澳大利亚花卉色彩多样性

摘要

欧洲和中东以外的地区，在花卉色彩多样性的进化过程中，已经进行的研究和相关调查工作还很少。特别是在膜翅目昆虫视觉系统中澳大利亚植物的进化，我们对此几乎没有了解。在地质发展过程中，由于澳大利亚大陆与其他大陆长期分离，澳大利亚拥有很多特有的植物和动物，物种稀有，珍贵物种所占比例高，对此的研究尤为有价值，值得我们深入探讨。

本研究的目的是在膜翅目昆虫视觉系统的背景下调查澳大利亚本土花木品种的颜色变化,澳大利亚本地蜜蜂天生的颜色偏好(三角黑化型),本地蜜蜂和食物之间的交互欺骗性兰花(Caladenia carnea)。首先,我发现膜翅类的鉴别灵敏度、花卉色彩多样性和膜翅类似乎已经成为澳大利亚花木颜色演化的主要因素。

其次,我发现三角黑化型先天偏好422,437和530海里的波长。第三,我发现蜜蜂能否适应兰花是以花朵的颜色为基础的,因此潜在地解释了颜色的多态性。总之,我的研究表明,澳大利亚植物的进化已经受到膜翅类的影响。

在欧洲和中东以外，关于花卉颜色多样性演变的研究很少。特别是，我们对澳大利亚植物群在膜翅目视觉系统中的进化几乎一无所知。由于澳大利亚植物区系在地理上长期孤立，且特有植物物种比例较高，因此这项研究可能很重要。

本研究的目的是在膜翅目视觉系统的背景下，研究澳大利亚本土花卉的颜色，澳大利亚本土蜜蜂（Trigona carbonaria）的固有颜色偏好，以及本土蜜蜂与食物欺骗兰花（Caladenia carnea）之间的相互作用。首先，我发现膜翅目昆虫的辨别阈值与花的颜色多样性相匹配，并且膜翅目昆虫似乎是澳大利亚花颜色进化的主要贡献者。

其次，我发现胡卢巴对422、437和530 nm的波长有天生的偏好。第三，我发现蜜蜂能够根据颜色习惯于兰花，从而潜在地解释了卡拉德尼亚carnea的颜色多态性。总之，我的研究表明，澳大利亚植物群的进化受到膜翅目的影响。

1、简介

植物与传粉者的相互作用

过去，传粉者和植物之间的相互作用被怀疑是推动被子植物辐射和多样化的原因（Regal 1977；Crepet 1984；McPeek 1996）。显而易见的互惠是，传粉者依赖开花植物的花粉和/或花蜜作为食物，作为回报，他们参与了植物繁殖所需花粉的附带转移（Faegri和van der Pijl，1978年；Harder，Williams等人，2001年）。据估计，全世界67%以上的被子植物依赖昆虫授粉（Tepedino 1979）。因此，传粉者在开花植物的持久性和生存中起着至关重要的作用，开花植物对人类食物链具有很高的价值（Kearns和Inouye，1997；Klein，Vaissiere等人，2007）。

花卉颜色信号与感官开发

颜色是可见光被物体吸收或反射，然后被动物的眼睛和大脑处理的结果（勒格兰德1968）。光是电磁光谱的一部分，可以通过不同能量光子的波长来量化（Bueche 1986）。物体反射的波长被视觉系统视为物体的颜色。例如，对于人类观察者来说，蓝色的光可以用400nm的主波长来描述，而红色的光是700nm。紫外线在300-400nm之间，蜜蜂可以看到，但人类看不到。花的颜色受到昆虫感觉受体的影响，包括它们的色觉，这与人类的视觉不同。人类有一个红色、蓝色和绿色的受体（Chittka和Wells，2004年）。相反，昆虫有紫外线、绿色和蓝色受体（Chittka和Wells 2004）。由于人类的视觉与膜翅目昆虫的颜色视觉系统非常不同，因此不能根据人类的颜色术语（如红色或蓝色）来讨论蜜蜂的颜色感知。因此，本文将根据波长讨论颜色。

颜色是植物用来向昆虫传粉者传递信息的最重要的花信号之一（Giurfa，Vorobyev et al.1996；Dyer，Spaethe et al.2008）。尽管已知传粉者根据形态、花蜜可用性、大小和气味来选择花朵（Giurfa，Núñez et al.1994；Kunze and Gumbert 2001；Spaethe，Tautz et al.2001；Whitney and Glover 2007），众所周知，颜色在使传粉者能够从高达50厘米的重要生物学距离上检测和区分目标花方面起着关键作用（Giurfa，Vorobyev等人，1996年；Dyer，Spaethe等人，2008年）。

近年来，我们对昆虫色觉进化的理解有了很大的进步。过去，由于昆虫颜色视觉系统的信息很少，颜色感知的研究受到限制（Frisch 1914；Daumer 1956）。现在可以使用分光光度计和色度学技术来评估花朵视觉信号如何出现在膜翅目传粉昆虫的视觉系统中，从而可以定量评估昆虫传粉昆虫如何感知复杂的颜色信息（Chittka 1992）（图1）。

先前的研究表明，膜翅目昆虫的颜色辨别在系统发育上是古老的，不同的膜翅目昆虫具有相似的颜色感知（Helversen 1972；Chittka和Menzel 1992）。重要的是，已知膜翅目的颜色辨别早于花的颜色多样性的进化（Chittka 1996）。在这里，最近的研究表明，在世界不同地区，花卉颜色的进化和分布有显著的趋同。

具体而言，Chittka（1996）在一篇开创性的论文中指出，欧洲和中东的开花植物都已将其颜色信号适应蜜蜂的视觉系统，这些区域的花朵颜色与膜翅目的视觉受体非常匹配（Chittka 1996）。然而，在欧洲和中东以外，关于花卉颜色多样性演变的研究很少。特别是，我们对澳大利亚植物群在膜翅目视觉系统中的进化几乎一无所知。由于澳大利亚植物区系的长期隔离和特有植物物种的高比例，这是一个需要研究的重要问题。我假设澳大利亚的花色将与膜翅目昆虫的辨别阈值紧密匹配，因为最近的证据表明昆虫传粉者支持开花植物的早期传播（Hu，Dilcher et al.2008）。

蜜蜂天生的颜色偏好

查尔斯·达尔文（CharlesDarwin）是第一个指出先天偏好可以让没有经验的传粉者找到食物来源的人（Darwin1877）。传粉者可以利用花朵的某些特征，如形态、气味、温度和颜色来定位食物（Heinrich 1979；Menzel 1985；Dyer，Whitney et al.2006；Raine，Ings et al.2006）。先前评估先天颜色偏好的研究往往集中于两个物种：欧洲蜜蜂（API mellifera）和大黄蜂（Bombus terrestris）。相比之下，没有研究关注澳大利亚蜜蜂天生的颜色偏好，以及这如何影响它们对花朵的选择。我们知道，欧洲大黄蜂和蜜蜂在其整个地理范围内对紫色和蓝色（400-420nm）表现出强烈的偏好（Chittka，Ings等人，2004），这与最有利可图的食物来源有关（Lunau和Maier 1995；Chittka和Raine 2006）。这些偏好可能会对这些蜜蜂是主要授粉者的地区不同花色的相对成功率产生影响（Chittka和Wells，2004）。因此，关于澳大利亚蜜蜂先天偏好的信息对于了解澳大利亚环境中膜翅目与植物的相互作用非常重要。

传粉者学习和食物欺骗兰花

大多数植物用花蜜或花粉来奖励传粉者。然而，有些物种不提供花的奖励，而是采用一系列欺骗技术诱骗昆虫完成授粉任务。欺骗性授粉策略在兰花中尤其广为人知和普遍存在（Jersáková，Johnson et al.2006）。例如，已知约有400种兰花通过性欺骗实现授粉，通过嗅觉、视觉和触觉模仿潜在配偶，引诱毫无戒心的雄性昆虫到花朵上。更常见的是食物欺骗型兰花，据信其种类多达6000种（占兰花的三分之一）（Jersáková，Johnson et al.2009）。模仿食物的兰花用鲜艳的颜色虚假地宣传奖励的存在，以吸引天真的授粉者（Ackerman 1986；Nilsson 1992；Jersáková，Johnson et al.2006）。兰花中常见的食物欺骗现象表明，这种形式的欺骗授粉是一种非常成功的进化策略（Cozzolino和Widmer，2005）。

传粉者对欺骗性植物的访问受到传粉者学习的影响。以前的研究表明，在性欺骗的情况下，昆虫很快学会了无回报的花色诱饵，并避开它们。例如，雄性昆虫学会避开含有性欺骗兰花的区域（Peakall 1990；Wong和Schiestl 2002）。然而，昆虫是否能学会避免食用欺骗性兰花还有待调查。此外，花性状的高度变异，尤其是花的颜色和花香，可能会阻止昆虫熟悉欺骗性花，从而中断昆虫的联想学习（Schiestl 2005）。事实上，颜色、形状和香味的变化在非模式食物欺骗兰花中很明显（Moya和Ackerman 1993；Aragón和Ackerman 2004；Salzmann，Nardella等人，2007）。然而，之前的研究只关注了传粉者对颜色变体的偏好（Koivisto，Vallius et al.2002），而没有评估不同的花颜色是否会减缓天真的传粉者学习无回报的花诱饵的能力。此外，有必要将颜色视觉科学和行为生态学结合起来，以了解蜜蜂如何感知兰花，因为蜜蜂的视觉系统与人类不同。

虽然人类看不到紫外线，但紫外线敏感性在一些动物中很常见（Tovée 1995）。在昆虫、鸟类、鱼类和爬行动物中发现了紫外线敏感性（Marshall、Jones等人，1996年；Neumeyer和Kitschmann，1998年；Cuthill、Partridge等人，2000年；Briscoe和Chittka，2001年）。生态环境中的紫外线视觉研究主要集中于物种特异性信号和配偶选择（Bennett，Cuthill et al.1996；Bennett，Cuthill et al.1997；Pearn 2001；Cummings，Garc et al.2006）。然而，很少有研究关注紫外线信号在吸引蜜蜂到兰花上的作用。先前的研究表明，紫外线反射蟹蛛的存在会吸引蜜蜂到雏菊上（Heiling，Herberstein et al.2003）。在一项类似的研究中，澳大利亚本土蜜蜂（Austroplebia australis）被吸引，但没有在有紫外线反射的蟹蛛的花朵上降落（Heiling和Herberstein 2004）。然而，紫外光信号在兰花中的作用还没有得到很好的研究。特别是，目前还不知道紫外线信号是否对吸引天真的蜜蜂食用欺骗性的兰花很重要。因此，了解紫外线信号是否也能吸引天真的授粉者到虚假的花朵上，从而了解虚假的授粉，这将是非常有用的。

目的

该项目将在膜翅目视觉系统的背景下，研究澳大利亚花朵的颜色多样性，澳大利亚本土蜜蜂（Trigonacarbonaria）的固有颜色偏好及其与食物欺骗兰花（Caladenia carnea）的相互作用。本研究旨在解决以下问题：

膜翅目视觉和澳大利亚的花色之间有联系吗？

澳大利亚本土蜜蜂（Trigonacarbonaria）是否具有先天的颜色偏好？

3、食物欺骗型兰花（Caladenia carnea）是否利用了胡卢巴固有的颜色偏好

方法

第1部分。膜翅目视觉和澳大利亚的花色之间有联系吗？

澳大利亚本土植物花卉的采集和光谱反射函数

澳大利亚本土花卉采集自Balwyn的Maranoa花园（melway ref 46 F7）。由于澳大利亚各地物种的多样性，选择了马拉诺亚花园。从5月到1月，每月采集一次花朵。

这朵花拍了一张彩色照片以供鉴定。我还使用带有校准紫外-可见灰度的数码紫外相机【Fuji Finepix Pro S3 UVIR改良CCD用于紫外成像】拍摄了所有花朵的紫外照片（Dyer，Muir et al.2004）。由于紫外线对人眼是看不见的（Menzel和Blakers 1976；Dyer 2001），这张照片可以通过分光光度计测量花朵的任何紫外线反射面积（Indsto、Weston等人，2006）。

使用分光光度计（S2000），将PX-2脉冲氙光源连接到运行Spectrasite软件（美国佛罗里达州达尼丁Ocean Optics Inc.）的PC上，从300到700 nm计算花朵的光谱反射函数。使用分光光度计将花的颜色量化为波长。白色标准是一种新压制的干硫酸钡颗粒，用于校准分光光度计。每种植物至少有三朵花用于每种光谱分析。我评估了来自澳大利亚开花植物的111个光谱测量样本，包括具有代表性的各种植物科（图2）。

不同植物花的光谱反射函数与蜜蜂毛状视觉的相关性

为了了解膜翅目视觉和澳大利亚本土花卉之间是否存在联系，我使用了Chittka和Menzel（1992）使用的方法。在这项研究中，奇特卡和门泽尔寻找了不同植物花朵的花谱锐步和蜜蜂的毛状视觉之间的相关性。锐步是光谱波长的快速变化（Chittka和Menzel 1992）（锐步示例见图3）。这些步骤跨越不同的受体，从而产生从背景中脱颖而出的鲜艳颜色。此外，如果锐利的步幅与视觉系统中受体的重叠相匹配，则传粉者将更容易区分颜色信号。因此，花波长的主要特征是一个锐步。在这项研究中，我定义了一个尖锐的步骤，即在小于50 nm的蜜蜂视觉光谱中，反射率的变化大于20%。正如Chittka和Menzel（1992）所描述的那样，斜率的中点是由视力决定的，因为曲线的性质因每朵花而异。计算了每个花光谱中锐步的绝对数量。频率如图4b所示。由于杂交植物是由人类人工选择的，因此杂交花卉不包括在分析中。

生成六边形颜色空间

为了评估蜜蜂是如何看到花的颜色的，我在六边形颜色空间中绘制了花的颜色位置。颜色空间是昆虫颜色感知的数字表示，适用于范围广泛的膜翅目物种（Chittka 1992）。在颜色空间中，两种颜色物体的位置之间的距离与昆虫区分这些颜色的能力有关。为了形成颜色空间，需要彩色物体的光谱反射率以及昆虫的受体敏感性。

对于胡卢巴属carbonaria，确切的光感受器目前尚不清楚，但膜翅目三色视觉在物种间非常相似，因为彩色光感受器在系统发育上是古老的（Chittka 1996）。因此，可以使用Dyer（1999）所述的维生素A1视觉模板（Stavenga，Smits等人，1993）来模拟膜翅目动物的视觉。然后，我使用奇特卡（1992）解释的方法，根据紫外线、蓝色和绿色受体敏感性（Briscoe和Chittka 2001），预测大脑如何处理这些颜色信号，方法是使用每朵花的平均反射率，并计算光感受器激发（E）值。花光谱的UV、蓝色和绿色E值被用作坐标，并绘制在颜色空间中（Chittka 1992）。蜜蜂感知的色差是通过颜色六边形空间中两个物体位置之间的欧几里德距离计算的（Chittka 1992）。

根据蜜蜂的感知模拟澳大利亚花朵颜色的分布

我使用Chittka，Shmida等人（1994）的方法，根据蜜蜂的颜色感知，分析了最常见的花朵颜色。我在颜色空间中绘制了澳大利亚花朵的颜色（图5a）。颜色空间是蜜蜂颜色感知的图形表示。在颜色基因座的分布上放置一个10度扇形的径向网格，并计算每个扇形内的花色基因座数（图5b）。

第2部分。澳大利亚本土蜜蜂（Trigonacarbonaria）是否有天生的颜色偏好？

昆虫模型和外壳

Trigonacarbonaria是一种澳大利亚本土无刺蜜蜂，生活在4000-10000个个体的蜂群中（Heard 1988）。在野外，无刺蜜蜂生活在树内的洞穴中（Dollin，Dollin等人，1997）。胡卢巴的社会结构与蜜蜂相似（Wille 1983）。它们在澳大利亚东北部很常见，是几种主要商业作物的潜在重要传粉者（Heard 1999）。Tim Heard博士（CSIRO昆虫学，120 Meiers Rd，Indooroopilly 4068，Australia）在其论文（1988）中描述了一个碳孢锥虫研究群体（约4000名成虫和800名觅食个体）的繁殖，以进行实验。蜜蜂是在实验室条件下饲养的，因此以前没有接触过花。在这项研究中，将一个蜂群放置在松树巢箱（27.5 x 20 x 31 cm；LWH）中，并通过一个16 cm的有机玻璃管连接到觅食场，其中包含单独的百叶窗以控制蜜蜂的移动。

2009年7月至2010年1月，所有实验室实验均在莫纳什大学克莱顿生物科学学院的控温实验室（CTL室G12C，尺寸3 x 5m）进行。相对湿度（RH）设定为30%，温度设定为27°C（SPER Scientific Hydrometer，Arizona，USA），因为这一设定大致符合昆士兰昆虫传粉者的条件（Heard和Hendrikz 1993）。照明（10/14小时昼夜）由四个Phillips Master TLS HE slimline 28W/865 UV+日光荧光灯管（荷兰）提供，配有专门安装的高频（>1200Hz）ATEC Jupiter EGF PMD2x14-35电子可调光镇流器，该镇流器与三色膜翅目的日光条件非常匹配（Dyer和Chittka 2004）。飞行竞技场（1.2 x 0.6 x 0.5m；LWH）由带层压白色木质侧板的涂层钢架制成。竞技场的地板被漆成绿色，竞技场的盖子被紫外线透明的有机玻璃覆盖。实验从下午1点到下午3点进行，以控制一天中的时间，因为这是蜜蜂最活跃的时间（Heard和Hendrikz 1993）。

培训前

蜜蜂习惯于在飞行竞技场上飞行七天。最初，天真的觅食者（即从未见过真花或假花的蜜蜂）经过预先训练，可以在三个有益的铝砂圆盘（直径25 mm）上在飞行场地觅食，中间放置10μl的15%（w/w）蔗糖溶液。这些圆盘被放置在垂直的塑料圆柱体上（直径=25 mm，高度=100 mm），将其升高到飞行场地的地板之上，以便蜜蜂学会飞到圆盘上。预先训练可以让蜜蜂习惯于参观人造花进行进一步的实验。铝砂光盘被选为“中性”刺激物，因为它们在蜜蜂的光谱视觉范围内具有均匀的光谱反射曲线，见图6。这些训练盘上的蔗糖溶液奖励在被觅食的蜜蜂消耗后，用移液管重新填充。这些训练盘的空间位置是伪随机的，因此蜜蜂不会学会将特定位置与奖励联系起来。在数据收集之前，蜜蜂被允许至少两个小时在训练前的磁盘上觅食

固有颜色偏好测试

为了测试天真蜜蜂天生的颜色偏好，我用模拟天然花朵颜色的人造花朵对天真蜜蜂进行了同时选择实验。在原来的飞行竞技场上，铝制奖励盘被十个无回报的彩色人造盘所取代。人工花刺激物从HKS-N系列标准化彩纸（德国H.Schmincke公司Hostmann Steinberg K+E Druckfarben）上剪成圆形（直径70 mm）。在每个实验中，使用相同的10种测试颜色（1N-淡黄色、3N-饱和黄色、21N-浅粉红色、32N-粉红色、33N-紫色、50N-蓝色、68N-绿色、82N-棕色、92N-灰色、92N-白色背面）。选择这些颜色是因为它们已用于其他膜翅目昆虫的固有颜色实验（Giurfa，Núñez et al.1995；Kelber 1997；Gumbert 2000），并且这些颜色也广泛用于其他蜜蜂颜色实验（Giurfa，Vorobyev et al.1996）。

彩色纸盘被放置在垂直的塑料圆筒上（直径=15 mm；高度=50 mm），以将其提升到飞行场地的地板之上。竞技场的大门被关闭，以确保每次试验中使用的蜜蜂与下一次试验分开。记录一小时内着陆次数和接近刺激的次数。每次试验大约使用200只蜜蜂。人工花的空间位置每15分钟以平衡方式进行伪随机。每次试验后，将彩色圆盘晾干并用纸巾擦拭，以去除可能影响蜜蜂实验的气味痕迹（Schmitt和Bertsch 1990；Giurfa和Núñez 1992）。我在将用过的蜜蜂从系统中移除后进行了后续的每一次试验，以确保下一次试验中的蜜蜂被天真的觅食者所取代。

众所周知，颜色的感知会受到背景颜色的影响（Lunau，Wacht et al.1996）。因此，我还测试了灰色和黑色等其他背景色的颜色选择。结果在质量上相似（图8b），因此后续分析仅使用来自生物相关绿色背景的数据。

颜色刺激分析

由于蜜蜂看到的颜色与人类不同，我根据五个参数对刺激进行了量化：波长、亮度、纯度（饱和度）、与背景的色度对比度和绿色受体对比度。通过追踪从颜色六边形中心穿过刺激位置到相应光谱轨迹波长的线来计算主波长（Wyszecki和Stiles 1982）。亮度测量为UV、蓝色和绿色受体激发值的总和（Spaethe、Tautz等人，2001年）。刺激的光谱纯度通过刺激相对于光谱轨迹末端的百分比距离计算（Chittka和Wells 2004）。色度对比度计算为颜色刺激与颜色六边形中心相对于背景的距离。色彩对比很重要，因为感知可能会受到背景颜色的影响（Lunau、Wacht等人，1996年）。绿色受体对比度测量为相对于背景的刺激物的绿色受体激发（Giurfa，Núñez et al.1995）。这种对比是相关的，因为绿色受体和绿色对比已知会影响蜜蜂的运动（Srinivasan，Lehrer等人，1987年）。

统计分析

使用单因素方差分析（ANOVA）和事后Tukeys HSD检验（α=0.05）（Quinn和Keough 2002），以着陆次数为因变量，刺激波长为自变量，研究了波长对三角藻着陆次数的影响。使用Spearman对选择的秩相关检验分析刺激的亮度、纯度（饱和度）、背景色对比度和绿色受体对比度。使用R统计和图形环境进行统计分析（R开发核心团队，2007年）。统计显著性设为P≤0.05.

第3部分。一种食物欺骗型兰花（Caladenia carnea）是否利用了三棱草固有的颜色偏好？

工厂模型

卡拉德尼亚是一种分布广泛的物种，常见于澳大利亚东部。兰花的颜色变化很大，从粉红色到白色不等。它是由澳大利亚本土的三角种蜜蜂授粉的（Adams和Lawson 1993）。这种兰花颜色鲜艳，香味浓郁，通过模仿食物来授粉（Adams和Lawson 1993）。因此，由于兰花的颜色变化，卡内阿是一个很好的模型，可以用来研究潜在传粉者的花开发。卡拉德尼亚卡内亚花卉由澳大利亚本土兰花协会的私人种植者提供。

胡卢巴能感知到卡拉德尼亚卡尼亚的粉红色和白色花朵之间的差异吗？

对粉色和白色的卡拉德尼亚花进行了比色分析，以研究不同颜色的兰花是否会被视为与蜜蜂的视觉系统相似或不同。使用分光光度计对每种花的颜色进行四次测量（粉红色和白色）。分析中使用的实际测量值是每种颜色的平均值（Dyer，Whitney et al.2007）。为了预测昆虫传粉者区分不同花朵的概率，将这些光谱绘制为六边形颜色空间中的基因座（Chittka 1992）（见“六边形颜色空间”方法）。

选择实验

我进行了试验，测试了蜜蜂对白色和粉色卡拉德尼亚卡尼亚花的偏好。每次试飞都在飞行竞技场内进行。试验中使用的每一朵白色和粉红色的花大小相匹配，放入单独的塑料容器中（直径=5 cm，高度=5 cm），并放置在花心之间距离为10 cm的竞技场中。每个容器都覆盖着GLADY WrapTM（美国加利福尼亚州Oaklands的Clorox公司），以去除嗅觉线索，因为它们影响蜜蜂的选择行为（例如Pelz、Gerber等人，1997年；Laska、Galizia等人，1999年）。每次试验约有50只蜜蜂进入竞技场。蜜蜂在4厘米的距离内第一次接触到欢乐包裹物，被记录为该气流的选择（Dyer，Whitney et al.2007）。着陆次数记录在花上五分钟。每次试验后，都会更换GLADY包装纸，以防留下气味痕迹。此外，对单个花朵和空间位置进行随机分组。每次试验后，都会处死个别蜜蜂，以避免伪复制。

紫外线信号会影响蜜蜂对兰花的吸引力吗？

为了研究背萼片的紫外线反射是否会影响蜜蜂的反应，我让蜜蜂在两种白色兰花之间进行选择，一种有紫外线信号，另一种没有（N=16）。通过在背萼片上涂抹一层薄薄的防晒霜（Hamilton SPF 30+，Adelaide，SA，Australia），去除紫外线信号。进行光谱反射率测量，以确保防晒霜防止紫外光（395 nm以下）从萼片反射，并且不会改变兰花的反射特性。此外，对兰花萼片的光谱测量证实，这种箔片可以穿透300 nm以上的所有波长的光，并且不会掩盖花朵的反射率。

蜜蜂在选择粉色和白色兰花时是否会表现出偏好？

为了评估蜜蜂是否喜欢粉色或白色的兰花变体，我让蜜蜂同时选择粉色或白色的花朵（N=16）。参见选择测试程序。

蜜蜂是否因花色的不同而习惯于无回报的兰花？

我进行了一个两阶段的实验，调查蜜蜂是否能够随着时间的推移学会习惯于没有回报的花的颜色，以及蜜蜂是否会根据之前遇到的花的颜色来调整随后的花的选择。在实验的第一阶段，给本地蜜蜂呈现一朵花，白色或粉红色。鲜花被放在一个装有保鲜膜的容器里。在比赛开始时和30分钟时分别记录了对花的降落。在第二阶段，第1阶段的花被换成了新的花的颜色，着陆次数被评分为5分钟。在每次试验后，花朵被随机分组，并更换保鲜膜以防止出现气味痕迹。同样，每次实验只使用一次蜜蜂。

统计分析

对于实验2、3和4，使用双尾配对t检验比较了天真蜜蜂对花的着陆次数。采用双因素方差分析法，分析蜜蜂是否根据花的颜色差异习惯于无回报的兰花。因变量是着陆次数，两个自变量是以前的花颜色和新花颜色。

3、结果

第1部分。膜翅目视觉和澳大利亚的花色之间有联系吗？

不同植物花的屈折曲线与膜翅目毛状视觉的相关性

对澳大利亚花朵111条光谱反射曲线的分析表明，膜翅目昆虫对光谱差异最敏感的波长处会出现明显的台阶（图4b）。有三个明显的尖峰（图4b）。众所周知，膜翅目毛垫对400和500 nm左右的光谱差异都很敏感（Menzel和Backhaus 1991；Peitsch，Fietz et al.1992）。因此，如蜜蜂（Helversen 1972）的反Δλ/λ函数（图4a所示的实心曲线）所示，膜翅目毛垫可以很好地区分400和500 nm处的峰值，这是一个经验确定的阈值函数，它显示了蜜蜂视觉系统最能辨别颜色的电磁函数区域。总之，毛状膜翅目受体的光谱位置与澳大利亚花朵光谱的阶跃相关。

蜜蜂感知的澳大利亚花卉颜色分布

花的颜色基因座强烈聚集在颜色六边形中（图5a）。在蜜蜂的感知中，蓝绿色的花是最常见的，而纯紫外线的花是最罕见的（图5b）。

第2部分。澳大利亚本土蜜蜂（Trigonacarbonaria）是否有天生的颜色偏好？

亮度、光谱纯度、色度对比度和绿色受体对比度对颜色选择的影响

刺激亮度对选择频率没有显著影响（rs=0.333，n=10，p=0.347；图7a）。光谱纯度对选择频率没有显著影响（rs=0.224，n=10，p=0.533；图7b）。颜色对比度对选择频率没有显著的相关影响（rs=0.042，n=10，p=0.907；图7c）。绿色受体对比度对选择频率没有显著影响（rs=0.0.552，n=10，p=0.098；图7d）。

波长对颜色选择的影响

刺激物的颜色绘制在图8a中，因为它们对人类观众来说是为了让读者理解颜色选择之间的相关性。然而，由于蜜蜂和人类的视觉感知不同，所有的统计分析都是使用绘制为波长的刺激进行的（Kevan，Chittka等人，2001）。波长对三角藻的登陆次数有显著影响（单因素方差分析，F9110=5.60，P<0.001），图8a。Tukey的事后测试显示，437 nm的波长（对人类观众来说是白色，但对蜜蜂的视觉系统来说是强烈的颜色，因为这种刺激不会反射紫外线辐射）比528 nm（棕色）（P<0.01）、432 nm（灰色）（P<0.01）、431 nm（浅粉色）（P<0.01）、420 nm（紫色）（P<0.01）的其他波长有明显更高的着陆，455 nm（蓝色）（P=0.0196）和535 nm（绿色）（P=0.0266）。此外，波长为530 nm（浅黄色）（P=0.0321）和422 nm（粉红色）（P=0.0318）的圆盘的着陆次数明显高于432 nm（灰色）（图8a）。

第3部分。一种食物欺骗型兰花（Caladenia carnea）是否利用了三棱草固有的颜色偏好？

胡卢巴能感知到卡拉德尼亚卡尼亚的粉红色和白色花朵之间的差异吗？

紫外线照片和反射率测量表明侧萼片与背萼片不同（图9）。粉红色和白色侧生萼片的光谱表明没有紫外线反射。相反，背侧萼片的光谱显示在UV区域（320-400 nm）的反射（图9b）。图10显示了六边形颜色空间中各花朵光谱的轨迹。Dyer和Chittka（2004）表明，随着花朵和干扰物花朵之间色差的增加，蜜蜂觅食造成的错误也会减少（图11）。白色和粉色花朵之间的颜色距离以六边形单位测量（欧几里德颜色度量）；表1：。粉红色和白色花的侧生萼片（UV-）之间只有0.082个六边形单位，而粉红色和白色背生萼片（UV+）之间只有0.039个六边形单位。因此，蜜蜂可以区分粉红色和白色的侧生萼片。相反，粉色和白色的背萼片（UV+）在视觉上与蜜蜂相似。因此，可以以70-90%的准确度来区分白花和粉红花（图11）。这意味着访问白色/粉色花朵可能会导致偶尔的传粉者感知错误（1-3个错误/10次访问）。

紫外线信号会影响蜜蜂对兰花的吸引力吗？

当蜜蜂在两朵白色兰花中进行选择时，一朵有紫外线信号，另一朵没有紫外线信号，蜜蜂明显偏爱有紫外线反射的花（配对t检验：t=6.949，df=15，p<0.001，n=16；图12）。

蜜蜂在选择粉色和白色兰花时是否会表现出偏好？当受试者在粉红色和白色两种花色之间进行选择时，他们对白色花有明显的偏好（配对t检验：t=-3.484，df=15，p=0.003，n=16；图13）。

蜜蜂是否因花色的不同而习惯于无回报的兰花？

发现蜜蜂习惯于无回报的花朵，因为对于白色（配对t检验：t=8.34，df=15，p<0.001）和粉红色的花朵（配对t检验：t=8.11，df=15，p<0.001），三棱花在第一时间阶段（T1）对花朵的平均降落次数与第二时间阶段（T2）显著不同（图14）。习惯化率因花的颜色不同而不同，因为三角花对白花的平均降落次数明显高于粉红色花（配对t检验：t=3.59，df=15，p=0.003，图14）。我还研究了delta，它是分别计算粉红色和白色花朵在第一和第二时间阶段着陆之间的变化率。因此，发现蜜蜂对粉红色花朵的适应速度更快，因为变化率显著不同（配对t检验：t=3.94，df=15，p=0.001）。

一朵花的着陆次数被发现显著受先前花颜色和新花颜色之间相互作用的影响（双因素方差分析，F3,28=6.846，p=0.001，图15）。当第二朵花的颜色与前一朵花的颜色相同时，落地与第二朵花没有显著差异（F1,14=4.332 p=0.056）。相反，当第二朵花的颜色与前一朵花的颜色不同时，发现落地与第二朵花显著不同（F1,14=9.168 p=0.009）（图15）。

此外，偏好取决于蜜蜂之前接触的颜色。当前一朵花为白色时，第二朵花为粉红色或白色时，没有发现显著差异（F1,14=5.332，p=0.230）。相反，当前一朵花的颜色为粉红色时，第二朵花的着陆率明显高于新的粉红色花（F1,14=8.395，p=0.012，图15）。在这方面，蜜蜂正在根据之前的开花经验调整对第二朵花的选择。

4、讨论

膜翅目视觉和澳大利亚花色。

该项目的第一部分旨在研究膜翅目视觉与澳大利亚花色多样性之间的可能联系。我的结果表明，膜翅目的辨别阈值与澳大利亚的花色相匹配。这些结果与Chittka和Menzel（1992）的研究一致，他们发现不同花朵的花朵光谱与膜翅目在欧洲和中东部分地区采集的花朵的毛状视觉之间存在相关性。

我在澳大利亚也发现了类似的模式，所以这一数据高度暗示，膜翅目似乎是澳大利亚花朵进化的主要贡献者。由于蜜蜂的视觉早于花朵颜色的进化（Chittka 1996），一种可能性是澳大利亚本土花卉最初可能是为了利用膜翅目物种的视觉而进化的。另一种选择是，当前花色的存在是由于花色中色素的系统发育限制（Menzel和Shmida 1993）。

进化出的花朵颜色分布与世界其他地区的分布极为相似，例如欧洲和中东，那里蜜蜂是主要的传粉者（图4a和b、5b和c）。在蜜蜂看来，蓝绿色的花朵是最常见的，而纯紫外线的花朵在取样的花朵中最为罕见（图5b）。这一结果与之前在欧洲和中东发现类似蓝绿色花朵簇的研究相似（Chittka，Shmida et al.1994）。在该研究中，有人认为，这一集群可能是由昆虫对某些颜色的先天颜色偏好所解释的（Chittka、Shmida等人，1994年）。然而，其他研究反驳了这一点，因为天真和有经验的蜜蜂更喜欢紫外蓝色和蓝色，而不是蓝绿色（Menzel 1967；Giurfa，Núñez et al.1995）。

然而，蓝绿色花朵的分布大于紫外蓝色和蓝色花朵的分布。因此，Chittka（1997）认为，这种分布可能是由花色素的进化限制引起的。另一种解释为什么花的颜色在颜色空间中分布不均匀的理论可能是由于复杂环境中的颜色恒定性（蜜蜂只访问一种花类型）（Dyer 1999；Dyer和Chittka 2004）。因此，由于澳大利亚的花色没有相等的颜色间隔，而且蓝绿色花朵的比例较高，这可能与花朵的繁殖限制或重要传粉昆虫（如膜翅目）的选择压力有关。

关于澳大利亚的花色是否独立于欧洲和中东的花色演变，有两种可能的情况。首先，被子植物是在澳大利亚与冈瓦纳大陆分离后进化而来的。因此，平行进化可能发生在膜翅目毛状视觉选择相似花朵颜色的地方。第二种可能的情况是，被子植物在澳大利亚从冈瓦纳大陆分离出来并辐射到所有大陆之前就已经进化了。

所以，开花植物随着陆地的移动而漂移，并以类似于欧洲和中东花卉的方式进化。根据Kevan和Backhaus（1998）的研究，情景1在这方面似乎更有可能是独立的，因为澳大利亚的花朵进化可能是独立的，他们估计早期被子植物最有可能是淡黄色的花粉，后来进化出高颜色的信号来吸引重要的传粉媒介。据估计，最早的被子植物化石可追溯到1.32亿年前（mya），大约在早白垩世（Crane，Donoghue et al.1989；Crane，Fris et al.1995）。白垩纪末期，澳大利亚与冈瓦纳大陆分离（Rich and Rich 1993）。然而，时间尺度太不精确，无法最终解决这个问题。为了理解这个问题，还需要关于生物地理关系的额外数据，以及这与非洲、南美、亚洲和北美等其他大陆的植物反射率数据的关系。

蜜蜂觅食的成功取决于色觉受体能否可靠地将花卉物种彼此区分开来（Chittka和Menzel 1992）。如果传粉者能够将花朵与周围的背景区分开来，就可以提高其觅食效率，这对双方都是有利的；如果这种植物与周围环境不同，则更有可能被授粉（Chittka和Menzel 1992）。众所周知，蜜蜂在400和500纳米时能最好地辨别颜色刺激（Helversen 1972）。那么，为什么我们在600 nm处看到第三个峰值（图4b）？一个原因可能是生物材料（包括叶子）反射600 nm以上的红外辐射（Chittka，Shmida等人，1994年）。还有一种可能性是，具有红色受体的昆虫，如蝴蝶和甲虫（Menzel和Backhaus 1991；Peitsch，Fietz et al.1992），也可能是影响某些澳大利亚花色进化的重要授粉媒介。目前，澳大利亚国内关于长波长敏感受体昆虫视觉的信息很少，但这将为未来的研究提供一条有趣的途径。

不要通过专门挑选只由膜翅目昆虫授粉的物种来偏向我的数据集，这一点非常重要。因此，我采取了一种广泛的方法，将采样点上可用的每一种开花植物物种都包括在内，以最好地代表已经进化的澳大利亚开花植物的颜色分布。这使我能够测试膜翅目昆虫的颜色视觉是否是影响花卉颜色进化的主要驱动力。尽管数据集包含了广泛的植物样本（其中一些甚至可能不会被膜翅目昆虫授粉），但检测到了强烈的模式，这表明膜翅目昆虫可能是影响花颜色进化的主要因素。

澳大利亚本土蜜蜂天生的颜色偏好

在该研究的第二部分中，使用人工荧光笔测试了10种不同颜色的纯种蜜蜂（Trigonacarbonaria）的同时选择。每次测试后，都会牺牲蜜蜂，这样所有数据都是独立的，避免了伪复制的风险。此外，在颜色测试之前，蜜蜂没有接触到真正的花朵，而是在颜色中性的圆盘上饲养（图6）。因此，他们的行为可以归类为先天行为（Giurfa，Núñez等人，1995年）。有必要预先训练蜜蜂降落在铝盘上，因为如果没有事先的训练，蜜蜂不可能降落在颜色刺激物上（Giurfa，Núñez等人，1995年）。我还测试了蜜蜂是否喜欢亮度、光谱纯度、对比度和绿色受体对比度等刺激。我的结果表明，无论亮度、光谱纯度、对比度和绿色受体对比度如何，蜜蜂都更喜欢刺激物（图7）。这与Giurfa、Núñez等人1995年的研究结果一致。因此，影响蜜蜂选择的唯一重要因素是波长。

结果表明，三棱草对422、437和530 nm的波长具有先天偏好（图8b）。这些结果与欧洲纯花蜜蜂和大黄蜂的先天偏好非常相似（Menzel 1967；Lunau 1990；Giurfa，Núñez et al.1995），它们天生偏爱蓝色和紫色。在这些研究中，有人提出，与欧洲其他花色相比，天生偏爱蓝色与蓝色和紫色花朵的花蜜回报略高相关（Giurfa，Núñez et al.1995；Chittka，Ings et al.2004）。同样地，我假设三棱花的这些先天偏好可能与澳大利亚花朵的颜色相对应，而这些颜色对蜜蜂更有利。因此，未来的研究可能希望寻找澳大利亚本土花朵中的花蜜量与不同颜色类别之间的相关性，以了解花蜜含量是否可以微调澳大利亚无刺蜜蜂的颜色偏好。

澳大利亚无刺蜜蜂与食物欺骗兰花的相互作用

在第三部分中，结果表明蜜蜂喜欢有紫外线信号的花，而不喜欢没有紫外线信号的花（图12）。这一结果与Peter和Johnson（2008）的研究结果一致，他们使用防晒霜去除了花朵的紫外线成分，从而减少了授粉者的访问次数。以类似的方式，卡尼亚蜜蜂的紫外线信号可能对吸引天真的蜜蜂到花上很重要。

撇开紫外线信号不谈，我发现蜜蜂也非常喜欢白色的花，而不是粉红色的花（图13）。这一结果与我研究的第二部分相一致，在第二部分中，我发现三角草对某些颜色表现出与生俱来的偏好。这可能会导致兰花的适应性差异，这取决于兰花的颜色。在这里，负频率依赖性选择可能很重要，因为传粉者访问较罕见的形态，这样做有助于保持花的颜色变化（Smithson和Macnair 1997）。例如，发现负频率依赖性选择会影响三叶指根的花颜色变化（Gigord，Macnair et al.2001），在那里，更常见的是罕见的形态。以类似的方式，我的系统中可能会发生与频率相关的负选择，但需要更多关于自然场条件下两种颜色频率的信息。

我的研究结果还表明，蜜蜂能够根据颜色习惯花朵（图14）。这一结果与Simonds和Plowright（2004）的研究类似，他们发现大黄蜂习惯于给纸片和图案上色，随着时间的推移，着陆次数会减少。在这项特别的研究中，有人认为“疲劳”可能是蜜蜂习惯于色盘的原因。另一种可能性是，蜜蜂正在通过联想学习来习惯于无回报的花朵诱饵的存在。这种可能性与黄蜂的反应一致，黄蜂被性欺骗的兰花用作传粉者（Wong和Schiestl，2002年；Wong，Salzmann等人，2004年）。在这些研究中，发现雄性很快就学会了没有回报的花的存在，避免了花和它们以前被欺骗的地方。

有趣的是，我发现，如果蜜蜂天生喜欢一种颜色，那么新引进的花朵的落地次数就会增加，从而抵消了对无回报兰花的习惯化效应。因此，卡尼亚锦鸡儿中存在多种花色，这似乎是合理的，因为它们的传粉者很难将特定的颜色与无价值的花联系起来，从而对兰花产生健康影响。在自然界中，一种奖励较少的兰花被天真的传粉者获得的访问次数也取决于生态因素，如开花时间以及其他奖励植物的可用性。因此，进一步的研究可能会考虑到这些因素。同样重要的是要指出，这项研究只研究了视觉线索。在自然界中，传粉者可以从各种视觉和嗅觉线索中获得和评估有关其环境的信息（Kunze和Gumbert，2001）。

哪个线索对传粉者的决定有更大的影响，这个问题值得进一步研究，并为未来研究食物欺骗兰花提供了有趣的途径。小组学习行为可能发生在习惯化实验中。例如，以前的研究表明，昆虫可以通过传递社会信息进行学习（Worden和Papaj 2005；Leadbeater和Chittka 2007）。例如，大黄蜂工作者可以通过观察他人来学习（Worden和Papaj，2005）。然而，无法控制群体学习行为，因为在试点研究中，隔离测试的蜜蜂根本没有反应。然而，为了尽量减少小组学习的影响，蜜蜂只使用一次，每次试验后都被移除，以便每个重复都是独立的。

此外，虽然在我的研究中，我用保鲜膜控制了花香，但无法控制花的形状。在这方面，蜜蜂也可以根据形状进行偏好（Dafni，Lehrer等人，1997年；Kunze和Gumbert 2001年；Galizia，Kunze等人，2005年）。在我的实验中，兰花的萼片在形状上有细微的变化（例如宽度）。然而，为了控制这一点，花的形状完全随机。此外，有证据表明，由于蜜蜂的空间视觉敏锐度较低，形状上的细微差异实际上可能不会被蜜蜂察觉（Land 1997；Land 1999）。然而，将来测试形状偏好将是一件有趣的事情。

结论和未来方向

在第1部分中，我发现膜翅目昆虫的辨别阈值和澳大利亚的花朵颜色相匹配，蜜蜂似乎是澳大利亚花朵进化的主要贡献者。在第二部分中，我发现胡卢巴对422、437和530 nm的波长有天生的偏好，这可能对应于对蜜蜂更有利的澳大利亚花朵颜色。在第3部分中，我发现蜜蜂能够根据颜色来适应兰花（与第2部分中获得的数据一致）。然而，证据也表明，花的颜色变化可能是卡尼亚兰的一个重要策略，以对抗蜜蜂学习和避免无回报的花诱饵的能力。

这项研究突出了一些领域，在这些领域中，未来的研究可以促进我们对利用花朵开发蜜蜂颜色视觉的理解。迄今为止，大多数研究都集中在欧洲的蜜蜂和花卉上，令人惊讶的是，很少有研究关注澳大利亚蜜蜂和花卉之间的相互作用。我的研究强调了在澳大利亚开展进一步研究的重要性，这可能会揭示植物传粉者关系的一般生态、生物地理和进化模式。

确认书

我的上司阿德里安·戴尔和鲍勃·黄。Adrian感谢您的无限支持和耐心，分享您对色觉科学这一激动人心的领域的知识，并将我的思维扩展到知识的边界之外。Bob感谢您出色的指导、反馈、时间和鼓励。你们两位激励我以极大的热情探索这个话题。在他们的领域里，两位拥有正确技能的专家的鼎盛时期，使我在今年做了这么多。我希望你们两个一起监督许多荣誉学生，因为这个项目已经打开了许多探索的大门。维拉·西蒙诺夫（VeraSimonov），感谢她作为我的领域和研究助理，与我谈论研究以外的事情。Andreas Svensson，寻求统计数据方面的帮助。梅勒妮·诺盖特，谢谢你的建议和鼓励。行为生态学实验室小组，所有的想法和建议都是无价的。感谢詹姆斯、肯、莱尼、尼基、温迪和玛丽安阅读我的各种论文草稿。

Mani Shrestha和Dick Thomson，感谢他们让我接触到兰花协会。卡拉德尼亚卡尼亚花卉由澳大利亚本土兰花协会（维多利亚集团）的理查德·奥斯汀（RichardAustin）和拉塞尔·马森（RussellMawson）提供。蒂姆·赫德和CSIRO为蜜蜂提供食物。保罗·伯奇（PaulBirch）和安德里亚·丹尼斯（AndreaDennis）是马拉诺亚花园（Maranoa gardens）的园丁，他们让我采集花朵样本，并提供有关马拉诺亚花园植物区系的口头信息。

我的同学们，特别是艾玛·詹森和凯特·拉奇尔，对学生们分享想法、压力和所有的笑声表示敬意。我希望我们能成为好朋友。Alanna、Kirsten、Mez、Wendy和Vera，感谢你们的激励、支持和组织郊游，让我远离研究。最后还要感谢妈妈、爸爸、莱尼、哈利和露西，感谢他们对我的照顾，感谢他们理解荣誉年确实是一个隐士年，但这是一个伟大的一年！再次感谢大家为本年度取得巨大成功！