工程微生物生物膜以提高生化物质的生产力

摘要：生物膜在体外被设计用于生产许多商品，如生物肥料、药物、生物燃料和电力，其功效依赖于生物膜分泌的生化物质，即细胞外聚合物 (EPS)。已经表明，一旦将已开发生物膜的 EPS 生化物质应用于生态系统，它们就可以恢复退化的复杂生态系统网络，从而改善生态系统功能和可持续性。EPS 生化物质的鉴定和了解它们对网络相互作用的贡献尤其处于初始阶段。在本研究中，使用黑曲霉、念珠菌、 和克 (-)嗜麦芽窄食单胞菌和克 (+)枯草芽孢杆菌作为测试真菌 (F)、蓝藻 (C) 和细菌 (B) 对应物，我们分别分析了真菌-细菌 (FBB)、真菌的形态和生化参数- 蓝藻 (FCB)、蓝藻-细菌 (CBB) 和真菌-蓝藻-细菌生物膜 (FCBB) 。结果表明，FCBBs 产生最高浓度的脂质、蛋白质和多糖，而 FBBs 产生最高多样性的生化物质。细菌类型（即克 + 或 -) 和生物膜中的微生物组成影响生化生产。在生物膜-EPS中检测到在生态和工业上重要的各种生物化学品，这些生物化学品在人类社会中单独用作药物、生物修复剂和工业化学品，具有一定的不利和有益作用。然而，在自然界中，作为生物肥料应用的这些不同生化物质的同时作用已经显示出恢复由于农民的有害做法而退化的整个农业生态系统的巨大潜力。生化剂在利用方面的显着差异及其同时作用时的增强效果需要进一步研究以更好地应用。

关键词

生化剂,生物膜,生态系统恢复,细胞外聚合物

一、简介

微生物主要以两种生活方式生活，即。浮游生物（自由游泳）和表面附着的生物膜，使其能够在包括极端环境在内的各种环境中保持耐力。这两种表型之间的代谢变化已得到认可 [ 1 ]。生物膜与浮游细胞的比较转录组研究证实，生物膜细胞具有不同的代谢活性，在生物膜环境中负责生存、持久和生长的基因显着上调[ 2] 。这导致生物膜产生和分泌比浮游细胞更广泛的生态重要过程所需的生化物质。这些生化物质可以在由生物膜本身分泌的 EPS 中找到。EPS现在被认为是“生物膜的暗物质”，因为它们的成分尚未得到充分认识。并且生化物质的分子相互作用仍有待定义 [ 3 ] [ 4] 。在这里，我们假设特定 EPS 生化物质的识别和理解及其对复杂的交互式生态系统网络的贡献对于提高新开发的生物膜的生产力及其在各种生物技术中的利用非常重要。所获得的知识也将有利于进一步改进创新概念，如生物膜生物肥料 [ 5 ] ，目前已在农业中成功实践 [ 6 ] ，以及新提出的生物膜药物概念 [ 7 ] ，两者都从事分别恢复退化的农业生态系统和人体生态系统。

EPS 生化物质主要由脂质、蛋白质和多糖组成 [ 8 ]。生物膜的生产力主要取决于其驻留微生物的代谢合作。例如，日本开发的有效微生物（EM）技术[ 9 ]表明，相互相容的共存微生物具有良好的代谢合作，导致自给自足，有助于其在环境中的稳定性和广泛的活动[ 10 ] .

2003 年，生态友好型有益微生物生物膜，特别是真菌-细菌生物膜的体外工程首次被引入生物技术应用 [ 10 ]。后来，同样的概念被重新引入使用不同的术语，即合成微生物联合体[ 11 ]。到目前为止，科学家们已经开发出生物膜来生产许多商品，如药物、农用化学品、生物修复剂和工业化学品，因为它们具有自固定、对反应物的高抗性和长期活性的固有特性，所有这些都有助于连续加工 [ 5 ] [ 12] 。然而，优化生物膜以获得所需的产品是在工业规模上保持其生产力的强制要求。

因此，本研究旨在表征不同生物膜复合物生长和成熟过程中的生物膜-EPS，以开发更具生产力的生物膜，这将有利于该研究领域的创新。

2。材料和方法

2.1。生物膜形成

为了开发单一培养和混合培养生物膜，A. niger，Nostoc sp 。, 和S. maltophilia / B. subtilis分别用于代表真菌、蓝细菌和细菌。从每一个中，将一环微生物引入 250 mL CCM [ 13 ] 肉汤以产生单一培养物。取适当体积的每种单一培养物并接种到含有10 ml CCM培养基开发不同的生物膜；FBB、FCB、BCB 和 FCBB。以这种方式，开发了 14 种不同的生物膜；胎牛血清α _α , CBS α , CBB α , FCBS α , FCBB α , FBS β , FBB β , CBS β , CBB β , FCBS β , FCBB β , FC α和 FC β [C = Nostoc sp ., F = A. niger , BS = 克 (-) S. maltophilia，BB = 克 (+) B. subtilis ]。将培养物培养 7 天以形成生物膜。采用完全随机设计，每种生物膜类型重复三个。

通过用乳酚棉蓝染色，在低倍和高倍光学显微镜下观察发育的生物膜，以表征不同类型生物膜之间的形态差异。

2.2. EPS的提取

EPS的提取采用物理和化学相结合的方法[ 14 ]。将 5 g NaCl 溶解在 100 mL 无菌蒸馏水中制备 NaCl 溶液。将 10 微升溶液添加到 15 毫升含有已显影生物膜的离心管中。然后，对它们进行超声处理 10 分钟，然后以 5000 rpm 的速度离心 10 分钟。最后，取离心管中的上清液进行进一步分析。

2.3. 生物膜-EPS中生化物质的表征和鉴定

2.3.1。衰减全反射-傅里叶变换红外 (ATR-FTIR) 光谱

ATR-FTIR 在 600 - 4000 cm -1范围内的 Nicolet is 50 FTIR 系统（Thermo Fisher Scientific）上进行。

根据碳水化合物（960 - 1130 cm -1）、蛋白质（1580 - 1700 cm -1）和脂质（1710 - 1765 cm -1 ）的诊断带对不同类别的生物大分子的产生进行量化[ 15 ]。

2.3.2. EPS的液相色谱-质谱（LC-MS）

每个样品分别用 HPLC 级 MeOH 稀释，得到 1:1 溶液。然后，样品在进样前通过 25 mm 尼龙网和 0.45 µm 过滤器进行过滤。使用带有反相 Supelco C-18 分析柱（15 cm、4.6 mm、3 µm）的 Thermo Scientific DIONEX UltiMate 3000 UHPLC 系统对样品进行 LC-MS 分析。UHPLC 系统包括一个高压泵、一个自动进样器、一个柱温箱和一个光电二极管阵列检测器。柱温为 28°C。流动相由超纯水 (B) 中的 100% HPLC 级 MeOH (A) 和 0.001% (v/v) 分析级甲酸组成。在梯度洗脱中进行分离如下：直到 2 分钟 90% B，28 分钟 2% B，30 分钟 2% B，32 分钟 90% B，和 90% B，直到 35 min，流速为 0.4 mL/min。进样量为 10 µL。所有峰的光谱数据在 200 - 400 nm 范围内累积，紫外可见色谱在 224、254、280 和 360 nm 处记录，带宽为 1 mm。数据采集​​速率为 5 Hz。响应时间为 2.000 秒。

Thermo Scientific LCQ Fleet 质谱仪采用电喷雾 (ESI) 离子源与 UHPLC 系统耦合。F-DGSi Alliance V350实验室气体发生器由加压空气产生的氮气用作雾化气体和干燥气体。将干燥气体加热到 350°C 并以 36 个任意单位的流速引入毛细管区域。将毛细管加热到 320˚C，毛细管电位设置为 -40 V。喷雾电压为 4500 V，电晕电流为 25 mA。对质谱进行了完整的数据采集，在质心模式下以负极性从 m/z 范围 100-1500 进行扫描。激活类型是碰撞诱导解离。归一化碰撞能量为 35，激活时间为 30.00 ms。

2.3.3. 生物膜-EPS中生化物质的鉴定

通过使用 NIST 质谱库（美国马里兰州盖瑟斯堡国家标准与技术研究所）分析 LC-MS 色谱图来鉴定生物膜-EPS 中的生化物质。以 100% 和 90% - 100% 的概率鉴定的分子分别被认为是具有确认和预测结构的化合物。

2.4. 统计分析

使用统计软件 Minitab 版本 17 分析数据。使用单因素方差分析 (ANOVA) 分析 FTIR 吸光度数据，然后进行 Tukey 的 HSD 检验。概率≤0.05被用作显着性阈值。

3。结果与讨论

3.1。生物膜的形态

在 FBB 中，真菌丝充当细菌细胞定殖的生物表面（图 1），这在之前的研究中也观察到 [ 16 ] [ 17 ]。细菌细胞与真菌丝的附着在生物膜形成的前 48 小时内开始，并在 96 小时达到最大附着。在 FBB 成熟过程中可以清楚地观察到 EPS 的积累，并且在第 7 天观察到 EPS 的最高量（图 1）。

在 CBB 中也进行了相同的观察。在 FCB 中，真菌细丝与蓝藻线交织在一起，并被 EPS 包围。在 FCBBs 中，附着在真菌和蓝藻细丝上的细菌细胞被细胞外基质包围。

3.2. 生物膜-EPS的表征

在生物膜-EPS 中主要观察到脂质、多糖和蛋白质的产生（图 2）。FCBS α生物膜产生最高量的脂质、蛋白质和多糖，而 CBB α、CBS β和 FC α分别产生最低量（图 2）。

图 1。(a) 真菌-细菌、(b) 蓝藻-真菌、(c) 蓝藻-细菌-真菌和(d) 蓝藻-细菌生物膜的形态特征。放大 400 倍。

图 2。不同生物膜产生的 EPS 生化物质（C = Nostoc sp.，F = Aspergillus niger，N = 革兰氏阴性嗜麦芽窄食单胞菌，P = 革兰氏阳性枯草芽孢杆菌， α = F: C: B = 1:12:3 的接种比例， β = F:C:B = 12:1:4 的接种比例，LI = 脂质，PR = 蛋白质，PS = 多糖）。

在 FCBB 中，S. maltophilia在生产脂质、蛋白质和碳水化合物方面的表现优于B. subtilis （图 2）。在 FBB 中，枯草芽孢杆菌在生产脂质方面的表现优于嗜麦芽糖酵母菌（图 2），而嗜麦芽糖芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌在生产蛋白质方面的表现相似（图 2）。此外，S. maltophilia产生的碳水化合物含量高于B. subtilis（图 2）。在 CBBs 中，S. maltophilia和B. subtilis在生产脂质和蛋白质方面表现相似（图 2），但B. subtilis产生的多糖量高于S. maltophilia（图 2）。

在 FCBB 中，α比率在生产脂质、蛋白质和碳水化合物方面的表现优于β比率（图 2）。在 FCB 中，比率β产生的碳水化合物量高于比率α（图 2）。在 FBB 和 CBB 中，这两种比率在生产脂质、蛋白质和碳水化合物方面的表现相似（图 2）。

真菌-细菌生物膜（此处为A. niger-S. maltophilia生物膜）的复合多样性高于其他生物膜（图 3）。这可能是真菌-细菌生物膜在工业中取得成功的原因 [ 18 ]。因此，A. niger-S. 为了确定其生物膜-EPS的组成，进一步表征了嗜麦芽糖生物膜。

3.3. A. niger-S的表征。嗜麦芽糖生物膜-EPS

在生物膜-EPS 中主要观察到脂质、多糖和蛋白质的产生（图 4）。据报道，它们在控制生物膜功能和稳定性的基因调控、蛋白质和信号网络中发挥关键作用 [ 3 ]。此外，它们还有助于增强土壤和人体等生态系统的功能 [ 7 ]。

在FBB中，高分子量代谢物（HMWMs）的数量显着高于低分子量代谢物（LMWMs）（P <0.05，图5）。在自然系统中，HMWMs 像多功能酶

图 3。由不同的单一和混合培养生物膜产生的 EPS 化合物的总数。B-细菌，F-真菌，C-蓝藻，BF-细菌-真菌，CB-蓝藻-细菌，CF-蓝藻-真菌，CBF-蓝藻-细菌-真菌。

图 4。开发的黑曲霉-嗜麦芽窄食单胞菌生物膜的 EPS 中的生化

图 5。已开发的黑曲霉-嗜麦芽窄食单胞菌生物膜的 EPS 中的生化物质数量，以分子量为特征。低分子量代谢物（LMWM，<900 kDa），高分子量代谢物（HMWM，>900 kDa）。

为产生不同的化学而工作。LMWM 参与了全球重要的过程，这些过程决定了原核生物、古生菌和真核生物的生理特征，以及物种与物种关系的调节 [ 19 ]。这些过程会影响生物矿化，甚至影响平流层中的臭氧水平[ 20 ]。

生物膜-EPS中生化物质的鉴定

在A. niger - S. maltophilia生物膜中，LC-MS 检测到 214 种生化物质，其中只有 5 种被完全鉴定。此外，以 90.3% - 98.9% 的概率预测了 14 种生化物质。总之，LC-MS 光谱中只有 9% 的生化物质被表征。

鉴定出的大部分生化物质属于与药物有关的化合物，其余属于我们社会单独使用的农用化学品、生物修复剂和工业上重要的化学品（表1和表2）。然而，它们通过自然环境中复杂的交互式生化网络的节点共同执行许多物理化学和生物学功能。例如，植物生长促进根际细菌 (PGPR)

生化分子

结构

行动/使用

Cholest-5-en-3-one

对肥胖、肝病和角质化有积极作用的类固醇药物 [21]

麦角甾醇

维生素 D2的前体[22]

凯彭

用作杀虫剂 [23]

锡罗辛戈平

一种与利血平相关的抗高血压药物，被发现可增强抗糖尿病药物二甲双胍和苯乙双胍的抗癌作用，但不会对正常细胞产生有害影响 [24]

β胡萝卜素

维生素 A 的前体 [25]

表 1。从黑曲霉-嗜麦芽窄食单胞菌生物膜中鉴定的生化

生物分子

行动/使用

可能性

(%)

1,2-苯二甲酸二壬酯

预防氧化应激引起的神经退行性疾病 [26]

93.0

9,10-蒽二酮，2-乙基-

抗癌化合物 [27]

96.4

蟾蜍灵

抗癌化合物 [28] [29]

90.3

表 2。黑曲霉-嗜麦芽窄食单胞菌生物膜-EPS中的预测生化物质

通过产生大量用于通讯和防御的细胞外分子在根际发挥作用，这些分子在有益植物-微生物相互作用的生化网络中发挥着至关重要的作用[ 42 ]。在人类肠道微生物组的代谢网络中也观察到了类似的功能 [ 43 ]。

复杂生物膜的微生物社会可与人类社会相媲美。生物膜微生物产生其功能和健康所需的生化物质（商品），从而获得营养。生物膜使用的生化物质与人类社会使用的生化物质相同。显着的区别在于，人类单独使用它们具有一些不良副作用和相对较低的功效，而生物膜微生物同时利用它们来改善网络相互作用，从而在环境中更好地发挥作用，正如农业中已经证明的那样 [ 6] 。生化物质利用的这种显着差异及其同时作用时的增强效果需要进一步研究。此外，微生物的某些行为模式和智能类似于人类 [ 44 ] [ 45 ]。这些相似的特征清楚地表明了生命从地球上的微生物开始的历史演变。

目前，由于人为活动造成的退化，自然界中具有重要生态意义的生化物质逐渐枯竭，导致生态系统健康恶化[ 46 ]。当生化物质被添加到任何退化的生态系统中时，

图 6。一幅漫画，展示了生物膜-EPS 生化物质在恢复全球生态系统健康方面的作用。

其生物多样性将随着生态系统功能的改善而增加，从而恢复生态系统的健康。生物膜-EPS 是向任何退化的生态系统提供生化物质以使其恢复的良好候选者，如图 6中的漫画所示。这个概念适用于管理的生态系统和自然生态系统，甚至包括人体生态系统 [ 7 ] [ 46 ]。

4。结论

本研究中使用的多种生物膜在其形成过程中表现出不同的形态特征。其中，真菌-细菌-蓝藻生物膜和真菌-细菌生物膜分别在EPS产生的数量和生化多样性方面处于领先地位。此外，在生物膜-EPS中产生了许多重要的生化物质，这表明恢复退化的生态系统（包括人体生态系统）具有巨大的潜力。然而，如果我们要减少它们的不良副作用并进一步提高它们在各种应用中的作用功效，人类社会目前使用生化剂的做法需要重新审视。

致谢

NIFS 微生物生物技术部门的所有成员都感谢他们在本研究中的支持。我们还想通过提供对研究有很大帮助的见解和专业知识来向所有合作的人表示感谢。

利益冲突

作者声明与本文的发表没有利益冲突。

参考

[ 1 ] Favre, L.、Ortalo-Magné, A.、Pichereaux, C.、Gargaros, A.、Burlet-Schiltz, O.、Cotelle, V. 和 Culioli, G. (2018) 生物膜和浮游表型之间的代谢组和蛋白质组变化海洋细菌 Pseudoalteromonas lipolytica TC8。生物污垢，34, 132-148。

[ 2 ] Resch, A.、Rosenstein, R.、Nerz, C. 和 Gotz, F. (2005) 在生物膜和浮游条件下培养的金黄色葡萄球菌的差异基因表达谱。应用和环境微生物学, 71, 2663-2676。

[ 3 ] Flemming, HC 和 Wingender, J. (2010) 生物膜基质。自然评论微生物学，8，623-633。

[ 4 ] Seviour, T., Derlon, N., Dueholm, MS, Flemming, HC, Girbal-Neuhauser, E., Horn, H., Kjelleberg, S., van Loosdrecht, MC, Lotti, T., Malpei, MF 和 Nerenberg , R. (2019) 生物膜的细胞外聚合物物质：遭受身份危机。水研究，151，1-7。

[ 5 ] Seneviratne, G.、Kecskés, ML 和 Kennedy, IR (2008) 生物膜生物肥料：在植物中有效利用营养的新型接种剂。在：Kennedy, IR, Choudhury, ATMA, Kecskés, ML 和 Rose, MT, Eds.，使用接种生物肥料实现越南水稻生产中的有效养分利用，澳大利亚国际农业研究中心，堪培拉，126-130。

http://biogro.com.vn/wp-content/uploads/ACIAR-PR130-onlineKennedyetal-BioGro-Research.pdf#page=127

[ 6 ] Premarathna, M., Seneviratne, G., Ketipearachchi, KG, Pathirana, A., Karunaratne, RKC, Balasooriya, WK 和 Fonseka, K. (2021) 生物膜生物肥料可以恢复网络相互作用以提高水稻产量。锡兰科学杂志，50，235-242。

[ 7 ] Seneviratne, G. 和 Premarathna, M. (2020) 生物膜药物：下一代药物。

[ 8 ] Di Martino, P. (2018) 细胞外聚合物，了解生物膜表型的关键因素。AIMS 微生物学，4, 274-288。

[ 9 ] Higa, T. 和 Wididana, GN (1991) 有效微生物的概念和理论。第一届 Kyusei 自然农业国际会议论文集，孔敬，1989 年 10 月 17-21 日，118-124。

[ 10 ] Seneviratne, G. (2003) 环保、有益微生物生物膜的开发。当前科学，85，1395-1396。