金墨鱼乌贼肝脏几丁质酶同工酶的cDNA克隆及其在器官中的分布

摘要：金墨鱼八个器官中几丁质酶的分布棕褐色被确定了。几丁质酶活性（内型几丁质分解酶的活性）使用以下方法测量pNP-(GlcNAc) n (n = 2, 3) 作为底物，在肝脏、后唾液腺和胃中检测到高活性。β - N-乙酰氨基己糖苷酶（Hex）活性（外型几丁质分解酶的活性）使用以下方法测定pNP-(GlcNAc) 作为底物，在肝脏、鳃心、后唾液腺和胃等六个器官中观察到高活性。此外，使用几丁质亲和柱从肝脏中分离出两种几丁质结合蛋白（CBP-A、CBP-B）。两个全长 cDNA (世奇-1：1484 bp；世奇-2：1748 bp）编码几丁质酶是从肝脏中获得的S. esculenta.世奇-1 包含一个 1377 bp 的开放阅读框 (ORF)，编码 459 个氨基酸，并且世奇-2 包含一个 1656-bp 的 ORF，编码 552 个氨基酸。从推断的氨基酸序列预测的结构域结构世奇-1 和世奇-2 (SeChi-1, SeChi-2) 包含信号肽、一个 GH 家族 18 催化域、SeChi-1 中的一个几丁质结合域 (CBD) 和 SeChi-2 中的两个 CBD。蛋白质组分析显示，SeChi-1 中存在 125 个 CBP-A 的肽残基，而 SeChi-2 中存在 116 个 CBP-B 的肽残基。器官表达分析表明世奇-1 和世奇-2 仅在肝脏中表达S. esculenta. SeChi-1、SeChi-2 和 GH 家族 18 几丁质酶的系统发育分析表明，SeChi-2 属于一组先前报道的鱿鱼几丁质酶，而SeChi -1 不属于任何以前报道的软体动物几丁质酶组。

关键词

. 几丁质酶,几丁质 酶,分布, cDNA 克隆​​,金墨鱼Sepia esculenta

一、简介

几丁质是 N-乙酰基-D-氨基葡萄糖 (GlcNAc) 的 β-1,4 连接多糖，是一种丰富的可再生生物质，广泛存在于节肢动物的外骨骼、真菌的细胞壁和线虫的角质层中 [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ]。几丁质分解酶可根据其降解模式分为两类：内型几丁质分解酶，称为几丁质酶 (EC 3.2.1.14)，可降解随机几丁质聚合物以产生几丁质寡糖 (GlcNAc) n，以及外型几丁质分解酶，称为 β-N-乙酰氨基己糖苷酶 (Hex) (EC 3.2.1.52)，它从非还原端降解 (GlcNAc) n以产生 GlcNAc [ 5 ] [ 6] . 几丁质酶存在于各种生物体中，包括动物、植物和微生物，在消化、生长过程中的形态变化和免疫等生物过程中发挥着重要作用[ 5 ][ 7 ]。根据氨基酸序列的同源性 [ 4 ] [ 8 ] 及其活性域中的催化机制 [ 9 ] [ 10 ]，几丁质酶被分类为糖苷水解酶 (GH) 家族 18 或 19。GH 家族 18 几丁质酶广泛存在于生物学中，包括微生物、动物和植物中 [ 5 ]。相反，GH 家族 19 几丁质酶主要存在于植物中 [ 11 ]。

在海洋动物中，研究报道了主要从鱼胃中获得的参与消化的几丁质酶同工酶的纯化、性质和 cDNA 克隆 ​​[ 12 ] - [ 17 ]。鱼胃中的几丁质酶根据其一级结构和 (GlcNAc) n降解模式的差异分为两组：酸性鱼几丁质酶-1 (AFCase-1) 和酸性鱼几丁质酶-2 (AFCase-2) [ 16 ] [ 17 ] [ 18 ] [ 19 ]。相反，有关双壳类和腹足类软体动物的几丁质酶和几丁质酶样蛋白的 cDNA 克隆和表达的研究指出，这些在壳形成中起作用。20 ] [ 21 ] [ 22 ]、免疫 [ 23 ] [ 24 ] [ 25 ] [ 26 ] 和消化 [ 27 ]。已从 Decembrachiata（鱿鱼和墨鱼）的肝脏中纯化和研究了几丁质酶同工酶，并参与消化 [ 28 ] [ 29 ] [ 30 ] [ 31 ]。此外，在日本普通鱿鱼的肝脏中已经报道了两种几丁质酶同工酶，并根据分子量和 N 端氨基酸序列的差异进行鉴定 [ 29 ] [ 30 ]]，并且已经报道了在枪乌贼的肝脏中存在两种几丁质酶同工酶，并基于表达序列标签（EST）分析进行了鉴定[ 32 ]。然而，尚未确定全长基因。相反，几丁质酶已从章鱼 [ 33 ] 和墨鱼 [ 34 ] 的后唾液腺中获得，并被发现具有毒药作用。在夏威夷短尾鱿鱼 Eurymnascolopes [ 35 ] 的发光器官中发现了一种壳三糖苷酶基因，该基因参与了发光细菌的诱导。因此，软体动物几丁质酶的作用不仅限于消化，而且范围很广；因此，存在许多同工酶来支持这些不同的作用。

本研究中使用的金墨鱼 Sepia esculenta 属于 Decembrachiata，是一种软体动物，主要以甲壳类动物和鱼类为食，其中含有几丁质物质 [ 36 ]。我们之前已经报道了使用甘醇几丁质作为底物的几丁质酶活性分布 [ 37 ] 以及从 S. esculenta 肝脏中获得的几丁质酶的纯化和性质 [ 31 ]] ; 然而，尚未报道与几丁质酶同工酶相对应的酶蛋白和基因的发现。在这项研究中，我们首先使用两种几丁质酶特异性底物观察了猪笼草体内几丁质酶活性的分布，并从肝脏中分离出两种表现出特别高的几丁质酶活性的几丁质结合蛋白 (CBPs)。接下来，我们从肝脏中克隆了几丁质酶基因，获得了两种全长基因。此外，分析了基因的器官表达，比较了结构域结构，并基于推断的氨基酸序列进行了系统发育分析。阐明了两种类型的 CBP 之间的关系，并通过蛋白质组分析检查了获得的不同几丁质酶基因。总之，

2。材料和方法

2.1。材料

新鲜的 S. esculenta 购自筑地鱼市场（体重：183 克，肝脏重量：9.5 克）。

2.2. 几丁质分解酶活性的测量

从 S. esculenta 中取出器官用于后续分析。每个器官在 5 体积的 20 mM 磷酸盐缓冲液 (pH 7.2) 中均质化，然后将匀浆液以 7000 × g 离心 20 分钟。上清液用作粗酶溶液。使用对硝基苯基 (GlcNAc) n、 (pNP-(GlcNAc) n ) (n = 2, 3) (Seikagaku, Tokyo, Japan) 和 pNP-GlcNAc (Seikagaku) 作为底物分别测量几丁质酶和 Hex 活性，根据到Ohtakara描述的方法[ 38] ，稍作修改。简而言之，将 3.0 μL 粗酶溶液和 2.5 μL 4mM 底物溶液添加到 10 μL 0.2 M 磷酸盐-0.1 M 柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）中，然后将溶液在 37°C 下孵育 20 分钟。孵育后，加入 65 μL 0.2 M 碳酸钠溶液，在 420 nm 处测定释放的对硝基苯酚的吸光度。单位几丁质分解酶活性（U）定义为每分钟释放1 μmol对硝基苯酚的酶量，以每克器官的活性表示。

2.3. 从 S. esculenta 的肝脏中分离 CBP

除非另有说明，所有过程均在 0°C - 4°C 下进行。从新鲜的 S. esculenta 收集肝脏并保持在 -80˚C 直至使用。用五倍体积的 50 mM 乙酸钠缓冲液 (pH 5.5) 将肝脏均质化，并在 7000 × g 下离心 20 分钟。上清液中加入硫酸铵至70%饱和，静置24小时。然后通过在 7000 x g 下离心 20 分钟收集沉淀物，并在 20 mM 磷酸钠缓冲液 (pH 7.2) 中透析。将透析溶液以 7000 × g 离心 20 分钟，加入 NaCl 使浓度达到 1 M。将该溶液应用于几丁质亲和柱（几丁质 EX 柱）（Funakoshi，Tokyo，Japan）（1.5 × 10 cm ) 之前用含有 1 M NaCl 的 20 mM 磷酸钠缓冲液 (pH 7.2) 平衡，未吸附的部分用相同的缓冲液洗脱。吸附的部分用 0.1 M 乙酸洗脱。最后，吸附的部分用蒸馏水透析。使用 pNP-(GlcNAc) 测量几丁质酶活性2 .

2.4. 从 S. esculenta 肝脏中分离的 CBPs 的氨基酸序列

对几丁质酶活性部分进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 并用 AE-1360 Ez Stain Silver (ATTO, Tokyo, Japan) 染色。将凝胶切片切成小块并用脱色溶液(15 mMK 3 [Fe(CN) 6 ]、50 mM Na 2 S 2 O 3 )脱色。如 In-Gel Tryptic Digestion Kit (Thermo Scientific, Waltham, MA) 手册中所述，对脱色的凝胶块进行胰蛋白酶消化。对获得的肽混合物进行纳米级液相色谱-电喷雾 (Thermo Scientific)，该液相色谱-电喷雾 (Thermo Scientific) 配备有俘获喷雾电离源 (Michrom Bioresources, Auburn, CA) 和 Advance UHPLC 系统 (Michrom Bioresources)。

2.5. S. esculenta 肝脏几丁质酶的 cDNA 克隆

根据制造商的说明，使用 ISOGEN II（Nippon Gene，Tokyo，Japan）从 S. esculenta 肝脏中提取总 RNA。接下来，使用 1.0 μg 总 RNA、PrimeScript 逆转录酶（Takara Bio, Shiga, Japan）和 oligo dT 引物合成 cDNA（表 1）。反应条件为 90℃ 3 min、42℃ 60 min、70℃ 10 min。所用引物见表1，引物组合见图1. 在含有合成的 cDNA、Go Taq Green Master Mix（Promega，Madison，USA）的溶液中扩增内部序列，并使用来自几种生物的 GH 家族 18 几丁质酶的保守氨基酸序列设计简并引物。第一次 PCR 的 PCR 参数如下：95°C 初始变性 2 分钟，然后是 95°C 30 秒、55°C 1 分钟和 72°C 2 分钟的 35 个循环。巢式 PCR 使用相同的 PCR 参数进行，只是样品对于第一个 PCR 产物稀释了 10 倍。从几丁质酶设计正向和反向引物

(一)(二)

图 1。(a) SeChi-1、(b) SeChi-2 的 cDNA 结构示意图和引物的位置。箭头表示引物，箭头之间的线表示扩增的 cDNA 片段。

底漆

序列 (5'-3')

目的

寡核苷酸

CTGTGAATGCGACTACGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTT

cDNA合成

嘉*

GGNGGTGGAAYATGGG

初级 PCR

赤b*

TNGCNGCNTTYGARTGGAAYGA

初级 PCR

Chi-c*

ANCANRANCCNTTRGTYACCCA

初级 PCR

SeChi-1-1

GCACCAAAGAAAAAAGTTGAT

3'RACE

SeChi-2-1

GGACATAACAGCCCTCTG

3'RACE

3R

CTGTGAATGCGACTACGAT

3'RACE

SeChi-1-2

GCCCATGTTCCAGCCACC

5'RACE

SeChi-1-3

TTCGTCGTTCCACTCAAAAGC

5'RACE

SeChi-1-4

CCCATTCAGTTTGGCAAAAGC

5'RACE

SeChi-2-2

CGCTACCATGGCAGTGAAAGG

5'RACE

SeChi-2-3

CTTCATCCATGGTTCAGATTC

5'RACE

AAP

GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG

5'RACE

澳大利亚航空航天局

GGCCACGCGTCGACTAGTAC

5'RACE

SeChi-1-5

ACACATTACAGCAAA

全长ORF

SeChi-1-6

TAATAAATACCAAGATTAT

全长ORF

SeChi-2-4

CGGTTCTGGTGGACAAA

全长ORF

SeChi-2-5

GGCTGAAAAATAAAATGT

全长ORF

β-肌动蛋白-a

GGTATGTGCAAAGCTGGTTTT

器官表达

β-肌动蛋白-b

GTGGGTGACACCATCACCAGA

器官表达

SeChi-1-a

GAAACTTTGATGGTTTTGGACAT

器官表达

SeChi-1-b

TGTGTCCATACAAAGCAATTCC

器官表达

SeChi-2-a

GAGAAATACCCACTGCTGAAGA

器官表达

SeChi-2-b

AGAACAGTTAGGAATAGCGGAT

器官表达

表 1。用于 PCR、RACE 和器官表达的引物。

*简并引物；5'AAP：5'RACE 删节锚定底漆；AUAP：删节的通用锚定底漆。

通过内部序列扩增获得基因序列，上游（5'）和下游（3'）区域采用快速扩增cDNA末端（RACE）方法进行扩增。3' RACE 分析的 PCR 参数如下：在 95°C 初始变性 2 分钟，然后是 95°C 30 秒、55°C 1 分钟和 72°C 2 分钟的 35 个循环。根据制造商的说明，使用 Invitrogen (Carlsbad, CA) 提供的试剂盒进行 5' RACE 分析。通过 RACE 获得的内部序列和 PCR 产物在 2% 琼脂糖凝胶中进行电泳，使用 Quantum Prep®Freeze'N Squeeze 离心柱（Bio Rad，Hercules，CA）提取 DNA 并连接到 pGEM-T Easy Vector（Promega） . 从 S. 的肝脏中获得的全长几丁质酶基因。使用具有校对活性的 Platinum®Pfx DNA 聚合酶 (Invitrogen) 扩增 esculenta。反应条件为：94℃ 15 s，55℃ 30 s，68℃ 2 min，35个循环。使用与内部序列扩增描述的相同方法提取获得的全长基因。使用 Big Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) 确定碱基序列。

2.6. SeChi-1和SeChi-2的器官表达

从 S. esculenta 器官中提取总 RNA。使用从每个组织获得的 0.5 μg 总 RNA 和 oligo dT 引物合成 cDNA，并使用 1.0 μg 合成的 cDNA、SeChi-1、SeChi-2 和 Decembrachiata β-肌动蛋白扩增引物进行 PCR 扩增（表1 )。反应条件为：95℃ 30 s，55℃ 1 min，72℃ 2 min，30个循环。

2.7. 几丁质酶的系统发育分析

基于全长 SeChi-1 和 SeChi-2 基因的推断氨基酸序列的系统发育分析是使用从多种生物体中获得的几丁质酶基因进行的。使用 ClustalW (http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/) 和树视图进行分析。

3。结果与讨论

3.1。几丁质分解活动的分布

使用 pNP-(GlcNAc) 2和 pNP-(GlcNAc) 3作为底物的几丁质分解活性测量表明，在 S. esculenta 的八个测量器官中，参与消化的肝脏和胃以及后唾液腺，其中包含也发现存在于其他头足类动物中的几丁质酶基因 [ 33 ] [ 34 ] 表现出高活性（图 2 (a)）。当使用甘糖几丁质作为底物时，仅在肝脏、胃和盲肠中检测到几丁质酶活性[ 37 ]。此外，作为外型几丁质分解酶特征的 Hex 活性在以下六个器官中较高：肝脏、心脏、鳃心、后唾液腺、胃和盲肠。图 2 (b))。

(一)(二)

图 2。几丁质分解活性在器官中的分布： (a) 几丁质酶活性；(b) 十六进制活动。(■) pNP-(GlcNAc) 2；(■) pNP-(GlcNAc) 3；(□) pNP-(GlcNAc)。

在消化器官中，几丁质酶和Hex参与了几丁质物质作为饲料摄入后的降解。这与 S. esculenta 的摄食习性一致；也就是说，S. esculenta 摄取含有几丁质物质的生物体，例如虾和蟹 [ 36 ]，这表明 S. esculenta 使用内切型和外切型酶将饲料中的几丁质降解为 GlcNAc。此外，后唾液腺中的几丁质酶可能会起到毒药的作用，正如在其他头足类动物中观察到的那样 [ 33 ] [ 34 ]。此外，因为软体动物血液中的几丁质酶在免疫中具有重要作用 [ 23] ，心脏和鳃心中的几丁质酶不参与消化，参与防御含有几丁质物质的生物体，如寄生甲壳类动物和线虫。

3.2. 从 S. esculenta 的肝脏中分离 CBP

使用几丁质亲和柱，通过 0% - 70% 硫酸铵分级分离从 S. esculenta 肝脏获得的酶溶液中分离 CBP（图 3）。使用具有最高几丁质分解活性的部分进行 SDS-PAGE；检测到分子量为 52 和 62 kDa 的 CBP（CBP-A、CBP-B）（图 4）。

图 3。使用几丁质亲和柱色谱从 S. esculenta 的肝脏中分离几丁质结合蛋白 (CBP)。将样品溶液施加到预先用含有 1 M NaCl 的 20 mM 磷酸钠缓冲溶液 (pH 7.2) 平衡的几丁质 EX 柱上，并用相同的缓冲液洗脱未吸附的部分。吸附的部分用 0.1 M 乙酸洗脱。

图 4。CBPs的SDS-PAGE。（1：标记；2：通过几丁质 EX 柱色谱获得的几丁质酶活性级分。）

CBP-B 被认为是 SeChi，它是一种从 S. esculenta 肝脏中纯化的几丁质酶 [ 31 ]，因为 CBP-B 的分子量 (62 kDa) 与 SeChi 的分子量一致。两种类型的几丁质酶同工酶，分子量分别为 38 [ 28 ] 和 42 kDa [ 30 ]，此前已从日本普通鱿鱼的肝脏中纯化。这表明本研究中新检测到的CBP-A是猪肝中几丁质酶的同工酶。

3.3. S. esculenta 肝脏几丁质酶的 cDNA 克隆

以 S. esculenta 的肝脏为样本，使用从 GH 家族 18 几丁质酶的保守氨基酸序列设计的简并引物，通过 PCR 扩增几丁质酶 cDNA 的内部序列。结果，发现了约550bp大小的扩增片段，通过碱基测序获得了两种碱基序列。NCBI Blast 分析表明，这些碱基序列与夏威夷短尾鱿鱼 E. scolopes 的壳三糖苷酶具有同源性 [ 35 ]。上述碱基序列的上下游序列通过RACE法扩增。结果，在上游和下游区域鉴定了起始和终止密码子。然后，使用 Platinum®Pfx DNA 聚合酶扩增全长 cDNA。

获得了两个全长 cDNA，SeChi-1 (1484 bp) 和 SeChi-2 (1748 bp)，发现它们含有 1377-bp (459 个氨基酸) 和 1656-bp (552 个氨基酸) 的开放阅读框 (ORFs) ）， 分别。SeChi-1 和 SeChi-2 的分子量分别为 51.2 和 61.0 kDa，基于 SeChi-1 和 SeChi-2 的氨基酸序列推断（图 5和图 6）。分子量分别与通过 SDS-PAGE 测定的 CBP-A (52 kDa) 和 CBP-B (62 kDa) 的分子量非常相似。由 SeChi-1 和 SeChi-2 的氨基酸序列计算的等电点分别为 8.87 和

图 5。SeChi-1的cDNA和推断的氨基酸序列。DDBJ 登录号 AB986212。带下划线的序列显示与分离和胰蛋白酶消化的 CBP-A 的肽片段匹配（覆盖率：27.23%，125 个残基）。计算分子量：51228.59。等电点：8.87。

图 6。SeChi-2的cDNA和推断的氨基酸序列。DDBJ 登录号 LC319665。带下划线的序列显示与分离和胰蛋白酶消化的 CBP-B 的肽片段匹配（覆盖率：21.01%，116 个残基）。计算分子量：61012.53。等电点：8.79。

8.79，分别。这些值近似于从日本普通鱿鱼肝脏中纯化的几丁质酶同工酶的值，分别为 8.3 [ 28 ] 和 9.2 [ 30 ] ，表明来自十二鳃鳗肝脏的几丁质酶是基本蛋白质。

SeChi-1 和 SeChi-2 由 N 端信号肽、一个 GH 家族 18 催化结构域、一个用于 SeChi-1 的几丁质结合结构域 (CBD) 和两个用于 SeChi-2 的 CBD 组成（图 7）。SeChi-2 的结构域结构与先前报道的具有两个 CBD [ 35 ] 的鱿鱼几丁质酶的结构域结构一致。SeChi-1，只有一个 CBD，被发现是一种新的 Decembrachiata 几丁质酶。

图 8比较了软体动物和鱼类几丁质酶的结构域结构。据报道，鱼几丁质酶含有一种 CBD [ 18 ] [ 19 ]。常见鲭鱼胃几丁质酶（SjChi-1和SjChi-2）的结构域结构如图8所示作为例子。相反，软体动物几丁质酶的结构域结构是多样的；来自海兔性腺的几丁质酶 (AkChi) 和来自日本牡蛎几丁质酶 3 (CgChi-3) 的几丁质酶不具有 CBD；S. esculenta 肝几丁质酶 1 (SeChi-1) 和蜗牛 Biomphalaria glabrata 几丁质酶 3 样蛋白 1 (BgChi-3lp1) 拥有一个 CBD；S. esculenta 肝几丁质酶 2 (SeChi-2) 和来自三角帆蚌地幔的几丁质酶 3 (HcChi-3) 具有两个 CBD。这表明软体动物几丁质酶具有与其生理作用相对应的多个域结构。

3.4. 几丁质酶的氨基酸序列

通过胰蛋白酶处理将从 S. esculenta 肝脏中获得的两种 CBP（CBP-A 和 CBP-B）（图 3和图 4）片段化为肽，并通过蛋白质组与 SeChi-1 和 SeChi-2 的氨基酸序列进行比较分析。

图 7。S. esculenta 几丁质酶（SeChi-1 和 SeChi-2）与 Eurymna scolopes 壳三糖苷酶（EsChito）和 Todarodes pacificus 壳多糖酶（TpChi）的多重比对。GenBank 登录号：EsChito，AHM92582.1；TpChi，LC146770。匹配的序列以黑色显示。

图 8。示意图表示软体动物和鱼几丁质酶。黑框显示信号肽。白框显示 GH 家族 18 催化结构域。灰色框显示几丁质结合类型 2 域。GenBank登录号：AkChi，BAS44269；CgChi-3，AJ971239；BgChi-3lp，XP013090777；HcChi-3，AFO53261；SjChi-1，AB686657；SjChi-2，AB689022。

从CBP-A的肽片段获得的序列与SeChi-1的氨基酸序列一致（覆盖率：27.23%，125个残基）（图5）。从CBP-B的肽片段得到的序列与SeChi-2的氨基酸序列一致（覆盖率：21.01%，116个残基）（图6）。这些结果表明 SeChi-1 和 SeChi-2 分别编码 CBP-A 和 CBP-B。换言之，CBP-A是几丁质酶同工酶SeChi-1的蛋白质条带，CBP-B是几丁质酶同工酶SeChi-2的蛋白质条带。

据报道，胰蛋白酶可切割赖氨酸 (K) 和精氨酸 (R) [ 39 ]的 C 端侧。证实胰蛋白酶在所有切割位点均能充分发挥作用，因为所有获得的肽均以 K 或 R 结尾。

3.5. SeChi-1和SeChi-2的器官表达

研究了 SeChi-1 和 SeChi-2 在八个 S. esculenta 器官中的表达，发现这两个基因仅在肝脏中表达（图 9）。SeChi-2的表达强于SeChi-1（图9）。该结果与从肝脏分离的CBP的SDS-PAGE结果一致，SeChi-2编码的CBP-B条带比SeChi-1编码的CBP-A的条带粗（图4）。由于发现 SeChi-1 和 SeChi-2 在肝脏中表达，在肝脏中发现了几丁质分解活性，因此建议 SeChi-1 和 SeChi-2 编码参与该器官中几丁质降解的酶。此外，尽管在后唾液腺中检测到高几丁质分解活性，如图 2所示, SeChi-1 和 SeChi-2 都没有在那里表达。据报道，在其他头足类动物的后唾液腺中存在几丁质酶作为毒物[ 33 ] [ 34 ]。此外，表明在 S. esculenta 的后唾液腺中存在与 SeChi-1 和 SeChi-2 不同的几丁质酶同工酶。

3.6. SeChi-1和SeChi-2的系统发育分析

在氨基酸序列同源性的基础上，以其他生物的SeChi-1、SeChi-2、GH家族18几丁质酶和沙雷氏菌GH家族18几丁质酶为外群进行系统发育分析。SeChi-2 与其他 Decembrachiata 几丁质酶形成一个组，而 SeChi-1 不与任何软体动物几丁质酶形成一个组（图 10）。考虑到 SeChi-1 是第一个在 Decembrachiata 中鉴定到的具有一个 CBD 的几丁质酶（图 8），它被认为是一种新型几丁质酶。

图 9。几丁质酶和β-肌动蛋白在各种器官中的表达。(a) β-肌动蛋白；(b) SeChi-1；(c) SeChi-2。（M，标记；1，肝脏；2，心脏；3，鳃心；4，鳃；5，后唾液腺；6，胃；7，盲肠；8，地幔）。

图 10。使用 ClustalW 程序的邻接法对几丁质酶氨基酸序列进行系统发育分析。细菌几丁质酶，粘质沙雷氏菌几丁质酶，被用作外组。比例尺表示每个残基的替代率。箭头显示在本研究中获得的 SeChi-1 和 SeChi-2。

4。结论

在这项研究中，测量了 S. esculenta 中几丁质分解酶活性的分布，并在肝脏等消化相关器官中发现了高几丁质分解活性。这些几丁质酶可能会降解摄入的几丁质物质。此外，在后唾液腺中观察到高几丁质分解活性。正如在其他头足类动物中观察到的那样，后唾液腺中的几丁质酶可能起到毒物的作用。其他器官中的几丁质分解活性表明几丁质酶参与防御寄生虫和其他活动。从 S. esculenta 的肝脏中分离出两种分子量分别为 52 和 62 kDa 的 CBP（CBP-A 和 CBP-B）。CBP-B 的分子量与 SeChi 的分子量一致，SeChi 是一种先前从 S. esculenta 肝脏中纯化的几丁质酶。CBP-A 被认为是从 S. esculenta 的肝脏中获得的几丁质酶同工酶。编码两种几丁质酶（SeChi-1、SeChi-2）的全长 cDNA（SeChi-1、SeChi-2）从 S. esculenta 的肝脏中获得。SeChi-1和SeChi-2的氨基酸序列计算分子量分别为51.2和61.0 kDa，等电点分别为8.87和8.79，表明它们是碱性蛋白质。SeChi-1 包含一个 CBD，而 SeChi-2 包含两个 CBD。分析从 S. esculenta 肝脏中分离的 CBPs 的肽片段，并通过蛋白质组分析与 SeChi-1 和 SeChi-2 的氨基酸序列进行比较。从 CBP-A 的肽片段获得的序列与 SeChi-1 的氨基酸序列一致 (27. 23%)，从 CBP-B 的肽片段中获得的序列与 SeChi-2 (21.01%) 的氨基酸序列一致。在研究的 S. esculenta 器官中，SeChi-1 和 SeChi-2 仅在肝脏中表达。这表明这两种几丁质酶参与了肝脏中几丁质的降解。这两种几丁质酶基因在后唾液腺中不表达，在后唾液腺中检测到高几丁质分解活性。这表明其他几丁质酶同工酶存在于后唾液腺中。系统发育分析表明，SeChi-2 与其他 Decembrachiata 几丁质酶形成一个组，而 SeChi-1 不与软体动物几丁质酶组。考虑到 SeChi-1 代表了第一个在 Decembrachiata 中拥有一个 CBD 的几丁质酶，SeChi-1 被认为是一种新型几丁质酶。在研究的 S. esculenta 器官中，SeChi-1 和 SeChi-2 仅在肝脏中表达。这表明这两种几丁质酶参与了肝脏中几丁质的降解。这两种几丁质酶基因在后唾液腺中不表达，在后唾液腺中检测到高几丁质分解活性。这表明其他几丁质酶同工酶存在于后唾液腺中。系统发育分析表明，SeChi-2 与其他 Decembrachiata 几丁质酶形成一个组，而 SeChi-1 不与软体动物几丁质酶组。考虑到 SeChi-1 代表了第一个在 Decembrachiata 中拥有一个 CBD 的几丁质酶，SeChi-1 被认为是一种新型几丁质酶。在研究的 S. esculenta 器官中，SeChi-1 和 SeChi-2 仅在肝脏中表达。这表明这两种几丁质酶参与了肝脏中几丁质的降解。这两种几丁质酶基因在后唾液腺中不表达，在后唾液腺中检测到高几丁质分解活性。这表明其他几丁质酶同工酶存在于后唾液腺中。系统发育分析表明，SeChi-2 与其他 Decembrachiata 几丁质酶形成一个组，而 SeChi-1 不与软体动物几丁质酶组。考虑到 SeChi-1 代表了第一个在 Decembrachiata 中拥有一个 CBD 的几丁质酶，SeChi-1 被认为是一种新型几丁质酶。这表明这两种几丁质酶参与了肝脏中几丁质的降解。这两种几丁质酶基因在后唾液腺中不表达，在后唾液腺中检测到高几丁质分解活性。这表明其他几丁质酶同工酶存在于后唾液腺中。系统发育分析表明，SeChi-2 与其他 Decembrachiata 几丁质酶形成一个组，而 SeChi-1 不与软体动物几丁质酶组。考虑到 SeChi-1 代表了第一个在 Decembrachiata 中拥有一个 CBD 的几丁质酶，SeChi-1 被认为是一种新型几丁质酶。这表明这两种几丁质酶参与了肝脏中几丁质的降解。这两种几丁质酶基因在后唾液腺中不表达，在后唾液腺中检测到高几丁质分解活性。这表明其他几丁质酶同工酶存在于后唾液腺中。系统发育分析表明，SeChi-2 与其他 Decembrachiata 几丁质酶形成一个组，而 SeChi-1 不与软体动物几丁质酶组。考虑到 SeChi-1 代表了第一个在 Decembrachiata 中拥有一个 CBD 的几丁质酶，SeChi-1 被认为是一种新型几丁质酶。系统发育分析表明，SeChi-2 与其他 Decembrachiata 几丁质酶形成一个组，而 SeChi-1 不与软体动物几丁质酶组。考虑到 SeChi-1 代表了第一个在 Decembrachiata 中拥有一个 CBD 的几丁质酶，SeChi-1 被认为是一种新型几丁质酶。系统发育分析表明，SeChi-2 与其他 Decembrachiata 几丁质酶形成一个组，而 SeChi-1 不与软体动物几丁质酶组。考虑到 SeChi-1 代表了第一个在 Decembrachiata 中拥有一个 CBD 的几丁质酶，SeChi-1 被认为是一种新型几丁质酶。

致谢

这项工作得到了日本大学格兰特生物资源科学学院 (2017) 的部分支持。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

参考

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