刚果共和国南布拉柴维尔一些豆科植物结瘤的本地根瘤菌菌株的分离和特性

摘要：实际上，在刚果共和国，根瘤菌的表型和生化特征都很差。本研究旨在表征本地根瘤菌。使用在Milletia laurentii、Acacia spp .、Albizia lebbeck和Vigna unguiculata上收集的根瘤根分离根瘤菌菌株 . 使用 16S rRNA 方法对分离的菌株进行微生物学、生化学、生理学和分子学鉴定。本研究报告的结果仅适用于所有 77 种分离株中的 6 株：RhA1、RhAc4、RhAc15、RhAc13、RhW1 和 RhV3。所有天然菌株对脲酶活性呈阳性，对纤维素酶和果胶酶活性呈阴性，除了一个分离株显示出阳性纤维素酶活性。此外，分离株在 12% 的 NaCl 下生长。在温度的不同影响下，分离物能够生长到 44 °C，并在 7 到 9 的 pH 值下表现出良好的生长，并且能够使用十种不同的碳水合物来源。菌株被鉴定为热带根瘤菌、根瘤菌、中生根瘤菌。圆明慢生根瘤菌和埃氏慢生根瘤菌。使用聚类方法对 16S rRNA 基因进行系统发育分析，使我们能够在具有相似模式的基因中拥有既古老又稳定的四个进化枝的历史。扩大我们对新豆科植物根瘤菌的认识将是一种宝贵的资源，可用于采用替代固氮方法来巩固豆科植物的生长。这些细菌可用于刚果农业以提高作物产量。

关键词

根瘤菌，鸡血藤，金合欢属。,合欢,豇豆, 16S rRNA 测序

一、简介

氮是植物组织和生长的重要组成部分。该成分可由工业或生物来源提供。氮肥是蔬菜生长的主要氮源，是工业生产的[ 1 ]。另一方面，植物可以通过矿物质营养或通过根瘤菌和豆科植物共生的固氮来获取氮。根瘤菌和豆科植物之间的合作已经在相互固氮共生的背景下得到了很好的研究[ 2 ][ 3 ]。共生氮 (N 2 ) 的固定在增加植物生物量方面起着重要作用 [ 4 ) 的固定。全球日益需要提高粮食生产以满足快速增长的人口的需求 [ 5 ]。由于成本高以及对全球变暖、环境污染和安全问题的担忧，通过大量投入化学氮、磷肥和杀虫剂来提高农业产量的传统方法是不可持续的。在这种情况下，利用天然土壤微生物来增加粮食作物的产量是一种生态、成本效益和可持续的替代工具，可以替代化肥和农药的使用 [ 6 ]。几位作者声称，豆科作物通常与根瘤菌有关，通过固定大气氮来改善营养压力 [ 7 ] [8 ]。同时，豆科作物通过与根瘤内的根瘤菌的共生关系，能够获取大气中的二氮 (N 2 ) [ 9 ]。这些共生体是生态层面的重要相互作用，影响群落的组成、多样性和演替。它们每年为自然生态系统贡献大约 100 至 2.9 亿吨氮，并改善全球饲料植物和具有农艺重要性的栽培植物的生长。此外，由于固氮作用，细菌导致豆类的多样化增加 [ 8]。植物-生物互惠作用的特殊意义在于豆科植物-根瘤菌之间的共生关系，在根瘤菌内固定大气中的氮以使豆科植物宿主重新提供碳，这种共生关系通过使氮在自然生态系统中可用来定期调整以确保自然生态系统中的养分循环的准确性。农业环境 [ 10]。成本上升以及农药和化肥对农业生产的负面影响需要通过使用有机产品和天然作物保护方案来解决这个问题。操纵植物生长促进 (PGP) 细菌，以改善植物健康和改善土壤，由于它们特别尊重环境、生产以及低成本和降低成本，已成为开发可持续农业系统的迷人方法之一。不可再生资源的消耗[ 11 ]。

在非洲，大量研究表明，豆科植物-根瘤菌共生是原核生物与真核生物共同进化共生最成功的模式之一[ 12 ]-[ 17 ]。在刚果共和国，对根瘤菌-豆科共生的研究表明，用慢生根瘤菌菌株接种一些豆科植物可提高每株根瘤的数量、植物芽中的总氮、植物的质量和植物的产量 [ 18 ] [ 19 ] [ 20]。然而，尚未对根瘤菌的生化和分子特征进行研究。对根瘤菌生物多样性和当地种群的了解对于设计成功的接种策略至关重要，因为通过用适当的根瘤菌接种豆科植物可以增强农业中的固氮作用 [ 21 ] [ 22 ]。本研究旨在分离和表征与饲料和森林豆类相关的本地根瘤菌。目标是在刚果共和国建立一个共生固氮细菌库。这些病菌可用于低产区豆科植物的接种工程。为了开展这项研究，我们对豇豆、小米草、金合欢属 和合欢。_

二、材料与方法

2.1。植物收藏

选择了两个地点对豆科植物进行取样。第一个站点位于布拉柴维尔的国民改造服务 (SNR)，第二个站点位于农民田地的 Mfilou。表 1显示了站点的地理位置。2018 年 11 月采集了四种豆科植物：Milletia laurentii、Acacia spp。和合欢在 SNR和Vigna unguiculata苗后六周在 MFILOU。采集豆科植物物种后立即运至实验室进行分析。在实验室，实验于 2018 年 11 月至 2019 年 12 月在法国国家科学研究与自然科学研究所 (IRSEN) 的实验室和生物实验室（法国）进行，用于菌株的分离和生化表征) 用于分子鉴定。

2.2. 结核取样和根瘤菌分离

将根瘤小心地从根系植物中分离出来，并清洗了几个

网站

地理位置

豆科植物

信噪比

纬度：-4.2781929

经度：15.2515928

鸡血藤_

金合欢属

合欢_

农田

在 MFILOU

纬度：-4.2641

经度：15.235042

豇豆_

表 1。站点的地理位置。

用无菌蒸馏水去除土壤颗粒。通过在 70% 乙醇中浸泡 5 分钟，然后在氯化汞溶液 (HgCl 2 ) 中浸泡 2 分钟对结节表面进行消毒。之后，用无菌蒸馏水连续清洗十次。将结节从中间切成两部分，用针挑出结节内容物，在含有25 mg·mL - 1刚果红（CR）溶液的皮氏培养皿酵母提取物甘露醇琼脂（YMA）上划线。YMA培养基g/L含有：甘露醇10 g、K 2 HPO 4 0.5 g、MgSO 4 -7H 2O 0.2 g，NaCl 0.1 g，琼脂 15.0 g。将板在 28˚C 下孵育 3-10 天。挑取单个菌落，通过重复划线到新鲜的 YMA 板上检查纯度，然后用于进一步分析 [ 23 ] [ 24 ] [ 25 ]。分离和纯化后，分离物在-80°C下储存直至使用。

2.3. 生化表征

从所有位置获得的根瘤菌菌株进行了纯化和表征。表征包括用 KOH 进行的革兰氏试验、过氧化氢酶和氧化酶试验、宏观和微观观察。还观察到在含有溴百里酚蓝 (YMA + BTB) 的 YMA 上的生长。

2.3.1。根瘤菌/农杆菌分化试验

在这个实验中，菌株在 28˚C 的葡萄糖蛋白胨琼脂 (GPA) 培养基上培养 3 天，还按照 [ 26 ] 的建议对它们进行了 3-酮乳糖检测。根瘤菌菌株在 GPA 上不能生长或生长不良，3-酮乳糖试验呈阴性。仅选择在 GPA 和 3-酮乳糖试验中均呈阴性生长的菌株用于以下分析。

2.3.2. 菌株增长率

用新鲜的接种物接种含有 50 mL 酵母提取物甘露醇 (YM) 培养基的烧瓶，在 30°C 下在旋转摇床上孵育 15 天。在生长期每 24 小时测量一次 OD600 值。实验一式三份进行，平均值用于通过 Graph Pad Prism 7.0 生成生长曲线。使用以下公式计算生成时间：

生成时间=吨2-吨13 , 3 (日志10外径2-日志10外径1)

其中 3,3 是一个常数； 吨2-吨1是生长曲线对数期任意两点的两时间间隔之差； (日志10外径2-日志10外径1)是T 2 时 OD 2和T 1时OD 1的 log 10的两个值之间的差异[ 27 ]。

2.3.3。脲酶、纤维素酶和果胶酶活性

用经典方法鉴定后的所有天然菌株都进行了脲酶、纤维素酶和果胶酶活性测试[ 28 ]。对于脲酶活性，菌株在补充有 2% 尿素和 0.012 g 酚红的 YMA 培养基上生长。碱化培养基呈粉红色 [ 29 ] 时显示出阳性活性]。纤维素酶活性在含有 0.5% CMC（羧甲基纤维素）的培养基上进行。通过将 0.1% 刚果红溶液 (w/v) 倒入培养皿，然后倒入盐溶液 (NaCl，1M) 来显示纤维素酶活性。菌落周围的清晰光环显示阳性活性。对于果胶酶活性，菌株在补充有 0.5% 果胶的 YMA 培养基上生长。果胶酶活性通过在培养皿中倒入lugol来显示，菌落周围的透明或黄色晕圈显示阳性活性。所有实验均在 28°C 下孵育 5 天。

2.3.4。pH、温度和NaCl对生长的影响

然后将用磷酸盐缓冲溶液 (pH 7.0) 洗涤的菌株的中指数期培养物稀释在 YM 培养基中，并以每毫升 10 7 个细胞接种到含有 10 mL YM 培养基的试管中，以耐受 pH 值 4、7、8 和 9 . 另一方面，将10 8个细胞接种在10 ml YEM 中，以测试温度或NaCl 的影响。温度测试应力在 28°C、37°C​​ 和 44°C 下进行，而 NaCl 测试介质补充了 0%、1%、3%、5% 和 12% NaCl。所有培养物在 30°C 下培养 3 天。在孵育结束时，在 600 nm 处获取光密度。

2.3.5。碳水合物的使用

甘露醇、葡萄糖、麦芽糖、果糖、蔗糖、半乳糖、乳糖、山梨糖醇和木糖被测试为菌株生长中的碳源。在 YM 培养基中，作为碳源的甘露醇被 1% 的上述碳水合物之一替代。菌株在 30°C 下培养 3 天。在温育结束时，在 600 nm 处获取光密度。

2.3.6。重金属和抗生素耐药性

采用wells法在胰蛋白胨酵母抽提物(TY)固体培养基上测定其抗重金属性，g/L为：胰胨5 g、酵母抽提物3 g、CaCl 2 0.87 g、琼脂15 g。培养皿在 30°C 下培养 24 至 48 小时。测试了浓度为 10 至 5000 µg/mL 的汞 (Hg)、铅 (Pb)、铜 (Cu)、银 (Ag)、钴 (Co)、锌 (Zn) 和镍 (Ni)。培养3天后测量抑菌圈（透明区）的直径，以厘米（cm）为单位，当孔周围没有观察到抑菌剂时，认为菌株具有抗性。

Antibiogramme 和他的解释是使用欧洲委员会关于抗菌药物敏感性测试的建议 (EUCAST, 2019) 完成的。抗生素：卡那霉素30μg、阿米卡星30μg、苯唑西林1μg、红霉素15μg、链霉素10μg、庆大霉素10μg、氯霉素30μg、拉非平5μg、氨苄青霉素10μg和阿莫西林25μg。将抗生素盘无菌放置在 Muller Hinton (MH) 培养基培养皿上，培养皿中接种 100 µl 光密度 (OD 625 ) 介于 0.08 和 0.1 之间的新鲜细菌培养物，对应于 10 8菌落形成单位 (CFU)，然后在 30 C。孵育 2 或 3 天后以毫米 (mm) 测量抑制直径。

2.4. 16S 核糖体 RNA 区域的 DNA 提取和 PCR 扩增

16S核糖体RNA区域的DNA提取和PCR扩增由Biofidal实验室（法国）完成。按照制造商的说明，用 Omega BioteK Mag-Bind Universal Pathogen Kit 提取 DNA。然后，使用 Quantus™ 荧光计和 Quantifluor 试剂盒对提取的 DNA 进行定量，并在 1% 琼脂糖凝胶上迁移。用通用引物 27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') 和 1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3') 扩增 16S rRNA 基因。PCR 混合物由 2 µL DNA 提取物、5 µL Mix HOTBIOAmp 5X à 12.5 mM MgCl 2、1.5 µL Enhancer 10X、1 µL Primer 27F、1 µL Primer 1492R、14.5 µL ddH 2获得O. PCR 混合物在 96°C 进行 12 分钟初始变性，然后在 96°C 变性 20 秒、56°C 退火 20 秒、72°C 延伸 20 秒和 30 个循环。最后在 72°C 延伸 5 分钟。在 Qiaxcel 上检查 PCR 产物的质量，单个特定条带大小预计约为 1470 pb。

2.5. 测序和分子鉴定

引物 27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')、1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')、805R (5'-GACTACCAGGGTATCTAATCC-3') 和 515F (5'-TGYCAGCMGCCGCGGTA-3') 用于测序PCR 产物。测序由 Biofidal 实验室（法国）完成。PCR 产物用 BigDyeV3.1 Dye Terminator Kit-Thermo Fisher Scientific 进行测序。在用 96 毛细管测序仪 ABI3730XL（Thermo Fisher Scientific）分析之前，用 BigDye Xterminator Kit 纯化序列。使用 CHROMAS Pro 进行序列比对以创建 16S rRNA 基因的完整计数。在 NCBI GenBank 数据库 (https://www.ncbi.com/) 上对序列进行爆破，以识别菌株。它们也被提交到 NCBI GenBank 数据库以获得登录号。

2.6. 16S核苷酸的系统发育分析

使用在NCBI数据库（https://www.ncbi.com/）上检索到的与参考细菌（表2 ）相似度≥99%的16S rRNA核苷酸序列进行鉴定。使用 DNAMAN 对我们的六个序列进行多序列比对，并使用分子进化遗传学分析 (MEGA X) 软件 [ 30 ] 从肌肉比对序列创建系统发育树。Agrobacterium K84、Rhizobium leguminisarum bv.viciae 3841、Rhizobium leguminisarum bv.的 16S rRNA 序列。三叶草 WSM2304，葡萄农杆菌S4，根癌农杆菌 str。C58 (Cereon)、Mesorhizobium loti MAFF303099 和源自微生物的慢生根瘤菌USDA 110

寄主植物

菌株

参考菌株

同源性 (%)

入藏号

合欢_

RhA1

热带根瘤菌

99.79%

MT657288

金合欢属

RhAc13

中根瘤菌_

99.72%

MT657292

RhAc15

根瘤菌

99.86%

MT657293

RhAc4

热带根瘤菌

99.79%

MT657291

鸡血藤_

RhW1

慢生根瘤菌

99.64%

MT657298

豇豆_

RhV3

圆明慢根瘤菌

99.79%

MT657303

表 2。菌株同源性和登录号的百分比。

从选定的基因组中恢复在线数据库（http://www.microbesonline.org/），并将其作为共有序列的参考添加到树中。

3. 结果

3.1。从豆科植物中分离原生根瘤菌

共获得77株，划分如下：金合欢25株，鸡血藤15株， Alibizia lebeck 17株，豇豆20株。来自金合欢属的菌株。和合欢5天后出现在培养基上，而在培养基上生长的豇豆菌株在8天后出现，而鸡血藤的菌株则出现在培养基上。9天后。它们在 YMA+CR 上呈白色或粉红色，半透明或不透明。菌株为革兰氏阴性、过氧化氢酶和氧化酶阳性。显微镜观察显示，菌株呈棒状且能运动。所有Vigna unguiculata和Milletia laurentii菌株都是生长缓慢的细菌。它们在分离后需要 7 到 9 天才能出现在 YMA 培养基上，而合欢菌株是快速生长的细菌。这些最后的菌株在分离后 3 天出现在培养基上。本研究建立的结果表明，在金合欢属菌株包括快速和缓慢生长的菌株，它们需要 3 到 5 天才能出现在 YMA 培养基上。所有快速生长的菌株都将YMA+BTB培养基的颜色由绿色变为黄色，而缓慢生长的菌株则由绿色变为蓝色。在获得的 77 株菌株中，30 株不能在 GPA+VB 上生长，而 12 株对 3 次酮乳糖测试呈阴性（图 1（a））。只有 6 株不能在 GPA 上生长，3 株酮乳糖阴性。选择这些菌株进行进一步分析。菌株的生长曲线（图1（b））显示，大多数菌株在2天后开始指数期，7天后进入稳定期。本研究中的所有菌株均为革兰氏阴性 (-)、过氧化氢酶阳性 (+) 和氧化酶阳性 (+)。

3.2. 次生代谢产物的产生和有益性状

为了检查菌株的次生代谢，测试了脲酶、果胶酶和纤维素酶的活性。所有测试的分离株均为脲酶阳性（图2（a）），

(一)(二)

图 1。农杆菌-根瘤菌试验和原生根瘤菌的生长。(a) 3-酮乳糖：菌落周围没有黄色晕圈，试验为阴性；(b) 原生根瘤菌的生长曲线。

图 2。天然根瘤菌菌株的酶活性。(a) 脲酶：粉红色着色试验阳性，黄色着色试验阴性；(b) 纤维素酶：孵育 3 天后出现晕圈，阳性试验。

仅从 Milletia laurentii 根瘤中获得的一株 RhW1显示出阳性纤维素酶活性（图 2（b）），其他菌株为纤维素酶阴性，无一株显示出果胶酶活性。

3.3. 菌株的生理特性

这些菌株在不同 pH 值的 YM 培养基上生长。在碱性培养基上观察到的生长高于在酸性培养基上。用 RhAc13 在中性 pH 条件下观察到最好的生长（图 3 (a)）。菌株生长较好

(a)(b)(c)

图 3。pH、温度和NaCl盐对天然根瘤菌菌株的影响。(a) pH 值的影响；(b) 温度的影响；(c) NaCl 对原生根瘤菌菌株生长的影响。

温度 30°C 和 37°C。生长在 44°C 时下降。RhAc15 和 RhA1 的生长最弱（图 3 (b)）。结果表明，RhV3的生长不受温度升高的影响。随着 NaCl 量的增加，菌株的生长减少（图 3（c））。在 0% 的 NaCl 时观察到最好的生长，所有天然菌株都能够生长到 12% 的 NaCl。然而，在培养基中 12% 的 NaCl 时生长较弱。NaCl 似乎对来自Vigna unguiculata根瘤的 RhV3 菌株的生长没有影响，因为在使用的浓度范围内生长相似。

3.4. 根瘤菌菌株使用的碳源

为检测变异碳源是否与菌株的生长有关，对甘露醇、麦芽糖、阿拉伯糖、乳糖、半乳糖、木糖、果糖、蔗糖、山梨糖醇和葡萄糖等十种碳源进行了检测。结果表明，所有菌株都能够使用所有测试的碳水化合物（图4）。RhAc13 对除木糖和果糖外的一组碳源表现出最大的活性。用 RhA1 观察到第二好的生长。对于该菌株，在阿拉伯糖存在下生长最小，而 RhAc4 在山梨糖醇和甘露醇下生长最低。另一方面，以麦芽糖和果糖为碳源，RhW1 的生长最弱。图 4显示在阿拉伯糖存在下观察到 RhAc15 的最低生长。

3.5. 重金属对原生根瘤菌菌株的影响

重金属的影响如图5（a）和图5（b）所示。这个

图 4。YEM液体培养基中菌株使用十种碳源的定量估计。甘露醇被不同的碳源取代。使用平均值±标准差将液体培养基中碳源的定量数据绘制为条形图，使用 Graph Pad 7.0 对分离株之间的显着变化进行排序。

(一)(二)

图 5。重金属对分离株存活的影响。（ a ）来自天然分离株的所有抑制区的差异重金属应力分析得分图。(b) 在不同浓度的 Hg 上显示以厘米 (cm) 为单位的抑制区的板。

图中显示，所有菌株均对 2500 µg/mL 的 Ag、Pb 和 Co 具有抗性（图 5（a））。大约 50% 的菌株耐受 10 µg/mL 的 Hg，33.33% 的 50 µg/mL 和 16.66% 的 100 µg/mL 的菌株（图 5 (b)）。大约 50% 的菌株对 5000 µg/mL 的 CuO 2具有抗性，另外 50% 的菌株在 2500 µg/mL 时具有抗性。83.33% 的菌株对 2500 µg/mL 的 Ni 产生抗性，而 16.66% 的菌株对 1000 µg/mL 产生抗性。66.66% 的菌株在 5000 µg/ml 和 33.33% 的 2500 µg/ml 下对 Zn 产生抗性（图 5 (a) 和图 5 (b)）。

3.6. 抗生素对原生根瘤菌菌株的影响

圆盘周围透明区的直径在 0 到 38 毫米之间变化。根据欧洲抗菌药物敏感性测试委员会的建议，测试的菌株被分类为敏感、中等和耐药。从金合欢属中分离的菌株 RhAc13 。对氨苄西林、利福平、阿莫西林、庆大霉素、阿米卡星、红霉素和苯唑西林耐药。它对链霉素敏感，对氯霉素敏感（图 6 (d)、图 6 (f)、图 6 (g) 和图 6 (j)）。RhAc15 对除氯霉素外的所有抗生素均具有耐药性（图 6（d）、图 6（f）、图 6（g）、图 6 (h) 和图 6 (j))。结果表明，RhAc4对所有测试的

图 6。孵育24小时后根据测试的抗生素的抑菌圈直径（mm）。

抗生素（图 6 (f)、图 6 (g)、图 6 (h) 和图 6 (j)）。另一方面，分别从 Milletia laurentii 和 Vigna unguiculata 中分离出的菌株 RhW1 和 RhV3对除利福平中间的所有抗生素都敏感（图 6）。RhA1对苯唑西林有抵抗力（图6（j））。Albizia lebeck菌株RhA1对红霉素、氯霉素、卡那霉素和利福平耐药。（图6（b）、图6（c）、图6（e）、图6(i)) 但它对所有其他人都很敏感。

3.7. 分离细菌的分子鉴定

图 7 (a) 显示了电泳标记大小 (M) 以上的条带大小

(一)(一)

图 7。使用通用引物对天然分离株进行 16S rRNA 表达。(a) 电泳显示基因组 DNA 条带高于标记大小；(b) Qiaxcel 对 16S rRNA PCR 产物的质量控制。

从我们的细菌菌株中提取的纯化基因组 DNA 凝胶。使用基因组 DNA 通过 PCR 扩增 16S rRNA 基因，通过自动毛细管电泳 (Qiaxcel) 显示显示约 1500 bp 的条带 (图 7 (b))。所有16S基因序列的Blastn显示菌株与固氮菌相关，属于根瘤菌属、中生根瘤菌属和慢生根瘤菌属。从豇豆根瘤中分离得到的菌株为元明慢根瘤菌（登录号MT657303 ），同源性为99.79 %。从Milletia laurentii根瘤中分离出的菌株为Bradyrhizobiumelkanii（登录号 MT657298）具有 99.64% 的同源性。从金合欢根瘤中分离的菌株被同化为 Mesorhizobium sp（登录号 MT657292），Rhizobim sp。(登录号 MT657293) 和热带根瘤菌(登录号 MT657291) 的同源性分别为 99.72%、99.79% 和 99.86%。来自合欢的菌株被鉴定为热带根瘤菌（登录号MT657288），同源性为 99.79%（表 2）。

3.8. 菌株的系统发育树

使用 MEGA X 软件对与 16S rRNA 相关的核苷酸序列的系统发育分析表明，在布拉柴维尔南部土壤中结瘤豆科植物的原生菌株明显多样化（图 8（a））。系统发育树显示菌株被分为四个不同的进化枝，分类为 I 至 IV（图 8（b））。进化枝 I 包括在 16S 管家基因系统发育中与热带根瘤菌和放射农杆菌谱系聚集的测试菌株。然而，进化枝 II、III 和 IV 中的所有菌株都形成了一个单系群，与任何已知类型菌株密切相关，例如Mesorhizobium loti MAFF 303099、Bradyrhizobium元明菌菌株B071 16S。

(一)(二)

图 8。根瘤菌菌株中 16S rRNA 的分子系统发育。(a) 同源级；(b) 系统发育树。

4。讨论

在这项研究中，在不同条件下测试生长促进功效的菌株集中在豆科植物的天然根际细菌分离物上。与与天然土壤共存多年的外来物种相比，微生物群应为本地微生物提供竞争优势 [ 31]。我们获得了在 YEMA RC 上呈白色或粉红色、半透明或不透明革兰氏阴性、过氧化氢酶阳性和氧化酶阳性的菌株。菌株均为将YMA+BTB变为蓝色的慢生菌和将YMA+BTB变为黄色的快速生菌。类似的特征已被证明在孵化期间将根瘤菌分为两组：在孵化后最多出现 3 天的那些快速生长的细菌和在孵化 3 天后出现的缓慢生长的细菌 [ 25 ]。关于孵化后的外观，我们的菌株既是缓慢生长的细菌，也是快速生长的细菌；但就世代时间而言，它们都被视为生长缓慢的细菌。

根瘤菌可产生一些酶，如脲酶、淀粉酶、纤维素酶、果胶酶[ 28 ]。在本研究中，除一株显示阳性纤维素酶活性外，所有天然菌株均显示阳性脲酶活性、阴性纤维素酶和果胶酶活性。我们的研究结果与从Dalbergia sissoo根瘤中分离出的菌株在脲酶活性方面相似 [ 32 ]。然而，与Hedysarum 根瘤相关的菌株显示负纤维素酶活性 [ 33 ] 而与从Genista cinerea根瘤中分离的根瘤菌具有正纤维素酶活性[ 28]。关于果胶酶活性，我们的结果与果胶酶活性呈阳性的菌株不同 [ 28 ]。

pH、温度和氯化钠是会对细菌和豆科植物/根瘤菌共生产生负面影响的因素 [ 34 ] [ 35 ] [ 36 ]。多项研究表明，根瘤菌菌株可以生长高达 4% 的 NaCl [ 32 ] [ 37 ]。然而，一些根瘤菌菌株能够在 5% 的 NaCl [ 38 ] [ 39 ] 下生长，而一些根瘤菌则能够在 7% 的 NaCl [ 39 ] 下生长。一些作者表明，根瘤菌菌株耐受范围广泛的 NaCl 低于 12% [ 40 ] [ 41]。这些发现与我们的结果相符，即本研究中获得的菌株能够在 0% - 12% 的 NaCl 培养基中生长。温度对菌株的影响与其他作者 [ 28 ] [ 42 ] 已经获得的相似。根瘤菌菌株可以生长到 40˚C [ 32 ] [ 37 ]。从鹰嘴豆中获得的簇 III 中的菌株能够在 42˚C [ 38 ] 下生长。我们的结果也与已经报道的在 40˚C 以上温度下缓慢生长的根瘤菌的结果接近 [ 43 ]。生长缓慢的细菌比快速生长的菌株更能耐受低 pH [ 44 ]，这已被能够在 pH3 条件下生长的慢生根瘤菌和伯克霍尔德菌菌株证实[44]。45 ]。在这项研究中，所有菌株在 7 到 9 的碱性 pH 值下都具有良好的生长，鹰嘴豆根瘤菌也获得了相似的结果，菌株能够在 5 到 9.5 之间的 pH 值下生长 [ 38 ]。以同样的方式，证实了菌株在 pH 值分别为 5 和 8 之间从根瘤生长 [ 32 ] [ 37 ]。然而，Vigna unguiculata L. Walp 菌株的根瘤菌在 pH 值为 10 [ 46 ] 时生长。

根瘤菌菌株可以在存在三糖和二糖、醛糖和多元醇的情况下生长 [ 47 ]。一些菌株还能够使用果糖、葡萄糖、乳糖、半乳糖和木糖 [ 28 ]。另一方面，根瘤菌菌株不能使用乳糖 [ 32 ] [ 37 ] [ 48 ]。我们的结果证实了这些报告，但乳糖除外，因为我们的分离株可以使用乳糖。

一些研究表明，根瘤菌菌株对氯霉素、红霉素、卡那霉素、庆大霉素、链霉素和利福平具有耐药性 [ 48 ] [ 49 ] 而其他菌株对庆大霉素、卡那霉素、红霉素、氨苄青霉素、链霉素、氯霉素、利福平和氨苄青霉素敏感 [ 46 ] [ 50 ]。我们的研究结果显示出对大多数提到的药物的耐药性，并且与 [ 38 ] 获得的更高浓度的药物相似。几位作者还报告说，快速生长的菌株比生长缓慢的菌株对抗生素更敏感 [ 44 ] [ 51 ]。

重金属对微生物产生不利影响 [ 52 ] [ 53 ]。重金属反应下产生的毒性效应可以通过影响原生菌株的生长、丰度、遗传多样性、结瘤能力和功效来改变原生菌株 [ 52 ]。一些根瘤菌的生长受CoCl 2 (25 µg/ml)、Pb(CH 3 COO) 2 (250 µg/ml)抑制，但对HgCl 2 (10 µg/ml)和CuCl 2 (50微克/毫升）[ 38 ]。但从豇豆中分离得到的根瘤菌对HgCl 2 、 CuCl 2、ZnCl 2有抵抗力。和低浓度的 Pb(CH 3 COO) 2 (100 - 200 μg/mL) [ 46 ]。在这项研究中建立的结果与 [ 38 ] 仅针对汞 [ 38 ] 获得的结果相似，并且与 [ 46 ]获得的结果完全相似。对非生物因素的耐受性、对抗生素和重金属的抗性是选择生物肥料菌株的重要特征 [ 54 ] [ 55 ]。

16S RNA基因测序结果表明，生长快的菌株均属于根瘤菌属，而生长缓慢的菌株则属于中根瘤菌属和慢生根瘤菌属。从豇豆根瘤中获得的菌株被鉴定为圆明慢生根瘤菌；Milletia laurentii菌株为Bradyrhizobium elkanii；金合欢属 菌株如Mesorhizobium sp .、Rhizobium sp .。和热带根瘤菌；Albizia lebeck菌株为热带根瘤菌。大多数研究报告说，合欢被慢生根瘤菌、中生根瘤菌和根瘤菌结瘤 [ 56 ] [ 57 ]；根瘤菌属、中根瘤菌属、慢生根瘤菌属和中华根瘤菌属的金合欢 [ 56 ] [ 57 ] [ 58 ]。这些报告与我们的发现相似，因为我们发现了由热带根瘤菌结瘤的Alibizia lebeck，相思由根瘤菌属和中根瘤菌属。通过系统发育分析 16S rRNA 基因，使用聚类方法使我们能够识别具有相似模式的基因中的四个进化枝，这通常表明它们在相同的生物过程中是活跃的。分子分析结果与天然菌株的生理、形态和生化性状一致。

5. 结论

在本研究中，从四种豆科植物的根瘤中获得了 77 株分离物： Milletia laurentii、Accacia spp .、Albizia lebbeck和Vigna unguiculata。在这些分离株中，有六个是在根瘤菌-农杆菌试验后挑选出来的。他们接受了不同的生化和分子测试。主要结论是使豆科植物结瘤的细菌群落非常多样化。因此，同一植物可以被几种细菌结瘤。例如，Milletia laurentii由单一物种Bradyrhizobium elkanii 结瘤，而Accacia spp. 能被热带根瘤菌、Rhizobium sp .结瘤。和Mesorhizobium sp。合欢由热带根瘤菌结瘤，豇豆由圆明慢根瘤菌结瘤。这些物种可用于构成结瘤豆科细菌库。这些细菌可用于刚果农业系统以提高作物产量。

致谢

作者感谢国家科学研究所的负责人，他们为这项研究提供了部分资金。我们也感谢所有为完成这项研究做出贡献的个人。

利益冲突

作者声明与本文的发表没有利益冲突。

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