细菌表面层蛋白：用于生物传感应用的有前途的纳米技术工具

摘要：生物传感器需求的显着增长加速了它们在各个领域的快速发展和沉浸式应用。开发高效生物传感平台的基本要求是找到稳定的、组织良好的界面结构，可以作为结合和识别生物分子的优良基质。在这种情况下，表面层蛋白具有巨大的潜力，这些蛋白代表着最原始和最简单的自组装系统，具有重复的物理化学性质，可用于表面和各种界面的分子功能化。通过整合基因工程方法来微调功能组和蛋白质结构域，S 层蛋白的重要性得到了拓宽。 几何上明确定义的方式。各种纳米材料与规则阵列中的 S 层的高效稳定结合导致其纳米生物技术传感应用的范式转变。最近，功能性 S 层支持的脂质膜已经通过脂质分子与天然或重组 S 层蛋白在纳米尺度上的共价结合产生，作为开发生物传感平台的“概念证明”。因此，鉴于表层蛋白对开发高效生物传感器所带来的好处，已经开辟了一条令人兴奋的道路，可以拓宽其在药物递送、疾病诊断、疫苗开发、芯片实验室设备等方面的转化应用。. 因此，本综述旨在描述表面层蛋白在生物传感器开发中的重要性。

关键词

表面层蛋白,纳米图案,自组装,脂质体,生物传感器

一、简介

在过去的十年中，生物传感设备的种类不断增加，这些设备已明确用于生物医学、诊断、食品加工和安全、法医学、安全和环境监测 [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] 领域。最近，代谢工程和合成生物学的出现为广泛开发基于生物分子结构的体内生物传感器铺平了道路，包括蛋白质或核酸 [ 4] . 这些生物传感器可以通过合理设计方法和定向进化对现有组件进行工程改造以实现新功能，或者直接从基因组挖掘中获得。尽管有这些了不起的证书，但该领域仍因访问偏远地区和生物系统的复杂性而受到阻碍。纳米技术的快速技术介入和对生活各个方面的影响越来越大，为开发具有精细选择性和灵敏度的纳米级生物传感装置提供了光明的前景[ 5] . 纳米尺度传感装置的制造需要分子在各种表面和界面上以可预测的明确方式具有互锁或自组装的能力。因此，对分子自组装系统的需求正在蓬勃发展，为生物系统提供更好的分子水平制造和精度方法。

在这种情况下，原核结晶细胞表面层（S-层）蛋白的重要性越来越被人们认识到，因为这些蛋白本身代表了一种独特的自组装系统，被用作生物分子识别和量化的图案化元件。6 ] [ 7 ]。天然或转基因 S 层蛋白最显着的特性是它们能够在各种人工表面（例如贵金属、硅表面、塑料）[ 8 ] 或悬浮液或单层或双层 Langmuir 脂质上的蛋白质晶格中自组装薄膜 [ 9 ] [ 10 ] 和脂质体 [ 11 ] [ 12 ]，以及最近的乳化体 [13 ] [ 14] . 天然 S 层蛋白或基因修饰的功能域的各种官能团（例如氨基、羧基和羟基）赋予类似于晶格常数的重复周期性，从而导致在结合的纳米材料上形成规则阵列。因此，必须利用 S 层蛋白作为提高生物传感器灵敏度和稳定性的可有可无的成分。然而，科学界在将各种生物分子与各种决定生物传感器的性能和灵敏度的纳米材料连接方面已经引起了极大的关注，并面临着挑战。目前，革兰氏阳性菌的表层蛋白已被探索用于开发基于不同换能器的各种生物传感器[ 15] . 本综述描述了基于表层蛋白的生物传感器的最新进展、当前瓶颈和未来前景。

2. 生物传感器的基本架构

生物传感器是通过与各种能够提供定量或半定量特异性分析信息的传感器平台具有直接空间接触的生物识别元件的集成，用于检测生物分析物的装置。因此，生物传感器包括生物或生物衍生分子，如酶、抗体、核酸、细胞受体、完整和固定的微生物、组织和细胞器等，以及可以是电化学 [ 16 ]、光学、磁性、量热、压电或声学换能器。图 1描述了描绘生物传感器基本组件的代表图. 生物传感器的工作是基于对各种生物受体的生物样品的识别，包括全细胞、固定化细胞和酶、抗体、核酸、抗原等。在识别样品之后，可以转换产品。通过基于生物细胞的各种物理化学特性的合适的传感器进行评估和量化。生物传感器的工作概述如图 2 所示。

生物传感器的功能高度依赖于生物识别元件和传感器之间界面结构的稳定性和再现性。因此，寻找合适的界面元件对于实现手持便携性和小型化仍然具有挑战性。纳米材料在生物传感器设计中的应用极大地提高了现有生物传感器的性能和灵敏度，也为吸收各种新型信号传感器开辟了道路。纳米传感平台的目标是在生命系统的复杂架构中检测较低浓度的目标分析物 [ 17 ] 代表了传感设备的真实情况。

图 1。生物传感器的基本组件，包括各种样品、生物受体、换能器。

图 2。生物传感器的工作原理。

目前，各种纳米结构如纳米线、碳纳米管 [ 18 ]、磁性纳米颗粒 [ 19 ]、金纳米颗粒 [ 20 ] 和量子点 [ 21 ] 已被用于制造生物传感器。

3. S 层蛋白在生物传感器开发中的重要性

如上所述，制造生物传感器的挑战性部分是开发界面平台或架构，以提供生物受体与目标生物分子的充分相互作用 [ 22] . 除了上述事实，界面结构必须充当与生物实体和无机载体相关的固定基质，并为生物分子提供明确的空间方向、空间和所需的稳定性。生物传感器的稳定性和性能受到生物分子在各种表面和无机固体支持物、电极上的聚集或变性的影响，然后失去功能。因此，已经为开发生物传感部分和各种传感表面之间的界面或中间层做出了广泛的努力。各种聚合材料，包括琼脂糖、聚乙二醇、壳聚糖、水凝胶 [ 23 ] [ 24] 或由硅烷、烷硫醇、膦酸盐、二烷基硫化物组成的自组装单分子层已被用于开发界面平台 [ 25 ] [ 26 ] [ 27 ] [ 28 ]。

目前，重点是利用能够在各种传感表面和界面以及纳米材料上自组装成单层或双层的表层蛋白。它作为一种出色的界面结构，与其他对应物相比，它暗示了生物受体与转导表面的密切关联，从而导致放大的信号。除此之外，这些蛋白质已被明确用作开发和制造支持脂质膜的中间层，该膜介导合适的环境，以了解膜活性肽和完整的功能性膜蛋白的重建过程。

在不影响几何顺序的自组装过程的情况下，容忍异源蛋白质及其官能团插入的固有能力为科学界以所需方式修改晶格结构铺平了道路。基因工程方法开辟了修改自然属性以创造具有所需功能属性的仿生材料的光荣方式。目前，两种常见的方法已被用于构建融合蛋白 1) 生产细胞的同源表达和分泌 2) 在合适的宿主（如大肠杆菌）中产生和表达表面层蛋白 [ 29] . 基因工程蛋白质为在传感应用中探索这些蛋白质开辟了道路。目前的文献以 S 层超滤膜 (SUM) 的形式提供了表面层作为生物传感组件的沉浸式应用。这些膜是通过在微滤膜、硅芯片和电极中沉积 S 层成分来制备的。图 3描述了表面层蛋白质作为界面结构在生物传感器开发中的作用 [ 30 ]。这些膜为生物传感元件提供稳定性，也可用于开发用于仿生应用的支持脂质双层 [ 31 ] [ 32 ] [ 33 ] [ 34] . 迄今为止，各种转导平台已被用于制造基于表层蛋白的生物传感平台，用于生物分子的检测和定量。这些是基于电化学、光学、压电、微流体的芯片实验室、基于分子印迹的生物传感器。通过掺入表面层蛋白，生物传感元件的灵敏度、选择性和稳定性得到了显着提高。以下部分总结了各种示例。

4. 基于表面层蛋白的生物传感器的开发

4.1。基于天然 S 层蛋白的生物传感器

Clark 于 1962 年开发的葡萄糖生物传感器的开创性发现为生物传感领域的进一步发展铺平了道路。在此，提出了一种电化学传感器，将葡萄糖氧化酶作为生物识别元件[ 35] . 已经用可渗透膜构造了安培电极，其中通过葡萄糖与葡萄糖氧化酶的反应测量了电位的变化。直到那时，这一开创性的发展导致了为提高葡萄糖生物传感器的灵敏度而做出的严格努力，并且 S 层蛋白介导的生物传感克服了主要的局限性。如前一段所述，为了实现生物传感方面，S 层超滤膜 (SUM) 已被用作固定各种酶、抗体和配体的合适基质。酶的固定化是由羧基的共价结合介导的

图 3。表层蛋白作为界面结构对于生物传感平台开发的重要性 [ 30 ]。

用碳二亚胺激活的 S 层蛋白，然后与酶中存在的氨基结合。S 层赋予的选择性优势已被公认为 1) S 层由重复的相同蛋白质亚基形成 2) 结晶 S 层上官能团的定向和精确定位为酶的几何明确结合开辟了道路单层。

Sleytr 等人 [ 36 ] 开发了一种电流型生物传感器，采用葡萄糖氧化酶 (GOD) 作为与 SUM 共价结合的生物识别元件。涂有酶的 SUM 与金分层以用作工作电极。开发的电极保留了 40% 的酶活性并表现出高灵敏度（高达 12 mM 葡萄糖），高信号放大率约为 150 nA/mm 2/mmol 葡萄糖和高达 30 秒的快速响应时间。开发的传感器显示出长达 48 小时的稳定响应时间和长达 6 个月的保质期。此外，在同一行中，已经报道了一种基于多酶的安培生物传感器，用于通过过氧化氢的氧化来定量蔗糖。GOD、转化酶和变旋酶这三种酶以天冬氨酸作为间隔分子固定在表面层蛋白质上。S-层蛋白从Clostridium thermohydrosulfuricum L111-69中分离出来。制备 SUM 并加载相应的酶，然后溅射金以用作工作电极。该传感器在高达 30 mM 蔗糖的情况下表现出更高的灵敏度，响应时间为 5 分钟。信号放大高达 1 µA cm − 2 ·mmol −1蔗糖。此外，通过将葡萄糖氧化酶共价固定在 SUM 上，开发了一种光纤生物传感器。通过测量来自氧光极的荧光来分析响应，该光极包含作为转导元素的钌 (II) 配合物，传感器特性显示出与其他光极相比的有希望的凭据 [ 37 ]。开发的生物传感器为微集成光学生物传感器的发展开辟了道路。

然而，开发的光学生物传感器显示出相当大的传感器优点，但随着酶结构的改变而滞后，因此，通过氩溅射在固定在 S 层蛋白上的酶单层上提供铂膜的应用，已经做出了相当大的努力来缓解这个问题 [ 38 ] . 此外，这种方法具有很大的局限性，并且被脉冲激光沉积 (PLD) 技术所规避。在沉积与酶/S 层复合材料接触的薄膜之前，优化了反应和激光参数，观察到 70% - 80% 的酶活性保留 [ 39] . 除此之外，由于血液环境的复杂性，已经为准确在线监测葡萄糖进行了更严格的努力。微流控芯片实验室是利用来自球形赖氨酸杆菌 CCM 2177 的 S 层蛋白 SbpA 制造的 [ 40] . 四个含有固定有 S 层蛋白的 (GOD) 的微反应器以反馈回路机制运行，用于特定和独立的葡萄糖测量。在新鲜血液样本、血浆和人血清白蛋白存在的情况下，利用表面层蛋白质的有益方面已在消除吸附过程方面被可视化。据报道，该设备的灵敏度范围高达 0.5 mM 至 50 mM。该传感装置可在 37˚C 下长达 2 小时进行精确且无漂移的葡萄糖测量，并成功用于复杂样品的多重分析。

除葡萄糖氧化酶外，胆固醇的量化还采用基于 S 层的生物传感方法，利用胆固醇氧化酶作为生物识别元件。最初使用朗缪尔技术在空气-水界面形成了稳定的胆固醇氧化酶单层，但在用从球形芽孢杆菌中分离的 S 层蛋白包被后，观察到更稳定的层 [ 41 ]。表面压力-分子面积（π-A）等温技术证实了增强的稳定性，并表现出理想的行为。此外，使用 Langmuir-Blodgett 技术在丝网印刷碳电极上转移开发的混合膜（包括胆固醇氧化酶和 S 层蛋白）[ 42] . 通过 AFM 的表征揭示了电极表面粗糙度的降低，而 CV 研究证实了由于 S 层蛋白的存在而增强的氧化峰强度。因此，通过掺入 S 层蛋白提高了所开发生物传感器的检测限和稳定性。此外，Scheicher 等人已经报道了用于测量氧气的光纤传感器。[ 43] . 传感器的制造是通过染料中氧敏感的 Pt(II) 斑岩与 S 层蛋白的共价结合来完成的。该信号由具有成本效益的光电部件产生，如硅光电二极管和发光二极管 (LED)，并通过相位调制荧光法测量氧气浓度。据报道，已开发传感器的发光淬灭效率为 1.5 - 1.9（表示为存在空气和氮气时的信号比），并显示出与使用发光体的其他传感系统相当的响应。

最近，S 层生物传感方面已被用于癌细胞的分子诊断。开发的生物传感器的工作原理是识别在癌细胞中高度表达的叶酸受体 [ 44] . 开发的生物传感器由金表面组成，金表面固定有结晶的 S 层蛋白并用叶酸进行功能化。两种转导装置、石英晶体微天平和电化学生物传感器已被用于区分 MCF-7 和人类肝细胞癌 (HepG2) 细胞，因为后者细胞不与叶酸结合。石英晶体微天平耗散监测 (QCM-D) 用于区分 MCF-7 和 HepG2 细胞，在受控条件下进行实时监测，检测限为 (1 × 10 5细胞/mL）。通过电化学测量进一步证实了开发的生物传感器的选择性和特异性，结果与 QCM-D 传感器一致。因此，开发基于 S 层的生物传感可以促进早期诊断，从而降低癌症死亡率。

此外，Weinert 等人报道了一种利用 S 层蛋白的基于适配体的生物传感方法。[ 45] . 从球形乳杆菌 JG-A12 和球形乳杆菌 JG-B53 中分离的 S 层蛋白与凝血酶结合适体和氧氟沙星结合适体结合，该适体由不同的化学交联剂介导。通过共振镜传感、激光诱导荧光光谱和 QCM-D 等高通量分析方法观察到了巨大的差异。适配体修饰后的S层蛋白单体没有结晶，凝血酶结合，而与表面或悬浮液中完整S层连接的适配体与凝血酶和氧氟沙星结合。因此，这些研究具有很好的相关性并证实，S 层蛋白代表了一种有趣的生物分子识别的固定支持。

上述例子突出了天然 S 层蛋白作为生物传感基质的生物医学应用。除了这些应用之外，还报道了电化学生物传感器用于检测铀酰（ UO2 +2) 皮摩尔浓度的离子，利用束缚在金电极上的球形赖氨酸杆菌 JG-A12 的 S 层蛋白 [ 46 ]。将开发的传感器与基于自组装单层的生物传感装置进行比较，与其他阳离子（包括 Cd 2+、Ni 2、CO 2+和 Cs + ）相比，显示出更高的稳定性、更长的保质期和更高的选择性。这些研究还深入了解了 S 层蛋白中存在的羧基和磷酸基团参与（ UO2 +2) 作为 S 层蛋白中的化学修饰的结合导致阻止与 UO2 +2离子[ 47 ]。因此，该研究为利用S层蛋白作为生物传感元件开发检测重金属污染场地其他金属离子的生物传感器提供了依据。

4.2. 基于基因工程 S 层蛋白的生物传感器

最近，用于生产重组蛋白的基因工程方法的出现改变了表面层蛋白的研究发展。重组表面层蛋白的成功生产在精确的拓扑特征和耐受外源蛋白及其官能团的插入而不影响几何顺序的自组装过程方面提供了激励。迄今为止，在 N 端或 C 端构建了最常见的表层蛋白核心链霉亲和 [ 48 ] [ 49 ]，并且已经设想它们在无标记传感技术领域的生物技术应用 [ 50] 生产用于疫苗递送的蛋白质/DNA 芯片和抗原载体。Nicolla 等人已经报道了重组表面层蛋白的生物传感方面的利用。[ 29] . 从球形芽孢杆菌 CCM 2177 中分离的链霉亲和素融合 S 层蛋白 SbpA 在金表面或预涂有硫醇化次生细胞壁聚合物 (SCWP) 的金芯片上重结晶。重结晶后形成单层，然后结合生物素化的寡核苷酸。用荧光标记的探针进行杂交实验，并用表面等离子体场增强荧光光谱法进行评估。与在普通金表面重结晶融合蛋白 (8.2 pM) 相比，在 SCWP 包覆的金表面重结晶重组 S 层蛋白后发现检测限 (1.57 pM) 显着提高。51 ] [ 52 ]。传感界面由融合 S 层蛋白组成，表达骆驼抗体晶格（重链的可变结构域）抗 PSA，并通过 SPR 生物芯片检测。

此外，这种融合的 S 层蛋白在二氧化硅微珠上进一步结晶，作为面向微球的解毒系统的出色生物相容性平台。所开发系统的适用性已成功地在患有自身免疫性疾病的患者身上进行了可视化，其中 S 层传感平台已用于体外血液净化 [ 53] . 进一步的努力是通过将结合 Fc 的 Z 结构域与 S 层蛋白结合以形成 rSbpA/ZZ 形式的融合蛋白。掺入的 ZZ 结构域是来自金黄色葡萄球菌的致病蛋白 A 的 IgG 结合结构域的合成类似物。重组蛋白在基于纤维素的微珠上重结晶，与用于从患有自身免疫性疾病的患者身上提取抗体的传统免疫吸附剂相比，这些包被微珠的结合效率高出 20 倍 [ 54 ]。

除此之外，基于 S 层的生物传感平台已成功应用于分子诊断。这项工作通过融合 S 层蛋白（从球形芽孢杆菌 CCM 2177 中分离的 SbpA 和从嗜热地芽孢杆菌 PV72/p2 中提取的 SbsB）与模拟 Epstein-Barr 病毒 (EBV) 表位并在大肠杆菌中过表达的肽模拟表位 F1 融合完成[ 55 ] [ 56] . 通过ELISA和免疫点测定法评估两种S层融合蛋白的抗体结合能力。结果证实，在水溶液和血清中，SbpA/F1 比 SbsB/F1 具有更高的抗体亲和力。传感平台显示出更高的特异性（98.2%）和敏感性（89.3%），对其他相关病毒发病机制没有交叉反应。最近，开发了一种声学和 (3D) 打印的电化学生物传感器，通过识别细胞表面高表达的肿瘤标志物 CD133 来有效去除肝癌细胞 [ 57 ]] . 突出 ZZ 结构域的 S 层融合蛋白 rSbpA/ZZ 促进了抗 CD133 抗体的固定，作为检测 HepG2 细胞的传感平台。这些传感器通过 CV 和 QCM-D 作为传感平台实现了实时检测，并代表了临床应用的成本效益和一次性技术。

五、当前进展

上述讨论清楚地揭示了这样一个事实，即迫切需要识别和开发组织良好的界面结构来开发生物传感器。利用具有在各种表面和界面上自组装的能力以及在纳米尺度上制造有序结构的可调能力的生物分子的显着优势在该领域具有重要意义。基于此背景，来自不同细菌种群的表层蛋白已被用作结合各种生物分子纳米级的固定基质。事实上，在智能生物传感器生成的不同领域的技术干预和交叉受精方面取得的进展，传感器和生物受体之间没有更清晰的界限被可视化。一直在不断寻找来自古细菌和 GRAS 生物的表层蛋白。最近，从重金属污染场地分离出的 ViridibacillusarviJG-B58 菌株中鉴定出三个推定的表面层（S 层）蛋白基因（slp1、slp2 和 slp3）。58 ]。这些蛋白质形成双层并显示出已通过原子力显微镜证实的 p4 对称性。纯化的表面层蛋白在SiO 2基底上重结晶，并鉴定出显着的自组装特性。基因组分析显示， Viridibacillusarvi JG-B58 的 S 层蛋白显示出乳酸杆菌和芽孢杆菌型 S 层蛋白的特征。

目前，制造仿生功能化脂质膜的创新概念正在测试中，该膜构成模拟古细菌细胞包膜结构的结构和功能的 S 层蛋白 [ 59 ]。这些仿生超分子结构为全面了解膜功能提供了合适的平台，并提供了高机械稳定性、对高温、pH 和渗透应力的抵抗力。缺乏与古细菌表层蛋白分解有关的研究 [ 60] 并将它们重新组装成单分子层，因此迄今为止已经报道了利用来自革兰氏阳性细菌的 S 层蛋白来产生功能化的脂质膜。通过基因工程方法对天然S层蛋白的官能团进行化学修饰或在S层融合蛋白中表达所需官能团的可能性，以实现与各种脂质头基团的平滑稳定结合。除此之外，S 层蛋白的一个吸引人的特征包括在空气-水界面或以独立层的形式在脂质单层上重结晶以及球形脂质体或乳化体 [ 61] . 此外，功能性脂质膜平台可以在已经存在的重结晶 S 层蛋白晶格上生成。因此，这些研究为开发合适的生物传感器平台的“原理证明”奠定了坚实的基础。

最近，表层蛋白所表现出的卓越品质赋予它们作为构建分子印迹聚合物表面的优良模板的适用性，从而产生了受控地形特征和表面功能的印迹。目前，利用表面层蛋白质作为模板印记在各种纳米材料上形成完美有序阵列的“自下而上”方法是令人兴奋的研究领域。大量的研究报告表明，金属纳米粒子、量子纳米线、碳纳米管作为基于 S 层的生物分子印迹的奇妙平台。S 层蛋白的分子印迹已成为临床诊断、生物传感器、食品分析、

6. 当前的挑战和未来的前景

对表层蛋白的遗传学、生物化学和拓扑特征的透彻理解导致了从基础科学到转化应用的范式转变，并被视为生物-化学界面的一个很好的例子。迄今为止，革兰氏阳性细菌 G. stearothermophilus PV72/p2 的 S 层晶格已被用于产生稳定的脂质膜以及脂质体。主要挑战与生物网络与非生命系统的相容性、溶解性、稳定性和生存能力有关。生物成分之间的动态相互作用以及它们的商业利用规模也带来了巨大的技术挑战。除此之外，由于存在带电荷的氨基酸和疏水/亲水区域以及各种表面功能，蛋白质作为分子印迹的模板分子提出了巨大的挑战。蛋白质的水溶性、蛋白质在聚合物网络中的转移受限、获得高度纯化的蛋白质作为模板分子的复杂性、蛋白质在印迹过程中的稳定性以及从聚合物网络中去除蛋白质非常困难，导致吸附和解吸的扰动过程。此外，某些革兰氏阳性 GRAS 生物中 S 层蛋白的外表面是高度糖基化的，因此非常怀疑糖基化蛋白是否具有与当前研究中报道的相同的相容性。尽管有这些瓶颈，不能排除 S 层蛋白在生物传感领域的未来用途。未来发展的前瞻性领域可以设想为各种药物分子的高通量筛选、DNA 测序、电子鼻和电子舌的开发、芯片实验室设备、疾病诊断、用于疫苗和药物输送的脂质体和乳化体以及各种环境生物修复计划。

7. 结论

生物传感领域加速了生物和工程原理的有希望的融合，以开发智能、便携、具有成本效益、高灵敏度和选择性的生物传感设备。生物传感技术的理想特征需要界面表面，可以提高现有生物传感器或新发明的效率。天然和转基因表面层蛋白在各种界面平台上以特定方向自组装的显着能力导致它们在纳米级尺寸上的显着转化应用。S 层的纳米生物图案化可能为癌症、神经退行性疾病、免疫缺陷、遗传性疾病和心血管疾病。设想在构建功能性超分子结构方面取得重大进展，为开发更有效的生物传感器铺平了道路。所提出的技术刚刚进入生物传感器领域。此外，需要深入的知识来生成基于这些蛋白质的更稳定和兼容的智能生物传感器。

致谢

作者非常感谢 Gautam Buddha 大学提供所有必要的设施并鼓励撰写此手稿。所有作者声明他们没有利益冲突。

缩写

CV：循环伏安法

上帝：葡萄糖氧化酶

GRAS：一般认为是安全的

LED：发光二极管

MCF-7：密歇根癌症基金会-7

PLD：脉冲激光沉积

QCM：石英晶体微量天平

SCWP：次生细胞壁聚合物

SLP：表层蛋白

SUM：S层超滤膜

利益冲突

作者声明与本文的发表没有利益冲突。

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