塔里木河流域野生鲤鱼肠道细菌发酵产氢

摘要：近年来，低成本的木质纤维素原料通过产氢菌发酵产生的生物制氢引起了人们的广泛关注。本次调查从野生鲤鱼( Cyprinus carpio L.)肠道中新分离出10株产氢菌，通过16S rDNA基因序列分析和对Cyprinus carpio L.的分析，鉴定出属于肠杆菌属和克雷伯氏菌属。生理生化特征。所有分离物都具有代谢木糖的能力，尤其是棉秆水解物产氢，产氢量（HY）高于100 mL ·L -1。特别是，WL1306和WL1305两个分离株以棉秆水解物为糖底物比葡萄糖和木糖的混合糖获得更高的HY、产氢率（HPR）和产氢潜力（HPP），获得的HY为249.5± 29.0, 397.0 ± 36.7 mL · L - 1 , HPR 10.4 ± 1.2, 16.5 ± 1.5 mL · L - 1 · h - 1 , HPP 19.5 ± 2.3, 31.0 ± 2.8 mL · L - 1 · g - 1糖， 分别地。乳酸、甲酸、乙酸、琥珀酸和乙醇等可溶性代谢物的生成反映了产氢途径的混合酸发酵特性。

关键词

发酵 生物 制氢,肠道 细菌,肠道,棉秆 水解 产物,野生 鲤鱼

一、简介

氢气是一种清洁、高效、零排放的能源，可以通过利用各种可再生原料和废物产生[ 1 ][ 2 ][ 3 ][ 4 ]。通过使用富含碳水化合物的生物质，可以通过厌氧（暗发酵）和光异养（光发酵）微生物获得生物制氢 [ 1 ] [ 2 ]。近年来，发酵菌以木质纤维素为底物，通过暗发酵产生的生物氢气引起了人们的广泛关注[ 5 ][ 6 ][ 7 ][ 8 ][ 9 ]。]。特别是，木质纤维素水解物和发酵细菌在木质纤维素制氢中发挥着重要作用。

棉秆是中国新疆分布最广的原料。近年来，棉花秸秆的高价值利用已成为研究热点。将棉秆水解物中的还原糖转化为高价值化学品已引起人们的兴趣。最新进展是通过不同的发酵微生物发酵棉秆水解物生产生物乙醇、木糖醇和单细胞脂质[ 10 ][ 11 ][ 12 ]。关于生物制氢，只有两篇报道提到了以棉秆水解物为发酵底物的制氢动力学[ 13 ][ 14 ]]。因此，获得高效产氢和棉秆水解物利用的高效细菌将具有重要意义。

目前，高效产氢菌的开发对于氢能的发展至关重要。分布在自然环境中的产氢菌种类繁多，具有多种产氢代谢途径[ 15 ]。厌氧发酵被认为是一种高效的产氢方式，产氢率最高。氢气的厌氧发酵由许多发酵微生物进行，包括肠杆菌属的兼性厌氧菌 [ 16 ] [ 17 ]、梭菌属的厌氧菌 [ 18 ] [ 19 ]、产甲烷菌 [ 20 ] 和柠檬酸杆菌属 [ 21 ]]。其中，肠杆菌属的兼性厌氧菌是研究最多的产氢菌，它可以通过混酸发酵途径中的甲酸-氢解反应产生氢气[ 22 ][ 23 ]。

为了获得高效的产氢微生物，据报道，一些产氢细菌从不同的环境中分离出来，如污泥[ 24 ][ 25 ]、废水[ 26 ]、土壤[ 27 ]等。 . 证明从独特环境中分离的产氢菌可以获得良好的产氢潜力和特定的底物利用性能。田口等人。(1993) 报道了一种产氢细菌，拜氏梭菌 AM21B，它是从白蚁中分离出来的，它可以利用淀粉和葡萄糖作为产氢的底物 [ 28]。据报道，从印度泰米尔纳德邦塞勒姆区 Mettur 发电站的热土中分离出的产氢细菌 Pseudomonas stutzeri JX442762 能够将污水作为良好的产氢来源，产氢率为 190.03 ± 0.81 mL 氢气 [ 29 ]。众所周知，鱼肠是多种微生物栖息的特定环境。到目前为止，大多数研究都涉及鱼肠的微生物多样性以及与宿主发育、生理和健康的相关性 [ 30 ] [ 31 ] [ 32 ]，很少涉及其他功能性微生物如产氢微生物的开发细菌。

本研究涉及从中国新疆塔里木河流域的野生鲤鱼 (Cyprinus carpio L.) 肠道中分离产氢细菌。通过对 16S rDNA 序列的系统发育分析和生理生化特征检查来鉴定分离株。对使用各种糖底物的分离株的产氢特性进行了研究，以获得能够利用棉秆水解物产氢的菌株。分析了以棉秆水解物为糖底物的产氢过程中产生的可溶性代谢物，以证明分离菌株的产氢代谢途径。

2。材料和方法

2.1。材料

野生鲤鱼（Cyprinus carpio L.）是从塔里木河流域捕获的，活鱼在捕获后立即进行表面消毒并切开腹部，然后将肠子拉出并立即准备分离产氢细菌.

本研究中使用的棉秆来自中国新疆阿拉尔的一片棉田。将秸秆干燥，研磨成碎片，并在水解前使用 20 目筛子过筛。棉秆水解液是根据前人报道[ 10 ][ 11 ][ 12 ]采用最佳水解工艺和解毒脱色方法获得的。结果，水解产物主要由葡萄糖和木糖组成，其浓度比约为 3:1 [ 12 ]，作为发酵培养基的成分制备。

2.2. 利用棉秆水解物产氢菌的分离

称取肠子及包涵体1 g，加入9 mL灭菌水中，混匀，研磨成初悬液，连续稀释10倍。10 5 , 10 6 , 10 7稀释的悬浮液取 0.1 mL 转移至无菌分离板中，均匀铺开，37℃恒温培养箱中培养 48 h。分离培养基含有：牛肉提取物5 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、琼脂20 g/L。培养后，挑取单菌落接种于18 mL试管中，加入10 mL液体培养基（初筛培养基包括葡萄糖10 g/L、木糖10 g/L、蛋白胨10 g/L、牛肉浸膏5 g/L、 NaCl 5 g/L；二级筛选培养基中加入还原糖浓度为20 g/L的棉秆水解液、蛋白胨10 g/L、牛肉浸膏5 g/L、NaCl 5 g/L)，将Durham氏发酵管浸没在液面下收集分离物产生的气体，将接种物在37℃培养24小时。可以生长和产生H 2的分离物选择初筛培养基中的气体接种到初筛培养基中，能够生长并产生H 2浓度高于50 mL/L培养基的为产氢菌株。

2.3. 分离菌株的鉴定

在制造商说明的指导下，使用 Ezup Column Bacteria Genomic DNA Purification Kit（Sangon，China）从指数期的产氢细菌细胞中提取基因组 DNA。使用引物对 27F/1492R 通过 PCR 扩增 16S rDNA 基因。对 PCR 产物进行测序，并使用 BLAST 程序将 16S rDNA 序列与 GenBank 数据库中的现有序列进行比对和鉴定。此外，使用Mega软件（6.0版）的clustal W程序将分离物的核苷酸序列与密切相关的序列进行比对，并构建系统发育树以显示分离物与参考菌株之间的关系。

使用 Hucker 方法对细菌进行革兰氏染色，Doetsch [ 33 ]之前曾报道过这种方法。使用光学显微镜 DM1000 LED (Leica, Germany) 检查细菌形态。根据系统细菌学鉴定手册[ 34 ]中描述的方案检查细菌生理和生化特征。

2.4. 各种糖类培养基发酵制氢

将分离物在活化斜面上培养 24 小时，将三个循环的活化细胞接种到含有 100 毫升种子培养基的 250 毫升锥形瓶中，并在 16 小时内在 150 转/分的旋转振荡器上于 37°C 下孵育。种子培养基含有：葡萄糖10 g/L、木糖10 g/L、蛋白胨10 g/L、牛肉提取物5 g/L、NaCl 5 g/L。将种子的OD 600 s 调制至约1.0，接种到接种量为10%（v/v）的发酵培养基中。对于每个发酵样品，将 175 mL 发酵培养基装入 250 mL 锥形瓶中，并在 37°C 的恒温培养箱中培养 24 小时。每个烧瓶都使用带管子的橡胶塞，以密封烧瓶并转移每个分离物产生的气体，发酵罐如图 1 所示. 各种糖类的发酵培养基设计如下：葡萄糖20 g/L（可用其他设计糖类代替：1）木糖20 g/L；2) 葡萄糖 10 g/L & 木糖 10 g/L；3) 还原糖浓度为20 g/L)的棉秆水解液，牛肉浸膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，KH 2 PO 4 0.5 g/L，MgSO 4 ·7H 2 O 0.5克/升。发酵后，测量氢气的体积和浓度，并检测发酵液中的糖含量。用棉秆水解液处理

图 1。用于生产生物氢的发酵罐。

作为糖的底物，还检测了主要的副产物，如琥珀酸盐、柠檬酸盐、乳酸、乙酸盐、乙醇。

2.5. 分析方法

氢气体积通过倒置滴定管中 1 mol/L NaOH 置换法测量，并使用带柄氢气检测器（KP810H20，河南众安电子检测技术有限公司，中国）检测生物氢气浓度。在发酵结束时，将水样以 8000 × g 离心 10 分钟，并在分析前通过具有 0.22 μm 膜的注射器过滤器过滤。

肉汤中还原糖的总浓度通过先前报道的 3,5-二硝基-水杨酸试剂 (DNS) 方法测定 [ 35 ]。使用折射率检测器通过高效液相色谱仪 (HPLC) (Shimadzu LC-2A) 检测葡萄糖和木糖浓度。使用 Cosmosil NH 2色谱柱（5 μm，4.6 mm × 250 mm），以乙腈和水 (75:25) 的溶液作为洗脱液。使用 1.0 mL/min 的洗脱液流速和 40˚C 的温度和 20 μL 的进样量进行分析。

琥珀酸盐、柠檬酸盐和乳酸的浓度通过配备紫外检测器的高效液相色谱仪 (HPLC) (Waters2695) 并使用 C 18硅胶柱 Sinochrom ODS-BP (4.6 mm × 250 mm × 5 μm) 测量. NH 4 H 2 PO 4以 10 mmol/L 溶液为流动相，流速 1.0 mL/min，柱温 37℃，检测波长 210 nm，进样量 20 μL。乙酸盐和乙醇的浓度通过气相色谱 (GC) (Aglient6890N, J&W Scientific) 验证，流速为 2 mL/min，在 hp-FFAP 柱 (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm) 上使用火焰离子化检测器 ( FID) 检测器，带有氮气载气。工艺条件如下：喷射器温度，220℃；检测器温度 280˚C；温度曲线 60、170˚C，运行时间为 6 分钟。

3。结果与讨论

3.1。产氢菌的分离鉴定

野生鲤鱼（Cyprinus carpio L.）的肠道是许多发酵细菌的舒适栖息地。从分离培养基中分离出50多个细菌并纯化用于后续实验。其中，22个细菌被选为在初筛培养基中具有生长和产生H 2气体能力的候选菌株。在此基础上，筛选出10株生长OD 600和产氢浓度分别高于1.0和50.0 mL/L培养基24小时培养的细菌作为目标产氢菌株（图2 ））。所有十种细菌的编号分别为 WL1306、WL1315、WL1302、WL1307、WL1318、WL1308、WL1305、WL1310、WL1309、WL1312。所有细菌均为棒状，革兰氏染色阴性。还检查了分离物的生理和生化特征，结果如表1所示，与肠杆菌属和克雷伯氏菌属的性质相似。

此外，对16S rDNA基因（约1.5 kb）的细菌序列进行测序，然后提交给GenBank，以获得KT328451、KT328457、KT328449、KT328452、KT328458、KT328458、KT328453、KT328450、KT328455、KT328454、KT323的登录号。通过 BLAST 搜索程序将确定的序列与 GenBank 数据库中可用的 16S rDNA 基因序列进行比较，并构建系统发育树以显示从确定的序列推导出的分离物与参考菌株之间的关系（图 3）。由图3推断，分离株可分为肠杆菌属和克雷伯氏菌属2属，其中WL1310、WL1302、WL1318、WL1306、WL1308等5种，

图 2。在筛选介质中产生氢气。

图 3。基于肠杆菌科的 16S rDNA 基因序列显示分离株系统发育位置的邻接系统发育树。节点上的数字表示基于 1000 个重采样数据集的邻接分析的引导支持水平。Bar 0.05 每个核苷酸位置的替换。

与肠杆菌属有关。另一方面，将WL1315、WL1312、WL1305、WL1307、WL1309等5个种归入克雷伯氏菌属。肠杆菌属和克雷伯氏菌属是报道最多的兼性厌氧产氢细菌，它们可以利用各种底物通过混合酸途径产氢[ 36 ][ 37 ][ 38 ][ 39 ]。从野生动物肠道中分离出的主要产氢细菌

特征

WL

1306

WL

1315

WL

1302

WL

1307

WL

1318

WL

1308

WL

1305

WL

1310

WL

1309

WL

1312

革兰氏染色

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

形状

杆

杆

杆

杆

杆

杆

杆

杆

杆

杆

柠檬酸盐利用

-

+

+

+

+

+

+

+

+

+

明胶液化

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

甲基红试验

-

+

-

+

-

-

+

-

+

-

副总裁测试

+

+

+

+

+

+

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+

+

+

吲哚的生产

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

H2S的生产

-

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-

-

-

-

-

-

-

淀粉水解

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

石蕊乳

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

脂肪酶

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-

-

-

-

-

-

-

-

-

脲酶

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

表 1。产氢细菌的生理生化特征。

+：阳性；-：否定。

鲤鱼只是这两种类型，这表明从这种独特环境中分离出来的细菌可能具有很高的产氢潜力。

3.2. 分离物的发酵产氢特性

为了明确分离物的产氢潜力，研究了使用各种还原糖的产氢特性（图4）。葡萄糖是产氢细菌必不可少的碳源，在许多报告中都提到过 [ 40 ] [ 41 ] [ 42 ]。10个菌株均能在葡萄糖培养基中有效产氢，产氢率（HY）、产氢率（HPR）、产氢势（HPP）均高于100 mL∙L -1、5.5 mL∙L -1 ∙h - 1 , 10.5 mL∙L -1 ∙g -1糖，说明所有十种分离的细菌都可以利用葡萄糖作为基本糖底物来产生氢气。不仅如此，分离物还可以利用木糖生产氢气。特别是，分离物以木糖为糖底物比葡萄糖获得更高的HY、HPR和HPP，表明分离物固有地具有代谢木糖产氢的能力（表2）。

值得注意的是，分离株以葡萄糖木糖和棉秆水解物为糖底物也获得了较高的HY、HPR和HPP，显示了它们同时利用葡萄糖和木糖产氢的能力。使用葡萄糖和木糖作为糖底物，几种菌株，例如 WL1310、WL1309、WL1312 获得了非常高的氢气产量，HY 分别为 718.5 ± 9.2、679.5 ± 4.9、906.0 ± 8.5 mL∙L -1 。此外，所有分离株均可利用棉秆水解物产氢，HY高于100 mL∙L -1，特别是WL1306和WL1305两个菌株获得更高的HY、HPR

图 4。产氢细菌通过发酵各种糖底物（葡萄糖、木糖、葡萄糖和木糖、棉秆水解物）产生氢气。(a) 氢气产量 (HY)；(b) 氢气产生率（HPR）；(c) 氢气生产潜力 (HPP)。

糖底物

项目

WL1306

WL1315

WL1302

WL1307

WL1318

WL1308

WL1305

WL1310

WL1309

WL1312

葡萄糖

HY

(mL∙L-1)

172.0±24.0

169.5±24.7

152.5±16.3

172.5±3.5

146.5±17.7

181.5±3.5

200.5±26.2

138.0±2.8

138.5±0.7

238.5±2.1

HPR

(mL∙L-1∙h-1)

7.2±1.0

7.1±1.0

6.4±0.6

7.2±0.1

6.1±0.7

7.6±0.1

8.4±1.0

5.8±0.1

5.8±0.1

9.9±0.1

高压钠灯

(mL∙L-1∙g-1糖)

13.4±1.8

13.2±1.9

11.9±1.3

13.5±0.3

11.4±1.3

14.2±0.3

15.7±2.0

10.8±0.2

10.8±0.1

18.6±0.2

木糖

HY

(mL∙L-1)

383.0±21.2

365.5±10.6

386.0±14.1

362.5±17.7

346.5±20.5

324.0±17.0

514.0±53.7

262.0±28.3

414.5±16.3

570.5±26.2

HPR

(mL∙L-1∙h-1)

16.0±0.9

15.2±0.4

16.1±0.6

15.1±0.7

14.4±0.9

13.5±0.7

21.4±2.2

10.9±1.2

17.3±0.7

23.7±1.1

表 2。产氢细菌通过各种糖培养基发酵产生氢气。

HY：氢气收率；HPR：产氢率；HPP：产氢潜力。

和以棉秆水解物为糖底物的HPP与葡萄糖和木糖的混合糖相比，得到的HY为249.5±29.0、397.0±36.7 mL∙L -1，HPR为10.4±1.2、16.5±1.5 mL∙L -1 ∙h -1，HPP 为 19.5 ± 2.3，31.0 ± 2.8 mL∙L -1 ∙g -1糖，分别表明这两种细菌可能更容易利用棉秆水解物生产氢气。

3.3. 棉秆水解产物制氢的可溶性代谢物分析

如上节所示，当使用棉花秸秆水解物作为糖底物时，10个菌株的产氢性能不同，表明产氢性能可能不同。因此，有必要对制氢过程中产生的可溶性代谢物进行分析。众所周知，肠杆菌属和克雷伯氏菌属在使用糖作为碳底物时进行混合酸发酵 [ 36 ] [ 37 ]。在目前的工作中，肠道细菌在暗 H 2发酵过程中产生的可溶性代谢物是乳酸、甲酸、乙酸、琥珀酸和乙醇（图 5）。WL1307 和 WL1309 分离物中乳酸的产生占主导地位，占每个菌株中总可溶性代谢物形成的 45.4% (w/w) 和 57.0% (w/w)。虽然琥珀酸的产生在 WL1308 和 WL1312 菌株中占主导地位，占每个菌株中总可溶性代谢物形成的 48.3% (w/w) 和 42.3% (w/w)。在菌株 WL1305、WL1309、WL1315、WL1307 中产生的乙醇浓度相当高，乙醇浓度高于 0.65 g/L。此外，乙酸盐的产生显然不是肠道细菌优选的代谢途径，因为乙酸盐对可溶性代谢物的贡献通常不到总可溶性代谢物的 25%，尤其是 WL1308 和 WL1312 产生的乙酸盐浓度, 几乎接近 0 g/L。

图 5。以棉秆水解物为底物，在产氢过程中肠道菌产生的可溶性代谢物。

甲酸在总可溶性代谢物中的比例仍然较低，表明通过甲酸氢裂解途径产氢的分离物可能受到其他代谢物产生分支途径的影响。相比之下，肠杆菌属产生的可溶性代谢物组成与克雷伯氏菌属有很大不同。克雷伯菌属是常见的酒精生产商，经常用于生产具有商业价值的酒精 [ 43 ]。事实上，克雷伯氏菌的主要产品。在黑暗的 H 2发酵过程中，乙醇，而在大多数克雷伯氏菌中形成了少量的乙酸盐和甲酸盐。

4。结论

10株产氢菌WL1306、WL1315、WL1302、WL1307、WL1318、WL1308、WL1305、WL1310、WL1309、WL1312从野生鲤鱼(Cyprinus carpio L.)肠道中新分离得到，呈杆状，革兰氏染色对属于肠杆菌属和克雷伯氏杆菌属的阴性菌株进行基于16S rDNA基因序列分析和生理生化特征检查。在以葡萄糖、木糖、葡萄糖和木糖以及棉秆水解物为糖底物的培养基中，十种产氢细菌均能产生氢气。特别是，所有分离物以木糖为糖底物比葡萄糖获得更高的HY、HPR、HPP，表明分离物固有地具有代谢木糖产氢的能力。而且，-1。特别是，WL1306和WL1305两个分离株以棉秆水解物为糖底物比葡萄糖和木糖的混合糖获得更高的HY、HPR和HPP，获得了249.5±29.0、397.0±36.7 mL∙L - 1的HY ， HPR 10.4 ± 1.2, 16.5 ± 1.5 mL∙L - 1 ∙h​​ - 1 , HPP 19.5 ± 2.3, 31.0 ± 2.8 mL∙L - 1 ∙g - 1糖，分别说明这两种细菌可能更容易利用棉秆水解物生产氢气。乳酸、甲酸、乙酸、琥珀酸和乙醇等可溶性代谢物的生成反映了产氢途径的混合酸发酵特性。综上所述，本研究提供了一种从野生鲤鱼（Cyprinus carpio L.）肠道中分离出产氢细菌，以棉秆水解物为碳源进行发酵产氢的有效方法，揭示了产氢潜力和产氢能力。可溶性代谢物产生分离物的特性。

致谢

该工作得到国家自然科学基金（21406150）、安徽省重点研发计划（201904a07020003）和安徽工业大学人才启动基金（2018YQQ029）的资助。

利益冲突

作者声明与本文的发表没有利益冲突。

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