高产耐热α-淀粉酶芽孢杆菌的生长条件优化

摘要：

耐热α -淀粉酶在斯里兰卡的商业工业应用中占有非常重要的地位。因此，本研究的主要目的是鉴定优质芽孢杆菌菌株并优化可产生高α-淀粉酶产量的生长条件。三种芽孢杆菌菌株，解淀粉芽孢杆菌ATCC 23350、地衣芽孢杆菌ATCC 14580 和巨大芽孢杆菌ATCC 14581 用于该研究。进行摇瓶培养实验，以确定各种发酵条件如生长温度、培养时间、碳源、氮源、初始pH和碳浓度对细胞外的影响。α-淀粉酶的产生。进行 DNSA 测定以确定酶活性。据报道，地衣芽孢杆菌的酶活性最高温度为85°C，其次是解淀粉芽孢杆菌为 75 ° C，巨大芽孢杆菌为 45 ° C 。解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌都能够提供其最佳酶在 37 ° C 下生产，而巨大芽孢杆菌在 30 ° C 下以 150rpm 的初始 pH 值为 7 进行生产。地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌在孵育 48 小时后获得最佳酶产量，而巨大芽孢杆菌在孵育 24 小时后产生。在测试的碳源中，木薯淀粉能够产生最高的酶产量。对于解淀粉芽孢杆菌，酶的最高产量是在 2% 的淀粉、胰蛋白胨作为氮源和初始 pH 为 7 的情况下获得的。地衣芽孢杆菌的最大酶产量是在 1.5% 的淀粉、KNO 3作为氮源时获得的源和初始 pH 为 6。对于巨大芽孢杆菌，1% 的淀粉、胰蛋白胨和 pH 7.5 诱导了最佳的 α-淀粉酶产生。根据获得的结果，解淀粉芽孢杆菌是最高耐热性 α 淀粉酶生产者。但是，根据工业要求, B. licheniformis由于其在较高温度下的稳定性，也可用作酶生产者。

关键词

耐高温, α -淀粉酶,芽孢杆菌菌株,发酵,培养期

一、简介

酶作为调节特定生化反应的生物过程的催化剂。酶的主要成分是蛋白质。生物细胞中的几乎所有途径都需要酶来更快地将反应带到其平衡位置并保持反应的显着速率。酶对其底物具有选择性，因此能够确定细胞中发生哪些代谢途径 [ 1 ]。

淀粉酶是最有价值的酶之一，在生物技术中具有重要意义 [ 2 ]。存在三种不同的淀粉酶组，称为α-淀粉酶、β-淀粉酶和葡糖淀粉酶。α-淀粉酶 (EC3.2.1.1) 能够催化淀粉中的内部α -1,4-糖苷键水解成还原糖，例如葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖单元 [ 3 ]。α 淀粉酶是称为葡糖苷酶的一类酶的成员。淀粉降解酶是工业上广泛使用的最重要的酶之一 [ 4 ]。

在工业上使用酶催化剂比使用合成催化剂更有优势。它们比合成催化剂反应更快，并且能够高度特异性地生成所需的产物，因此能够在正常条件下进行高效反应，并热切地用于工业过程以节省能源和资源 [ 5 ]。此外，使用酶催化剂的另一个优势是能够在极端条件下发挥作用。最好的例子之一是耐热酶。

热稳定性是大多数工业酶的理想特性。使用耐热酶的一些优点是被嗜温细菌污染的风险低，由于粘度降低而反应速率更高，冷却成本降低，底物更易溶解以及由于粘度较低而增加混合和泵送[ 6 ] ].

对生物催化剂的突然需求归因于生物技术的进步，这导致了酶技术的快速发展。当前进行的实验旨在改进用于淀粉降解工业过程的耐热淀粉分解酶，并且对于生产有益产品（例如葡萄糖、结晶葡萄糖、葡萄糖浆、麦芽糖和麦芽糖糊精）具有高度重要性 [ 3 ]。

淀粉酶在商业上用于淀粉液化、造纸工业、纺织织物退浆、去除壁纸、酿造工业、从由葡萄糖、麦芽糖和高级低聚糖组成的淀粉生产糖浆、制药和制备冷水溶剂洗衣淀粉[ 4 ] [ 7 ]。此外，淀粉酶的应用扩展到临床、药物和分析化学等许多科学领域[ 8 ]。

淀粉酶由从动物到植物再到微生物的各种生物体产生。微生物来源的α-淀粉酶主要用于工业，因为它们更稳定、更具成本效益，并且可以很容易地进行基因操作以获得所需的产品。此外，使用微生物生产淀粉酶的另一个主要优势是经济的批量生产能力。其中一些还具有产生耐热淀粉酶的能力 [ 9 ]。

这些酶可以通过微生物的优化发酵或通过重组 DNA 技术从快速生长的微生物中克隆基因来产生 [ 10 ]。

培养基的组成和浓度对细菌胞外淀粉酶的生长和分泌起着重要作用。例如，已知碳源、氮源、金属离子和生长培养基的初始 pH 值会影响淀粉酶的产生和生物体的生长 [ 11 ]。用于淀粉酶生产的生长培养基显然应该是提供高胞外淀粉酶产量的培养基。因此，可以根据特定生物体优化生长培养基以实现α-淀粉酶的高产量。

主要采用深层发酵 (SmF) 和固态发酵 (SSF) 来工业规模生产α-淀粉酶 [ 4 ]。在 SmF 中，微生物在糖蜜和肉汤培养物等液体培养基中生长。产物分泌到发酵液中。当收获酶等次级代谢物时，通常使用这种方法 [ 3 ]。这种方法被认为是培养细菌的最佳方法，因为它们需要高水分含量，而固态发酵可以应用于对水分要求低的微生物，如真菌。SmF 的优点是易于灭菌和纯化。还可以轻松控制温度、pH 值、通气、氧气转移和水分等环境因素 [4 ]。

淀粉酶可以由不同种类的微生物产生。然而，对于商业应用，淀粉酶主要从芽孢杆菌属获得，因为芽孢杆菌属的成员可以产生种类繁多的胞外酶。在以往的研究中，已经发现地衣芽孢杆菌[ 12 ]、巨大芽孢杆菌[ 13 ]和解淀粉芽孢杆菌[ 14 ]这三种芽孢杆菌菌株具有产生胞外淀粉酶的能力。因此，本研究选择的芽孢杆菌菌株是解淀粉芽孢杆菌菌株 ATCC 23350，地衣芽孢 杆菌菌株 ATCC 14580 和巨大芽孢杆菌菌株 ATCC 14581，由 MicroBioLogics, Inc. 采购。

由于生产成本高，目前斯里兰卡还没有进行耐高温α-淀粉酶的商业生产。因此，淀粉酶大量进口到国内用于工业应用，将造成巨大的外汇损失。本研究的主要目的之一是确定替代淀粉来源并优化可产生高α-淀粉酶产量的生长条件。

木薯 ( Manihot esculenta ) 被选为酶生产的最佳碳源，主要作为食物或动物饲料种植，在斯里兰卡几乎没有任何工业应用的信息。木薯根淀粉含量高，能抵抗害虫侵袭和干旱，在不利的天气条件下也能获得可接受的产量。木薯的这些趋势使其成为斯里兰卡酶生产行业的良好原料 [ 15 ]。因此，该研究项目的成果将有利于在斯里兰卡开始生产耐热α-淀粉酶产业。

2。材料和方法

2.1. 材料

除非另有说明，否则本研究使用购自 Sigma Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）的分子生物学级化学品。

2.2. 微生物和文化维护

2.2.1. 微生物

解淀粉芽孢杆菌菌株 ATCC 23350、地衣芽孢杆菌菌株 ATCC 14580 和巨大芽孢杆菌菌株 ATCC 14581 获自美国典型培养物保藏中心 (ATCC)。它们被维持在营养琼脂培养基中。

2.2.2. 文化维护

1) 甘油储备培养物的制备

三种芽孢杆菌菌株的培养物在无菌营养肉汤 (NB) 中于 37˚C 和 150 rpm 下培养过夜。为了长期保存目的，通过将 800 μL 指数生长期培养物与 200 μL 100% 甘油混合并储存在 −80˚C 下制备原种培养物。

2) 亚文化的准备

制备亚培养物供实验室使用。来自甘油原液的每种细菌菌株都在营养琼脂平板上划线。生长板在 37˚C 下孵育过夜。每个月准备亚培养物并保持在 4˚C。

2.3. 接种物的制备

通过在无菌条件下使用接种环将细菌生长从新鲜生长的营养琼脂平板的不同单菌落转移到 15 mL 无菌 NB 培养基中来制备接种物。将其在 37˚C 和 150 rpm 的振荡培养箱中孵育过夜。

过夜孵育后，测量 600 nm 处的光密度 (OD) 值，并将 0.5 mL 接种物引入 250 mL 锥形瓶中的 50 mL 相应培养基中，并在 37˚C 和 150 rpm 的振荡培养箱中孵育除非另有说明。每个实验一式三份进行。

2.4. α-淀粉酶活性的测定

2.4.1. 从发酵培养基中提取淀粉酶

从一式三份的每份中取出 1.5 mL 的等分试样。然后，在 Hermle Labortechnik 离心机中以 10,000 rpm 的速度在 4˚C 下离心 10 分钟，然后将无细胞的上清液用作粗酶提取物 [ 12 ]。

2.4.2. DNSA 检测程序

淀粉酶活性通过被称为 3,5-二硝基水杨酸 (DNSA) 测定的方法测量，该测定由 [ 16 ]开发并由 [ 17 ] 修改。淀粉酶测定通过将 0.5 mL 粗酶提取物和 0.5 mL 1% 淀粉溶液（淀粉在 pH 7 的 0.05 M 磷酸钾缓冲液中）的混合物在 55˚C 的水浴中孵育在螺帽试管中进行持续 30 分钟 [ 1 ] [ 18 ]。孵育期结束时，加入 1 mL DNSA 试剂终止反应。然后将反应混合物在沸水浴中保持整整 10 分钟 [ 1]. 试管温度达到室温后，加入蒸馏水定容至 10 mL。每次测定均在螺帽试管中进行，以防止溶液因蒸发而损失。对于空白，加入未接种的培养基代替培养基的上清液。然后，使用 Agilent Cary 100 紫外 (UV) 可见分光光度计，在 540 nm [ 1 ] 处测量空白和测试样品之间的颜色强度差异。

2.4.3. 葡萄糖标准曲线的制定

比色法的标准曲线是用D-葡萄糖溶液绘制的。首先制备 0.01 M 储备溶液。然后，使用蒸馏水制备 11 种不同的稀释液 (0 mg/mL - 1.80 mg/mL)。对于空白，代替葡萄糖溶液，仅加入蒸馏水。然后向每管中加入1mL DNSA试剂，并在沸水浴中保持10分钟。将最终体积调整至 10 mL，并在 540 nm 处获取分光光度读数。

一个酶单位 (U) 定义为在测定条件下每分钟 1 mL 酶上清液释放的葡萄糖微摩尔数。[U·mL -1 =产生的葡萄糖(mg/mL)×1000/孵育期(分钟)×酶体积(mL)×葡萄糖的分子量(MW)(180.16g·mol -1 )]。

2.5. 生长温度对细胞外α -淀粉酶产生的影响

为了确定温度对淀粉酶生产的影响，三种芽孢杆菌菌株在 25˚C、30˚C、37˚C、45˚C、55˚C 和 65˚C 下生长。实验在含有 50 mL NB 培养基的 250 mL 锥形瓶中进行，并接种 0.5 mL 如 2.3 节所述制备的接种培养物。然后在摇动培养箱中以 150 rpm 的转速在各自的温度下培养培养物。在 24 小时 (h)、48 小时和 72 小时后测量生长和淀粉酶产量。通过添加 0.5 mL 无菌 NB 培养基代替接种培养物进行阴性对照 [ 19]. 通过使用 Agilent Cary 100 紫外可见分光光度计在 600 nm 处进行 OD 测量来测量培养基中微生物的生长。进行稀释以使数据保持在线性吸光度范围内。使用未接种的灭菌 NB 培养基将样品稀释 4 倍。对含有灭菌 NB 培养基的空白进行读数 [ 19 ]。如第 2.4 节所述，采用 DNSA 方法确定淀粉酶产量。

2.6. 培养时间对细胞外α-淀粉酶产生的影响

为确定孵育期对淀粉酶产生的影响，在 NB 培养基中制备三种芽孢杆菌染色剂的培养物，重复三次，并在 37˚C 和 150 rpm 下孵育。2.4 节中提到的淀粉酶测定在 24 小时、48 小时、72 小时、96 小时和 120 小时后进行。通过添加 0.5 mL 无菌 NB 培养基代替接种培养物来维持阴性对照 [ 12 ]。

2.7. 温度对酶活性的影响

酶的稳定性总是主要取决于温度。为确定温度对酶活性的影响，在含有 50 mL NB 培养基的 250 mL 烧瓶中进行摇瓶实验，并在 37˚C 下以 150 rpm 孵育 48 小时。然后收集、收获样品并获得无细胞上清液。之后，将 0.5 mL 粗酶提取物和 0.5 mL 1% 可溶性淀粉的混合物在不同温度下孵育 30 分钟，即 37˚C、45˚C、55˚C、65˚C、75˚C、85˚C C 和 95˚C。阴性对照是在各自的温度下孵育灭菌的 NB 培养基，而不是培养上清液。然后，加入 1 mL DNSA 试剂以终止酶反应，并按照 2.4.2 节所述进行测定程序步骤。

2.8. 淀粉酶生产培养条件的优化

2.8.1. 基础培养基的制备

基础培养基的组成为(g·L -1 )：淀粉，10；硝酸钾3 , 0.5; K 2 HPO 4 , 1; MgSO 4 ·7H 2 O，0.2；CaCl 2 , 0.1; 使用 2N NaOH 或 2N HCl 将FeCl 3痕量和初始 pH 值调整至 7.0，并在 121˚C 和 15 lbs/inch 2压力下高压灭菌 20 分钟 [ 20 ]。

发酵过程在含有50mL培养基的250mL锥形瓶中进行。在介质冷却至环境温度后，接种 0.5 mL 的接种培养物，如第 2.3 节所述制备，并在 37˚C 下在 150 rpm 的摇动培养箱中培养。每个实验一式三份进行。48 小时后，取出 1.5 mL 的等分试样，并按照第 2.4 节所述进行淀粉酶测定。

2.8.2. 碳源对细胞外α-淀粉酶产生的影响

确定碳源对三种芽孢杆菌菌株、三种不同碳源的淀粉酶产生的影响；玉米（Zeamays)、红薯 ( Ipomoea batatas ) 和木薯 ( Manihot esculenta ) 是从斯里兰卡科伦坡当地市场挑选和购买的。他们用自来水冲洗干净，去除灰尘和杂质。将清洗后的基材切碎，然后在 60˚C 下干燥约 12 小时以获得一致的重量。将干燥的淀粉材料在实验室研磨机中研磨，并筛出大于 1 mm 的粒径 [ 20 ]。

基础培养基中的淀粉被玉米、木薯、红薯代替，以确定淀粉酶生产的最佳碳源。不添加碳源的基础培养基和添加1%可溶性淀粉作为碳源的基础培养基分别作为阴性和阳性对照[ 21 ]。

根据结果​​（第 3.5 节），木薯被选为淀粉酶生产的最佳淀粉来源。对于即将进行的研究，淀粉源被 1% 的木薯淀粉取代，将其用作唯一的碳源。

2.8.3. 淀粉浓度对细胞外α -淀粉酶产生的影响

三种芽孢杆菌。接种到如第 2.8.1 节所述制备的灭菌基础培养基，但不是 1% 木薯，而是含有不同木薯淀粉量的培养基，最终浓度 [重量 (w)/体积 (v)] 为 0.5%，制备了 1.0%、1.5%、2% 和 2.5%。如前所述进行实验。简而言之，向 50 mL 灭菌发酵培养基中加入 0.5 mL 接种物，并在 37˚C 下以 150 rpm 的速度孵育。48 小时后，取出 1.5 mL 的等分试样，并按照第 2.4 节所述进行淀粉酶测定。在不添加木薯淀粉的情况下维持阴性对照。

2.8.4. pH 对细胞外α -淀粉酶产生的影响

如上文第 2.8.1 节所述制备灭菌基础培养基。使用 2N NaOH 或 2N HCl 将 pH 值调节至 5 至 9，固定间隔为 0.5。如第 2.3 节所述制备接种物。然后将接种的培养基在 37˚C 下以 150 rpm 培养 48 小时。这段时间后，取出 1.5 mL 的等分试样，并按照 2.4 节所述进行淀粉酶测定。

2.8.5. 氮源对细胞外α-淀粉酶产生的影响

将芽孢杆菌菌株接种到如上文 2.8.1 节所述制备的基础培养基中，但氮源 (KNO 3 ) 被 0.5% (w/v) 不同的有机和无机氮源替代，即胰蛋白胨、蛋白胨、酵母提取物和硫酸铵 [(NH 4)2 SO 4 ] [ 12 ]。通过不向培养基中添加任何氮源来进行阴性对照。将芽孢杆菌菌株接种到培养基中后，将培养物在 37˚C 下以 150 rpm 的速度孵育 48 小时。如第 2.4 节所述进行标准测定程序。

2.9. 统计分析

所有数据均表示为平均值的平均值±标准误差 (SE)。使用Minitab 17统计软件进行统计分析。一种方法的方差分析 (ANOVA) 用于统计分析从研究中获得的数据。对于组间的相等变化，进行了 Tukey-Kramer 事后检验。当 P < 0.05 时，差异被认为是显着的。

3。结果与讨论

3.1. 标准曲线的发展

如第 2.4.3 节所述，获得了将葡萄糖浓度与显色反应相关联的标准曲线。通过将反应产物在 540 nm 处的吸光度与标准淀粉酶制剂作图来确​​定未知样品中的淀粉酶浓度（图 1）。淀粉酶活性单位表示为在测定条件下每分钟 1 mL 酶上清液释放的葡萄糖微摩尔数。

3.2. 生长温度对细胞外α -淀粉酶产生的影响

温度是一个重要因素，它能够控制生物体的生长和细胞外酶（例如α -淀粉酶）的产生。微生物生长的最佳温度可能取决于生物体的类型 [ 22 ]。微生物产生α -淀粉酶的温度范围很广。B. amyloliquefaciens , B. licheniformis , B. megaterium , B. subtilis ,B. stearothermophilus是淀粉酶生产中最常用的细菌之一。芽孢杆菌 据报道可在 37˚C - 60˚C 的温度范围内产生α -淀粉酶 [ 11 ]。在这项研究中，为了确定酶生产的最佳温度，发酵在 25˚C 至 65˚C 的不同温度下进行。

根据获得的结果，B. licheniformis和B. amyloliquefaciens在 37˚C 下 48 小时后的最佳酶产量分别为 0.133 ± 0.006 U·mL -1和 0.417 ± 0.004 U·mL -1 ，而B. megaterium有显示具有最佳酶产量，0.057 ± 0.004 U·mL -1在 30˚C 孵育 24 小时后（表 1）。

根据在 OD 600nm处获得的值， B. megaterium、B. licheniformis和B. amyloliquefaciens的最适生长温度分别为 30˚C、37˚C 和 45˚C （表 2）。即便如此，地衣芽孢杆菌(37˚C) 和巨大芽孢杆菌 (30˚C)的最佳细胞密度和最佳酶产量在相同温度下报告，对于解淀粉芽孢杆菌，在不同温度下报告了最佳细胞密度 (45˚C) 和最佳酶产量 (37˚C)。因此，可以假设，最适产酶温度与最适生长温度之间没有任何关系。

图 1。校准曲线显示 540 nm 处的吸光度与还原糖浓度的关系。

温度

潜伏期

地衣芽孢杆菌的酶活性 (U/mL)（平均值±平均值的标准误差）

解淀粉芽孢杆菌的酶活性 (U/mL)（平均值±平均值的标准误差）

巨大芽孢杆菌的酶活性 (U/mL)（平均值±平均值的标准误差）

对照的酶活性 (U/mL)（平均值±平均值的标准误差）

25˚C

24小时

0.029 ± 0.003

0.017 ± 0.003

0.012 ± 0.002

0.005 ± 0.001

48小时

0.040 ± 0.003

0.024 ± 0.004

0.025 ± 0.002

0.004 ± 0.001

72小时

0.034 ± 0.003

0.016 ± 0.001

0.019 ± 0.003

0.004 ± 0.000

30˚C

24小时

0.032 ± 0.001

0.041 ± 0.000

0.057 ± 0.004

0.009 ± 0.001

48小时

0.057 ± 0.008

0.041 ± 0.002

0.033 ± 0.003

0.013 ± 0.014

72小时

0.030 ± 0.008

0.033 ± 0.001

0.030 ± 0.004

0.004 ± 0.001

37˚C

24小时

0.033 ± 0.004

0.356 ± 0.014

0.023 ± 0.002

0.003 ± 0.000

48小时

0.133 ± 0.006

0.417 ± 0.004

0.028 ± 0.001

0.003 ± 0.000

72小时

0.074 ± 0.001

0.377 ± 0.000

0.025 ± 0.002

0.002 ± 0.000

45˚C

24小时

0.027 ± 0.002

0.031 ± 0.004

0.003 ± 0.001

0.001 ± 0.000

48小时

0.010 ± 0.001

0.027 ± 0.000

0.005 ± 0.002

0.001 ± 0.000

72小时

0.020 ± 0.001

0.028 ± 0.006

0.007 ± 0.001

0.001 ± 0.000

55˚C

24小时

0.037 ± 0.003

0.015 ± 0.001

0.002 ± 0.001

0.000 ± 0.000

48小时

0.013 ± 0.001

0.009 ± 0.002

0.002 ± 0.000

0.000 ± 0.000

72小时

0.022 ± 0.000

0.025 ± 0.003

0.06 ± 0.000

0.000 ± 0.000

65˚C

24小时

0.007 ± 0.000

0.001 ± 0.000

0.000 ± 0.000

0.000 ± 0.000

48小时

0.009 ± 0.001

0.003 ± 0.000

0.000 ± 0.000

0.000 ± 0.000

72小时

0.006 ± 0.000

0.001 ± 0.000

0.000 ± 0.000

0.000 ± 0.000

表 1。温度对摇瓶培养中芽孢杆菌属菌种胞外α-淀粉酶产生的每个值是三个平行重复的平均值。

温度

潜伏期

地衣芽孢杆菌的生长 (OD600)（平均值±平均值的标准误差）

解淀粉芽孢杆菌的生长 (OD600)（平均值±平均值标准误差）

巨大芽孢杆菌的生长 (OD600)（平均值±平均值标准误差）

对照的生长 (OD600)（平均值±平均值的标准误差）

25˚C

24小时

0.339 ± 0.004

0.245 ± 0.006

0.355 ± 0.006

0.002 ± 0.000

48小时

0.282 ± 0.013

0.175 ± 0.007

0.416 ± 0.015

0.002 ± 0.000

72小时

0.259 ± 0.016

0.230 ± 0.004

0.447 ± 0.006

0.002 ± 0.000

30˚C

24小时

0.422 ± 0.005

0.248 ± 0.003

0.383 ± 0.008

0.003 ± 0.000

48小时

0.339 ± 0.010

0.190 ± 0.008

0.477 ± 0.036

0.002 ± 0.000

72小时

0.400 ± 0.010

0.215 ± 0.014

0.512 ± 0.045

0.009 ± 0.001

37˚C

24小时

0.814 ± 0.097

0.286 ± 0.019

0.331 ± 0.016

0.009 ± 0.001

48小时

0.480 ± 0.003

0.114 ± 0.011

0.444 ± 0.003

0.017 ± 0.001

72小时

0.504 ± 0.030

0.200 ± 0.016

0.507 ± 0.008

0.010 ± 0.001

45˚C

24小时

0.746 ± 0.010

0.454 ± 0.017

0.009 ± 0.000

0.002 ± 0.000

48小时

0.380 ± 0.008

0.636 ± 0.008

0.009 ± 0.000

0.003 ± 0.000

72小时

0.303±0.020

0.579 ± 0.001

0.060 ± 0.011

0.003 ± 0.000

55˚C

24小时

0.297 ± 0.040

0.001±0.001

0.000 ± 0.000

0.002 ± 0.000

48小时

0.075 ± 0.002

0.054 ± 0.006

0.009 ± 0.000

0.003 ± 0.000

72小时

0.111 ± 0.029

0.043 ± 0.012

0.036 ± 0.004

0.002 ± 0.000

65˚C

24小时

0.006 ± 0.001

0.001 ± 0.000

0.000 ± 0.000

0.000 ± 0.000

48小时

0.020 ± 0.002

0.005 ± 0.000

0.000 ± 0.000

0.000 ± 0.000

72小时

0.006 ± 0.001

0.000 ± 0.000

0.000 ± 0.000

0.000 ± 0.000

表 2。摇瓶实验中温度对芽孢杆菌生长的影响。每个值是三个平行重复的平均值。

Tukey 事后分析是在 ANOVA 测试下对 48 小时后获得的结果进行的，因为在 48 小时后获得了最大酶产量。B. licheniformis和B. amyloliquefaciens在 37˚C 时的酶产量明显高于其他温度。然而，巨大芽孢杆菌在 25˚C、30˚C 和 37˚C 下的酶产量没有显示出任何显着差异。因此，决定在 37˚C 下培养所有三种菌株以进行进一步研究。

B. megaterium是三种菌株中最不耐热的生物体，因为与阴性对照相比，它无法显示任何显着的酶产生或生长，高于 37˚C。37˚C 后，所有三种生物的酶产量逐渐下降。这可能是由于它们的嗜温性。由于它们是嗜温菌，因此它们没有耐受高温的特殊机制。[ 23 ] 对解淀粉芽孢杆菌和 [ 24 ] 对巨大芽孢杆菌也报道了类似的结果。根据这些研究，两种菌株的酶生产的最佳温度为 37˚C。然而，[ 1 ] 和 [ 11] 已经揭示解淀粉芽孢杆菌P-001 和地衣芽孢杆菌的最佳酶生产温度分别为 42˚C 和 30˚C。

3.3. 培养时间对细胞外α-淀粉酶产生的影响

结果表明，所有三种菌株在孵育 48 小时后均获得最佳酶产量（表 3）。在解淀粉芽孢杆菌中获得最大酶产量，0.465 ± 0.004 U·mL -1 。其次是地衣芽孢杆菌的 0.132 ± 0.006 U·mL -1和巨大芽孢杆菌的0.028 ± 0.001 U·mL -1。根据 Tukey 比较试验，地衣芽孢杆菌在孵育 48 小时后的酶产量与任何其他孵育期后的淀粉酶产量有显着差异。解淀粉芽孢杆菌在 48 小时和 72 小时后的酶产量没有显着差异巨大芽孢杆菌在 24 小时、48 小时和72 小时后的酶产量没有任何显着差异。

我们的发现与 [ 11 ] 在B. amyloliquefaciens P-001的情况下获得的结果一致。[ 25 ] 在B. subtilis的情况下，[ 26 ] 在Bacillus sp.的情况下获得了类似的结果。DLB 9 和 [ 27 ] 在B. subtilis的情况下。然而，也有与此相反的发现。例如，[ 28 ] 报道解淀粉芽孢杆菌在 24 小时后产生最高的酶产量，这与我们的结果不符。

据揭示，α-淀粉酶的产生始于指数期的开始。副产物的积累可能是淀粉酶活性达到最大活性后降低的原因。酶产量的突然下降可能是由于培养基中蛋白酶的积累 [ 27 ]。正如 [ 28 ] 报道的那样，高水平的蛋白酶活性伴随着指数生长期结束时的孢子形成过程。

根据 [ 19 ]，在培养 12 小时之前甚至无法在生长培养基中检测到淀粉酶。根据 [ 29 ]，只有在生物体达到稳定期并且可用碳源减少后，才会发生酶的有效诱导。

潜伏期

地衣芽孢杆菌的酶活性 (U/mL)（平均值±平均值的标准误差）

解淀粉芽孢杆菌的酶活性 (U/mL)（平均值±平均值的标准误差）

巨大芽孢杆菌的酶活性 (U/mL)（平均值±平均值的标准误差）

对照的酶活性 (U/mL)（平均值±平均值的标准误差）

24小时

0.033 ± 0.004

0.365 ± 0.014

0.023 ± 0.002

0.002 ± 0.000

48小时

0.132 ± 0.006

0.465 ± 0.004

0.028 ± 0.001

0.003 ± 0.001

72小时

0.074 ± 0.001

0.425 ± 0.004

0.025 ± 0.001

0.005 ± 0.000

96小时

0.050 ± 0.002

0.387 ± 0.007

0.008 ± 0.001

0.001 ± 0.000

120小时

0.040 ± 0.004

0.365 ± 0.008

0.006 ± 0.002

0.002 ± 0.000

表 3。培养时间对摇瓶培养中芽孢杆菌属菌种胞外α-淀粉酶产量的影响每个值是三个平行重复的平均值。

3.4. 温度对酶活性的影响

在 37˚C 至 95˚C 的不同温度范围内测定了温度对酶活性的影响。地衣芽孢杆菌的最高酶活性 0.127 ± 0.003 U·mL −1在85˚C 时获得，在 37˚C 时最低（图 2）。[ 30 ] 对地衣芽孢杆菌CUMC 305报道了类似的结果。他们在 90˚C 时获得了地衣芽孢杆菌的最大活性。从 Tukey 事后检验进行的比较分析也显示最佳酶活性与获得的任何其他酶活性有显着差异。

对于解淀粉芽孢杆菌最高酶活性，在 75˚C 下获得0.098 ± 0.002 U·mL -1 。酶活性逐渐增加，直到达到最佳酶活性，然后活性逐渐降低。根据进行的 Tukey 比较分析，在 65˚C 和 75˚C 下获得的数据实际上并没有显着差异。B. amyloliquefaciens P-001 在 60˚C 时表现出最佳酶活性 [ 11 ]。根据 [ 31 ]，芽孢杆菌属。AB68 能够在很宽的温度范围内发挥作用，50˚C 是最佳值。

对于巨大芽孢杆菌最佳酶活性，在 45˚C 下观察到0.067 ± 0.003 U·mL -1 。然而，该酶已显示在广泛的温度范围内具有活性。Tukey对比分析也证明了37℃到85℃得到的结果没有显着差异。根据[ 18 ]， B. megaterium的最佳酶活性在 60˚C 下获得。[ 32 ]报道了在 50˚C - 75˚C 的温度范围内获得的最佳活性。[ 13 ]提到了在 35˚C 时获得的最佳活动。

研究结果得出结论，所有三种生物体产生的酶在 37˚C 至 95˚C 的广泛温度范围内都具有适度稳定性。根据许多作者的报道，大多数细菌淀粉酶的最适温度范围为 30°C 至 100°C [ 33 ]。

根据结果​​，地衣芽孢杆菌的热稳定性最高，其次是解淀粉芽孢杆菌。它们结构中的特定特征可能是这种卓越的热稳定性的原因。据[ 34 ]揭示，地衣芽孢杆菌584（ATCC 27811）α-淀粉酶是一种单体酶，分子量为55,200 Da（483个氨基酸残基），其氨基酸序列与解淀粉芽孢杆菌的氨基酸序列相似度为80%应变El8 。嗜热酶通常包含更多数量的带电氨基酸残基，例如精氨酸或更高比例的精氨酸/（精氨酸 + 赖氨酸）[ 35]. 对于地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌，报告的精氨酸残基数量为 22 和 20 ，分别，而精氨酸/（精氨酸 + 赖氨酸）比率分别为 0.440 和 0.400 [ 36 ]。

组氨酸参与离子相互作用，在地衣芽孢杆菌 α-淀粉酶 XII-A 型结构中观察到的含量明显高于任何其他细菌淀粉酶 [ 36 ]。盐桥也是防止酶因受热而变性的主要因素。[ 37 ]报道的地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶结构中有39个盐桥和广泛的离子相互作用。

图 2。温度对地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌酶活性的影响。每个值是三个平行重复的平均值。误差条表示平均值的 SE。

蛋白质内部减少的表面积和增加的堆积相互作用也与热稳定性有关。包装效率可以通过具有零可及表面积的蛋白质中的原子分数来评估 [ 36 ]。对于地衣芽孢杆菌，据报道为 -0.55，显着高于平均值并且与醛铁氧还蛋白氧化还原酶相似，后者是一种来自激烈热球菌的超嗜热酶[ 38 ]。地衣芽孢杆菌也是一个非常紧密堆积的疏水核心，这被认为是最重要的热稳定因素之一 [ 36 ]。

α 淀粉酶是钙金属酶。如 [ 39 ] 所述，淀粉酶在其结构中至少包含一个 Ca 2+离子，它负责酶的完整性和稳定性。因此，Ca 2+的存在也可能是从这些生物观察到的热稳定性升高的原因。

尽管从巨大芽孢杆菌中观察到较低的热稳定性，但与阴性对照相比，它能够在很宽的温度范围内表现出热稳定性，但目前对巨大芽孢杆菌的α-淀粉酶的热稳定性进行的研究很少。 megaterium与地衣芽孢杆菌和B的α-淀粉酶相比。淀粉酶。

3.5. 碳源对细胞外α-淀粉酶产生的影响

生长培养基中碳源的性质和数量影响微生物中α-淀粉酶的产生。在这项研究中，研究了使用三种不同碳源对细胞外淀粉酶产生的影响：木薯、红薯和玉米淀粉。可溶性淀粉用作阳性对照。在不添加任何碳源的情况下进行阴性对照。

当木薯作为发酵培养基中的唯一碳源存在时，所有三种芽孢杆菌都能产生最大的酶活性（图 3）。最大酶活性，0.467 ± 0.024 U·mL -1获自解淀粉芽孢杆菌。随后是 0.166 ± 0.007 U·mL −1的地衣芽孢杆菌

图 3。碳源对地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌胞外α-淀粉酶产生的影响。每个值是三个平行重复的平均值。误差条表示平均值的 SE。

和 0.112 ± 0.035 U·mL −1的巨大芽孢杆菌，以木薯淀粉为碳源。与阴性对照相比，所有碳源都显示出对细胞外淀粉酶产生的显着高刺激作用。Tukey比较表明，不同碳源产生的淀粉酶量没有显着差异；在大多数情况下。尤其是红薯和木薯，当用作唯一碳源时，淀粉酶产量没有显示出任何显着差异。

我们的结果与 [ 40 ] 对A. niger 获得的结果相关。当与玉米和高粱淀粉一起试验时，他们发现木薯淀粉是细胞外酶生产的最佳碳源。根据 [ 41 ]，他们还对B. alvei进行了类似的研究，结果表明高粱淀粉的酶产量最高。这项研究还表明，木薯也可以作为良好的碳源，用于生产淀粉酶。

在B. licheniformis 和 B. amyloliquefaciens的情况下，与可溶性淀粉相比，天然碳源能够诱导高酶产量。这可能是由于其他营养化合物的可用性对α -淀粉酶的产生有有利影响。

3.6. 碳浓度对细胞外α-淀粉酶产生的影响

使用范围在 0.5% - 2.5% 之间的五个木薯淀粉浓度来获得最佳的α-淀粉酶产生浓度。最大细胞外淀粉酶活性 0.693 ± 0.010 U·mL -1由 2% 来自解淀粉芽孢杆菌的木薯淀粉提供（图 4）。随后是 0.2 ± 0.014 U·mL -1的地衣芽孢杆菌和 1.5% 的木薯淀粉和 0.092 ± 0.010 U·mL -1的巨大芽孢杆菌1% 木薯淀粉。根据 ANOVA 测试下的 Tukey 成对比较，所有三种生物在上述最佳碳浓度下都显示出比任何其他碳浓度都显着高的淀粉酶活性。观察到细胞外淀粉酶活性逐渐升高至最佳值，然后逐渐降低。

图 4。碳浓度对地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌胞外α-淀粉酶产生的影响。每个值是三个平行重复的平均值。误差条表示平均值的 SE。

所有三种生物在所有淀粉浓度下的酶活性均显着高于阴性对照。因此，可以假设淀粉浓度的增加没有负面影响。

从这项研究中获得的结果得到了 [ 20 ] 的支持。他们还透露，解淀粉芽孢杆菌在 2% 的马铃薯淀粉废料中获得了最大酶活性。然而，根据 [ 19 ]，0.5% 的可溶性淀粉已为枯草芽​​孢杆菌IP 5832提供最大的酶活性。

非常高的淀粉浓度不适合酶的生产。这可归因于高淀粉浓度引起的高粘度。它可能会干扰 O 2转移，这将导致微生物生长所需的溶解 O 2不足 [ 19 ]。

3.7. pH 对细胞外α -淀粉酶产生的影响

生长培养基的初始 pH 值在酶的产生中起着至关重要的作用。为了确定淀粉酶生产的最佳 pH 值，pH 研究在 5.0 - 9.0 的 pH 范围内进行，间隔为 0.5。在这项研究中，在解淀粉芽孢杆菌的情况下，在 pH 7 下获得了最大淀粉酶活性，0.671 ± 0.035 U·mL -1。然后是地衣芽孢杆菌0.205 ± 0.006 U·mL -1和巨大芽孢杆菌0.110 ± 0.001 U·mL -1，它们分别在 pH 6.0 和 7.5 下获得（图 5）。

从 ANOVA 测试下的 Tukey 成对比较，观察到解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌在其最佳 pH 值下显示出比测试的任何其他 pH 值显着高的淀粉酶活性。然而，巨大双歧杆菌在其最佳 pH 值方面无法显示出显着差异。在 pH 6.0 到 8.0 之间的酶活性没有显示出任何显着差异。

先前的研究表明，细菌生长培养基的最佳初始 pH 值在 6 到 7 之间。据报道，解淀粉芽孢杆菌MIR-41 在 pH 为 6.8 时可产生高淀粉酶 [ 39 ] [ 42 ]。B.

图 5。生长培养基初始 pH 值对地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌胞外α-淀粉酶产生的影响。每个值是三个平行重复的平均值。误差条表示平均值的 SE。

megaterium获得 pH 7 作为淀粉酶生产的最佳 pH 值 [ 18 ] 。此外，[ 43 ] 报道 pH 7 是最适合酶生产的 pH 值。因此，可以认为本实验得到的结果与以往的研究结果是一致的。

3.8. 氮源对细胞外α-淀粉酶产生的影响

通过向培养基中添加 0.5% w/v 的有机和无机氮源作为唯一氮源来测试不同氮源的影响。氮是微生物生长和产生酶的重要元素。作为一种有机氮源，胰蛋白胨对解淀粉芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌的酶活性分别为 0.294 ± 0.010 U·mL -1和0.300 ± 0.020 U·mL -1 （图6）。据[ 11 ]和[ 44 ]报道，胰蛋白胨是生产α-淀粉酶的最佳氮源。对于地衣芽孢杆菌KNO 3给出了最高活性，0.129 ± 0.04 U·mL −1。

从 Tukey 成对比较中，观察到在B. licheniformis中，与对照相比，酵母提取物作为氮源对酶的产生没有任何显着影响。在解淀粉芽孢杆菌中，酵母提取物显示出对酶生产的负面影响。然而，在巨大芽孢杆菌中，酵母提取物对α -淀粉酶的产生具有显着的影响。根据 [ 45 ]，他们还报道，当酵母提取物作为唯一的氮源添加时，枯草芽孢杆菌IMG22 没有显示任何酶产量的特异性增加，这与解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的结果一致，但与为B. megaterium 获得的数据相反。据报道，根据 [ 14 ] 和 [ 46 ]，酵母提取物还可作为从解淀粉芽孢杆菌合成α-淀粉酶的良好有机氮源。

图 6。氮源对地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌胞外α-淀粉酶产生的影响。每个值是三个平行重复的平均值。误差条表示平均值的 SE。

如前所述，有机氮源比无机氮源更适合淀粉酶生产[ 1 ]。因为胰蛋白胨为解淀粉芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌提供了最高的酶产量，可以认为本研究的结果与先前研究的结果相关。

之前的一些报道还提到，一些产生淀粉酶的生物更喜欢复杂的氮源，如胰蛋白胨和蛋白胨，而不是无机简单的氮源，如各种氨盐和钾盐 [ 47 ]。在这个实验中，当胰蛋白胨和酵母提取物用作唯一的氮源时，从巨大芽孢杆菌观察到前所未有的淀粉酶产生。可以假设，在B. megaterium的情况下, 对一些仅存在于这两种有机化合物中的营养化合物有必要的要求。胰蛋白胨和蛋白胨由多种氨基酸和维生素组成，可能是造成这种结果的原因。然而，关于氨基酸和维生素对淀粉酶产生的影响的报道参差不齐。也可能是生物体更喜欢将蛋白质作为生长的氮源，而不是细胞外酶形成的氮源 [ 48 ]。

[ 49 ]也观察到了类似的情况。根据该研究，当甘氨酸作为氮源存在于发酵培养基中时，解淀粉芽孢杆菌ATCC 23350 的淀粉酶产量增加了 300 倍。还发现甘氨酸还可以在发酵培养基中起到pH调节剂的作用。但也有报道称这些氨基酸可以作为淀粉酶合成和分泌的诱导剂[ 50 ]。然而，要确定是什么原因导致我们的研究出现这一前所未有的结果，还需要进行进一步的实验。

对氮源需求的差异可以归因于它们的遗传差异。生物体可能有不同的机制来代谢它们的营养需求 [ 51 ]。

4。结论

本研究开发了解淀粉芽孢杆菌菌株 ATCC 23350、地衣芽孢杆菌菌株 ATCC 14580 和巨大芽孢杆菌菌株 ATCC 14581最佳生产热稳定胞外α-淀粉酶的发酵条件和培养基组成。从这项研究中，可以得出结论，酶的合成会受到发酵条件的影响，例如生长温度、培养期和培养基成分，例如碳源、碳浓度、氮源和生长培养基的初始 pH。

根据获得的数据，我们可以得出结论，解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌都产生热稳定的α -淀粉酶。其中，解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶具有中等的热稳定性，地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶具有高度的热稳定性。B. megaterium也能够在很宽的温度范围内表现出热稳定性，但与其他两种生物相比，酶活性最低。

地衣芽孢杆菌的最佳酶活性在 85˚C 时获得，而最佳酶的产生和生长在 37˚C 时获得。解淀粉芽孢杆菌的最佳酶活性在 75˚C 时被发现。在解淀粉芽孢杆菌的情况下，据报道在两个不同的温度下，分别为 37˚C 和 45˚C，酶的最佳生产和生长。在B. megaterium中，最佳酶活性在 45˚C 时报告，而最佳酶生产和生长在 30˚C 时报告。

在大多数实验中，最高的酶产量来自解淀粉芽孢杆菌，其次是地衣芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌。据报道，所有三种生物的最高酶产量为 48 小时。48 小时后，观察到酶产量逐渐下降。这可能是由于营养物质的耗尽和蛋白酶的积累。

木薯被发现是诱导α-淀粉酶产生的最佳淀粉来源。当用作唯一碳源时，它甚至能够产生比可溶性淀粉更高的淀粉酶产量。这可能是由于矿物质等其他营养物质的存在，这些营养物质会诱导α-淀粉酶的产生。

根据获得的结果，获得三个不同的初始pH值作为最佳值。所有三种芽孢杆菌属。在大多数 pH 值下显示出可接受的淀粉酶产量。因此，我们可以得出结论，这三种生物可以在很宽的 pH 值范围内活跃，并可以产生淀粉酶。

据报道，当使用胰蛋白胨作为氮源时，巨大芽孢杆菌的酶产量最高。对于酵母提取物，也获得了显着高的淀粉酶产量。可以推测，这一前所未有的结果是由于在含氮源的发酵培养基中引入了维生素或氨基酸。为了准确地确定这种突然增加的原因，需要进行进一步的实验。

尽管之前的大部分研究报道有机氮源是最适合α-淀粉酶生产的氮源，但在地衣芽孢杆菌的情况下，最大产量来自无机氮源KNO 3。可以假设有机氮源的复杂性质可能会使某些微生物更难代谢。这些不同的营养需求可归因于它们的遗传变异。

根据获得的结果，可以得出结论，B. amyloliquefaciens菌株 ATCC 23350 和B. licheniformis菌株 ATCC 14580 都可以用作潜在的耐热细胞外α -淀粉酶生产者。在大多数情况下，它们显示出比巨大芽孢杆菌菌株 ATCC 14581 高的热稳定性和高淀粉酶产量。这些选定的菌株可以在工业生物技术中找到各种应用。由于这些发现的重要性，必须进行进一步的研究以使生产过程商业化。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

参考

[ 1 ] Sankaralingam, S.、Shankar, T.、Ramasubburayan, R.、Prakash, S. 和 Kumar, C. (2012) 地衣芽孢杆菌深层发酵生产淀粉酶的培养条件优化。美国-欧亚农业与环境科学杂志，12，1507-1513。

[ 2 ] Burhan, A.、Nisa, U.、Gökhan, C.、Ömer, C.、Ashabil, A. 和 Osman, G. (2003) 来自嗜碱芽孢杆菌的新型耐热、耐热、耐碱性和耐螯合剂淀粉酶的酶学特性sp。隔离 ANT-6。过程生物化学，38，1397-1403。

[ 3 ] Souza, PMD 和 Magalhães, PDO (2010) 微生物 α-淀粉酶在工业中的应用——综述。巴西微生物学杂志，41，850-861。

[ 4 ] Sundarram, A. 和 Murthy, TPK (2014) α-淀粉酶生产和应用：综述。应用与环境微生物学杂志，2， 166-175。

[ 5 ] Nooralabettu, KP (2011) 酶技术：生物技术的起搏器。PHI Learning Private Limited，新德里。

[ 6 ] Fincan, SA 和 Enez, B. (2014) 嗜热脂肪地芽孢杆菌的耐热 α-淀粉酶的生产、纯化和表征。Starch-Stärke，66，182-189。

[ 7 ] Singh, S., Sharma, Soni, ML 和 Das, S. (2011) 工业上重要的淀粉酶的生物技术应用。国际制药与生物科学杂志，2， 486-496。

[ 8 ] Merheb, CW、Cabral, H.、Gomes, E. 和 Da-Silva, R. (2007) 来自嗜热真菌橙色嗜热子囊菌的蛋白酶的部分表征及其对牛酪蛋白的水解活性。食品化学，104、127-131。

[ 9 ] Sivaramakrishnan, S.、Gangadharan, D.、Nampoothiri, KM、Soccol, CR 和 Pandey, A. (2006) 微生物来源的 α-淀粉酶——近期发展概览。食品技术和生物技术，44，173-184。

[ 10 ] Haki, GD 和 Rakshit, SK (2003) 工业上重要的耐热酶的发展：综述。生物资源技术，89, 17-34。

[ 11 ] Deb, P.、Talukdar, SA、Mohsina, K.、Sarker, PK 和 Sayem, SA (2013) 解淀粉芽孢杆菌 P-001 胞外淀粉酶的生产和部分表征。SpringerPlus，154，2-14。

[ 12 ] Akcan, N. (2011) 地衣芽孢杆菌 ATCC 12759 在深层发酵中高水平生产胞外 α-淀粉酶。罗马尼亚生物技术快报，16，6833-6840。