1 感染的影响。使用发光进行抗病毒测定，它表明EGCG-S处理的HSV-1显示出高达90％的抑制。共聚焦显微镜图像进一步支持了 75 μM EGCG-S 对 A549 细胞中 HSV-1 感染的抑制作用。

关键词

HSV-1 , EGCG-硬脂酸酯, EGCG ,抗病毒, A549 细胞

一、简介

单纯疱疹病毒-1 (HSV-1) 是疱疹病毒科和阿尔法疱疹病毒亚科的成员。疱疹病毒是双链和包膜 DNA 病毒，可在人类和其他动物中引起广泛的疾病 [ 1 ] [ 2 ]。HSV-1 的 152-kb 线性基因组编码约 80 个基因；HSV-1 感染的症状包括口腔和生殖器唇疱疹、眼疮和脑炎 [ 2 ]。HSV-1 影响美国社会经济地位较低的人群中约 70% - 80% 的个体和社会经济地位较高的人群中约 40% - 63% 的个体 [ 3 ] [ 4]。HSV-1 经历裂解和溶原感染周期。HSV-1 的感染周期始于体内上皮细胞（通常是口腔）和体外易感培养细胞的快速溶解感染。HSV-1 也是嗜神经性的，感染通过逆行轴突运输进入附近的神经元，最终导致宿主感觉神经元的终生潜伏期 [ 5 ] [ 6 ] [ 7 ] [ 8 ] [ 9 ]。由于病毒会发生溶原性感染，因此个体的免疫系统永远无法完全清除病毒。因此，复发性病毒感染始终是 HSV 感染者的威胁。

表没食子儿茶素-3-没食子酸酯 (EGCG) 是一种绿茶多酚，是从茶树植物的叶子中提取的主要儿茶素。EGCG 先前已被证明对几种病毒具有抗病毒特性，包括 HIV、乙型肝炎、丙型肝炎、流感、腺病毒和寨卡病毒 [ 10 ] - [ 23 ]。EGCG 已显示在病毒吸附之前抑制 Vero 细胞中的 HSV-1 [ 24 ]。然而，EGCG 在化学上不稳定且对生物转化反应敏感 [ 25 ] [ 26 ]。亲脂化的 EGCG 表现出比 EGCG 更大的抗氧化潜力。此外，酯化提高了 EGCG [ 27 ] [ 28 ] 的稳定性]。棕榈酸酯 EGCG 被发现是猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV) 的有效抑制剂 [ 29 ]。发现脂肪酸修饰的棕榈酰-EGCG (pEGCG) 可抑制 HSV-1 病毒粒子吸附到 Vero 细胞 [ 30 ]。EGCG 的结构通过酯化改性，产生含有硬脂酸的亲脂化 EGCG-酰基酯衍生物，也称为 EGCG-硬脂酸酯 (EGCG-S)。由于溶解度增强，EGCG-S 是一种更有效的形式，可用于药物制剂 [ 31 ] [ 32 ]]。这种形式的 EGCG 可以降低临床应用中常规 EGCG 对代谢变化的敏感性。EGCG-S 是一种更稳定的脂溶性 EGCG 衍生物，用于研究 EGCG-S 对培养的 A549 细胞中 HSV-1 感染的影响。本研究的目的是评估 EGCG-S 提供一种新的治疗方法来抑制 HSV-1 感染的潜力。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

使用补充有 10% 胎牛血清 (FBS) 和 1 µg/mL 庆大霉素的 F12-K 培养基在 T25 烧瓶中培养 A549 人上皮细胞 [美国典型培养物保藏中心 (ATCC)，马纳萨斯，弗吉尼亚州，美国]。胰蛋白酶 EDTA (0.25%) 用于继代培养细胞。将细胞保持在 37˚C 和 5% CO 2下。

2.2. HSV-1 GFP

HSV-1 重组菌株 GHSV-UL46 包含与外皮蛋白 pUL46 融合的绿色荧光蛋白 (GFP) 序列，用于所有实验 [ 33 ] (ATCC, Manassas, VA, USA)。病毒在 T25 烧瓶中传代，使 A549 细胞达到完全致细胞病变效应 (CPE)。然后收集含有病毒的病毒培养基，离心，上清液储存在-80˚C。

2.3. 绿茶多酚的制备

EGCG (>90%) 购自 Pulimeidi Biotechnology Co., Ltd. (Hangzhou, China) 和 EGCG-S (美国专利 20120172423) 由 Camellix, LLC, Augusta, GA 修改并购自于二甲基亚砜 (DMSO)和乙醇制备初始 5 mM 储备浓度。然后将 EGCG 和 EGCG-S 在 F12-K 培养基中稀释至所需浓度 12.5、25、50、75 和 100 µM。

2.4. 细胞形态的改变

将 A549 细胞接种在 6 孔板中，培养 24 小时并用不同浓度（25、50 和 75 µM）的 EGCG 和 EGCG-S 处理。1小时后，通过抽吸除去EGCG和EGCG-S，并用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。然后将培养基添加到孔中，将细胞在 37°、5% CO 2下孵育，并在处理后的三天内每 24 小时观察一次。使用倒置显微镜以 400 倍放大率检查细胞以观察细胞的形态变化。

2.5. 细胞活力

将 A549 细胞接种在 6 孔板中，并用适当浓度的 EGCG 和 EGCG-S 处理 1 小时。然后使用台盼蓝和血细胞计数器对活细胞进行染色和计数。1 小时后，吸出 EGCG 和 EGCG-S，并用 PBS 洗涤细胞。然后将 F12K 培养基置于每个孔中，并将细胞培养 24 小时。细胞，包括乙醇 (ETOH) 和 DMSO 的对照，被胰蛋白酶消化并收获。然后用台盼蓝对细胞进行染色，台盼蓝将死细胞染成蓝色，而活细胞未染色，并使用血细胞计数器计数。细胞活力由不同处理下活细胞与对照水平的比例确定，并显示为相对细胞活力，对照为 100% 有活力。

细胞活力 (%) = 总活细胞（未染色）/总细胞（染色和未染色）× 100

2.6. 细胞增殖

A549 细胞悬液 (100 µL) 分别接种在 96 孔板的不同孔中，24 小时后，用适当浓度的 EGCG 和 EGCG-S 处理细胞一小时，然后吸出（如第 2.5 节所述）。24 小时后，向样品中加入 10 µL WST-1 试剂（Roche Diagnostics，Indianapolis，IN，USA）；将板轻轻摇动，然后在 37˚C 和 5% CO 2下孵育30 分钟。在 96 孔板读数器中在 450 nm 处测量板的每个孔的吸光度水平。该测定一式三份进行。

2.7. 使用发光的抗病毒检测

将 A549 细胞接种在 96 孔板中，24 小时后，用 100 µL EGCG-S（最终浓度为 25、50、75 和 100 µM）处理 100 µL 病毒 1 小时。处理后，用处理过的和未经处理的病毒感染细胞，并在 37˚C 和 5% CO 2下孵育一小时。吸出任何未吸收的病毒并用 100 µL F12-K 培养基代替。72 小时后，将 10 µL ToxGlo 试剂（Promega，Madison，WI，USA）添加到所有含有样品的孔中（对照包括 100 µL 10% FBS-F12-K 培养基，含和不含 ToxGlo 试剂），然后在37˚ 和 5% CO 2 15 分钟。然后通过光度计读取板并记录每个孔的相对光单位 (RLU) 值。该测定一式三份进行。

计算抑制百分比的公式如下所示：

% 抑制 = [(细胞 + 处理的 HSV1) - (细胞 + HSV1)]/[仅细胞 - (细胞 + HSV1)]

2.8. 倒置显微观察

将 A549 细胞接种在 6 孔板中，并用 200 µL 经处理或未经处理的 HSV-1 的各种稀释液感染一小时，在 37˚C 和 5% CO 2下间歇摇动。一小时后，吸出未吸收的病毒，向每个孔中加入 2.5 mL 培养基，并在 37˚C 和 5% CO 2下孵育。在感染后第 3 天观察到形态变化。

2.9。共聚焦显微镜

A549 细胞在 12 孔板内的玻璃盖玻片上生长，并用经处理或未经处理的病毒感染一小时。感染后 12 小时，细胞在 37°C 黑暗中用 300 µL 300 nM DAPI (4,6-二脒基-2-苯基吲哚) 染料染色 5 分钟。然后将细胞用聚乙二醇溶液在 20°C 下固定 15 分钟。然后使用一滴透明指甲油将含有细胞的玻璃盖玻片粘在载玻片上。然后在 Vassar College (Poughkeepsie, NY) 在 Leica SP5 扫描共聚焦显微镜下在 10× 或 63×/1.4 NA water Plan Apo 物镜下观察细胞并进行检查。

3. 结果

3.1。细胞形态的改变

为了研究 ECGC 和 EGCG-S 对 A549 人上皮细胞的影响，使用了不同浓度（25、50 和 75 µM）的 EGCG 和 EGCG-S。如图1所示，在处理后24、48和72小时观察形态。没有观察到溶解在乙醇或 DMSO 中的影响；因此，研究继续使用 DMSO 作为溶剂。由于多酚溶解在 DMSO 中（溶液中含有 < 2% DMSO 的介质），因此还研究了 DMSO 的效果。结果表明，这些浓度（分别为 0.5%、1% 和 1.5%）的 DMSO 对细胞形态没有影响；DMSO 处理的细胞与对照细胞没有区别（图 1 (a) 和图 1(b))。细胞形态学研究的改变表明，EGCG 和 EGCG-S 的测试浓度对 A549 细胞没有毒性。EGCG 和 EGCG-S 的 25 μM、50 μM 和 75 μM 浓度在生长的 A549 细胞中没有表现出任何形态学变化和细胞病变效应（图 1 (c)）。这些结果表明，细胞可以耐受浓度高达 75 µM 的 EGCG 和 EGCG-S。

3.2. 细胞活力和增殖测定

使用台盼蓝测定法测定细胞活力。用台盼蓝处理后，使用血细胞计数器对细胞进行计数。如材料和方法中解释的那样计算生存力的百分比 (%)。结果如图2所示。表明 ETOH 和 DMSO 对

(a)(b)(c)

图 1。细胞形态的显微镜观察 (200x) 表明不同条件下细胞的细胞毒性 (a) 对照，仅 A549 细胞；(b) 用 DMSO 处理的 A549 细胞；(c) 细胞在不同浓度的 EGCG 和 EGCG-S（25、50 和 75 µM）中 24、48 和 72 小时。

图 2。用浓度为 25、50 和 75 µM 的 EGCG 或 EGCG-S 处理的对照和 A549 细胞的细胞活力测定。

与对照相比，细胞活力分别为 98% 和 100%。对于 EGCG，存活率的百分比范围为 89% 至 95%；对于 EGCG-S，存活率的百分比范围为 83% 至 87%。使用WST-1进行细胞增殖测定以分析细胞的增殖活性。结果如图3所示. 数据表明 25、50 和 75 µM 的 EGCG 和 EGCG-S 浓度不影响细胞增殖。这些浓度可用于治疗 HSV-1 病毒粒子并且不会影响细胞。细胞活力测定表明，随着 EGCG 和 EGCG-S 浓度的增加，活细胞的数量略有减少。然而，EGCG 和 EGCG-S 对 A549 细胞没有任何影响，细胞增殖试验证实 EGCG 和 EGCG-S 在测试浓度下不影响 A549 细胞的生长。

3.3. 抗病毒检测

ToxGlo 抗病毒测定用于测量感染细胞中响应 EGCG-S 处理病毒的细胞活力。计算出的抑制百分比在 EGCG-S 最高浓度下约为 80%，而最大病毒抑制发生在 75 µM (>90%) 浓度下（图 4）。使用发光的抗病毒测定表明 EGCG-S 治疗可抑制 HSV-1 高达 90%。

计算抑制百分比的公式在材料和方法的第 2.7 节中给出。

3.4. 倒置显微观察

将 A549 细胞铺板在 6 孔板中，并用处理过的和未处理过的 HSV-1 感染一小时。一小时后，吸出未吸收的病毒并添加培养基。在感染后三天评估形态变化。结果如图5所示。未感染的细胞表现出典型的扁平、细长的上皮细胞形态特征（图5（a））。感染 HSV-1 的细胞表现出细胞病变效应的特性；细胞是圆形的并从单层提升（图5（b））。

图 3。A549 细胞和用 25、50 和 75 µM EGCG 或 EGCG-S 处理的细胞的细胞增殖测定。

图 4。在不同浓度的 EGCG-S 存在下使用 ToxGlo 试剂进行抗病毒测定。

(a)(b)(c)

图 5。倒置显微镜观察 (200×) (a) A549 细胞；(b) A549 细胞感染 HSV-1 C. A549 细胞感染 75 µM EGCG-S 处理的 HSV-1。红色箭头表示细胞的四舍五入，黄色箭头表示附着在孔表面的细胞单层。

用 75 µM EGCG-S 处理的 HSV-1 感染细胞显示出与未经处理的对照细胞非常相似的细胞形态 (c)。该研究表明，75 µM EGCG-S 能够抑制培养的 A549 细胞中的 HSV-1 感染，因此细胞的形态与未感染对照的形态相似。

3.5. 共聚焦显微镜

本研究中使用的 HSV-1 包含与被膜蛋白 UL-46 [ 33 ]序列融合的 GFP 序列。GFP 表达表明 HSV-1 复制周期的后期。DAPI染色用于确定细胞核的形态和数量。图 6 (a) 显示未感染的 A549 细胞。图 6 (b)

(a)(b)(c)

图 6。(a) 未感染的 A549 细胞的共聚焦显微图像 (400x)；(b) A549 细胞中未处理的 HSV-1 感染后 12 小时观察的共焦显微图像；(c) 75 μM EGCG-S 处理的 HSV-1 在 A549 细胞中感染后 12 小时观察的共焦显微图像。

表明广泛的 HSV-1 感染。然而，当 HSV-1 用 75 µM EGCG-S 处理时，GFP 表达最少，如图 6 (c) 所示。共聚焦显微镜研究表明，HSV-1 的 75 μM EGCG-S 处理导致 GFP 表达急剧降低，因此在感染后 12 小时观察到 HSV-1 的抑制。

4。讨论

需要开发治疗疱疹病毒感染的方法。已经研究了几种天然化合物作为潜在疗法。这些天然产物包括桉树提取物 [ 34 ]、多糖和甘油二酯 [ 35 ]、姜黄素 [ 36 ] 和茶中的多酚 [ 24 ] [ 30 ] [ 37 ] [ 38 ]。茶是全球消费最广泛的饮料之一。富含儿茶素的茶具有抗氧化特性。然而，儿茶素，如 EGCG，被迅速代谢 [ 39]。EGCG 作为治疗剂的应用受到限制，因为 EGCG 具有化学不稳定性和发生生物转化的趋势 [ 25 ] [ 26 ]。稳定性受 pH、温度和离子强度的影响 [ 40 ]。然而，亲脂化可以提高 EGCG [ 27 ] [ 31 ] [ 32 ] 的稳定性，从而提高生物利用度。亲脂化增加了 EGCG 在脂质中的溶解度。

单纯疱疹病毒感染继续影响全世界大部分人口。HSV-1感染无法治愈，仍然需要确定有效且负担得起的疗法以降低发病率。目前治疗疱疹感染的方法是阿昔洛韦及其衍生物。阿昔洛韦对于口服和局部应用是稳定的；然而，据报道，由于病毒胸苷激酶或聚合酶发生突变，HSV 对核苷类似物产生抗性 [ 41 ]。本研究测试了 EGCG 的亲脂性修饰形式 EGCG-S 抑制 HSV-1 在培养细胞中感染的效果。

我们的结果表明，EGCG 和 EGCG-S 可以安全地应用于培养的 A549 细胞，浓度高达 75 µM。视觉和定量测量抑制。EGCG-S 抑制 HSV-1 感染的能力通过多种检测方法测量，包括 WST-1 细胞增殖检测、ToxGlo 抗病毒检测、倒置显微镜和共聚焦显微镜。这些测定的结果证明了用EGCG-S处理HSV-1病毒粒子的抑制作用。据报道，EGCG 直接与 HSV 病毒体相互作用以抑制附着 [ 24 ] [ 42 ]。亲脂性 p-EGCG 可抑制 HSV 病毒粒子对培养细胞的吸附 [ 30]。EGCG-S 很可能也以这种方式起作用，因为我们的结果表明用 EGCG-S 治疗病毒粒子会抑制疱疹感染。我们的结果报告了 75 µM EGCG-S 浓度在 80% 和 90% 之间的抑制作用。EGCG-S 与阿昔洛韦协同作用可能是 HSV 感染的有效抗病毒治疗。

5. 结论

EGCG-S是EGCG的一种更稳定的脂溶性衍生物，不影响细胞形态；没有细胞毒性；并能抑制培养细胞中HSV-1的感染。EGCG-S 有望用作局部治疗以限制 HSV-1 感染的传播。

致谢

这项研究部分由蒙特克莱尔州立大学的科学荣誉创新计划 (SHIP) 和教师奖学金计划资助。

作者的贡献

SDA 和 LHL 设计了这项研究。SDA 在实验室监督 SP。SP、SDA 和 LHL 起草了手稿。SP进行了所有实验。所有作者阅读并认可的终稿。

利益冲突

作者声明与本文的发表没有利益冲突。

参考

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