非洲绿叶蔬菜遗传多样性研究的分子标记

摘要：

非洲多叶蔬菜正成为解决撒哈拉以南非洲许多地区营养和粮食安全问题的重要作物，因为它们提供重要的微量营养素和维生素，并帮助资源匮乏的农户渡过粮食短缺的贫瘠时期。遗传多样性研究对于作物改良计划和种质资源保护工作至关重要，并且随着时间的推移，使用分子标记对这些蔬菜的遗传多样性进行的研究一直在增加。多样性研究已经从使用形态学和生化标记发展到分子标记。分子标记提供有价值的数据，因为它们主要检测 DNA 水平的选择性中性变异。它们已经很成熟，并且已经描述了它们的优势和局限性。正在开发新的标记类型，结合基本技术的优势，以提高灵敏度、再现性、多态信息内容、速度和成本。本综述讨论了一些已建立的分子标记的原理及其在非洲叶菜遗传多样性研究中的应用，主要关注最常见的茄属、苋属、Cleome和豇豆种。

关键词

AFLPs , Allozymes , Amaranthus , Cleome , ISSRs , Microsatellites , RAPDs , SNPs , Solanum , SSRs , Vigna

一、简介

非洲叶菜包括那些原产于非洲的蔬菜 [ 1]，以及已融入当地饮食文化并已本土化的引进蔬菜作物。它们在野外自发生长，在家庭花园中半驯化或驯化。由于它们对营养和粮食安全的贡献，它们是非洲大陆重要的新兴作物——它们由于其早熟、健壮和易于种植而帮助人们度过粮食短缺季节。此外，根据我们的经验，它们是撒哈拉以南非洲农村和城郊地区资源匮乏人群（主要是妇女）的重要收入来源。过去，这些作物很少受到研究关注，但现在它们被多方面研究，遗传多样性是主要研究重点之一。为了建立有效和可持续的育种计划并决定合理的保护策略，对现有遗传多样性的了解是必不可少的。遗传多样性可以通过形态标记、生化成分（例如次级代谢物）和/或大分子（蛋白质和脱氧核糖核酸-DNA）来检测。分子标记主要检测 DNA 水平的选择性中性变异，是遗传多样性研究不可或缺的工具，具有高精度和可重复性。

形态特征已被用于非洲叶菜的多样性分析，如茄属、豇豆、苋属和 Cleome gynandra [ 2 ] - [ 5 ]。这些性状的局限性是由于某些性状的可塑性和环境条件引起的修饰。此外，形态标记的数量有限，无法覆盖植物物种的所有基因组区域，因此不太适合用作标记。然而，形态标记和分子标记的相关性可以提供基本信息来解释表型变异的遗传学[ 6] . 其他用于评估遗传多样性的经典策略（例如同工酶）也得到了 DNA 标记的补充，因为它们有几个缺点，例如给定基因组中合适的位点数量有限，需要高发育阶段的新鲜组织以及受制于由于环境的变化。今天，分子标记是遗传多样性研究中不可或缺的工具，具有高精度和可重复性。一个理想的分子标记应该具有以下品质[ 7 ]：

1）高度多态性和可重复性；

2) 充分解决遗传差异，例如高信息量；

3) 简单、快捷、便宜；

4）需要少量组织和DNA；

5) 与不同表型的联系；和

6) 不需要有关生物体基因组的先验信息。

在单一标记技术中找到所有这些品质几乎是不可能的。因此，标记或标记组合的选择将取决于研究类型和物种。完善的基于 DNA 标记的技术，例如限制性片段长度多态性 (RFLP)、随机扩增多态性 DNA (RAPD)、简单序列重复 (SSR)、简单序列重复间 (ISSR)、扩增片段长度多态性 (AFLP) 和单核苷酸多态性（SNP）已被用于非洲叶菜的遗传多样性研究。这些标记的基因组丰度、多态性水平、位点特异性、可重复性、显性或共显性、技术要求和财务投资各不相同。一般来说，8 ]。这篇综述旨在讨论一些已建立的分子标记的原理及其在非洲叶菜遗传多样性研究中的应用，主要关注最常见的茄属、苋属植物、Cleome 和 Vigna 物种。

2. 非洲叶菜遗传多样性研究中的分子标记

2.1。等位酶

等位酶是由于编码直系同源基因的等位基因差异而在一个或几个氨基酸上不同的酶的变体 [ 7] . 对于等位酶分析，蛋白质是从植物组织中提取出来的，并通过电泳根据它们的净电荷、构象和大小进行分离。DNA 中的突变可能导致氨基酸的替换，从而改变净电荷和蛋白质的整体形状（构象）。这些蛋白质修饰会影响蛋白质在电场中的迁移速率，从而允许通过凝胶电泳和随后的酶特异性染色检测等位基因变异。这些染色剂含有酶的相应底物、辅因子和氧化盐（例如硝基蓝四唑）。因此，等位酶在凝胶中成为可见的条带，它们的数量反映了基因座和等位基因（纯合或杂合）的数量，以及在某些情况下可以分离的蛋白质亚基的数量。7 ]。

等位酶技术很简单，因为它不需要 DNA 提取或序列信息。然而，注意到在某些物种中为优化某些酶付出了相当大的努力。如果不需要昂贵的酶染色试剂，可以以低成本应用等位酶。等位酶是高度可重复的共显性标记。然而，一些限制包括可以使用的合适的等位酶基因座数量有限、需要大量新鲜组织以及有时由于相同的电泳迁移率导致的有限变异，即使对于远缘相关的种质 [ 9 ]。

等位酶与 RAPD 相结合被用于尼日利亚的 Vigna luteola 和 V. marina [ 10 ] 的遗传多样性分析。13 个测试的等位酶基因座中有 7 个被发现是多态的。主要检测到不同种群之间的变异，而基于等位酶分析的两个物种内的遗传多样性较低。使用 RAPD 可以获得更高的分辨率 [ 10 ]。使用等位酶对豇豆属进行的其他遗传多样性研究包括非洲不同地区的野生和栽培豇豆 (V. unguiculata) 种质 [ 11] . 研究结果证实了先前的形态分类，并允许明确区​​分该物种中存在的不同育种系统（异交和自交）。Kouam 等人研究的一组来自西非的野生豇豆种群，重点是加纳、布基纳法索和尼日利亚。(2012) [ 12 ] 使用九个多态性等位酶基因座揭示了由于流行的近交育种系统，种群之间存在明显的遗传差异和低水平的遗传多样性。

在 Amaranthus 中，Di Renzo 等人。(2000) [ 13 ] 使用七种酶系统来检查商业栽培品种和代表来自苋菜育种计划的七种不同物种的实验菌株的遗传多样性。根据遗传多样性指数，60%的变异是种间的，40%是种内的。

2.2. 随机扩增多态性 DNA (RAPD)

RAPD [ 14 ] 涉及使用短随机寡核苷酸引物来实现由基因组中引物位点之间的突变或长度突变产生的 DNA 多态性。该技术的关键创新是使用任意引物，不需要基因组的先前序列信息。与所有 PCR 引物一样，RAPD 引物必须满足两个标准：至少 40% 的 GC 含量和不存在回文序列（从左到右和从右到左读取完全相同的碱基序列）。威廉姆斯等人。(1990) [ 14] . RAPD 片段中的多态性主要通过条带的存在或不存在来检测。它的简单性和低成本是其广泛应用的原因。然而，RAPD 技术对反应条件高度敏感，因此不同实验室之间的重现性较低 [ 15 ]。

使用 RAPD 标记 [ 16 ]分析了来自印度恒河平原不同地区的六种苋属物种之间和内部的遗传多样性和关系。发现不同苋菜的遗传多样性存在很大差异，相似系数介于 0.16 和 0.97 之间。

在豇豆中，Nkongolo (2003) [ 17 ] 使用 20 个 RAPD 引物对 38 个马拉维地方品种种质进行了表征，并对 143 个 DNA 片段进行了评分。他们的研究表明，地理区域或群体内种质之间的变异占总分子变异的 96%，这是由于种群之间不受控制的基因流动造成的。巴等人。(2004) [ 18] 使用 202 个 RAPD 标记带表征了驯化的豇豆及其以从西非、东非和南部非洲获得的野生种质为代表的野生祖先。RAPD 分析表明，来自东非（拟议的原产地）的野生种质在 V. unguiculata var. 中更加多样化。自发的。此外，原始品种比更先进的品种表现出更高的遗传多样性。赞努等人。(2008) [ 19 ] 使用 RAPD 标记揭示贝宁 70 个豇豆种质的遗传多样性。尽管基于数量相当少的只有 32 个多态性条带，但他们的研究在种质中检测到了很高的遗传多样性，这证实了 Mignouna 等人先前涉及 120 个引物的更详细的研究。(1998) [ 20] . 他们认为，高变异可能表明所研究的种质具有不同的血统。Ghalmi 等人使用形态特征、ISSR 和 RAPD 标记的组合方法。(2010) [ 21 ] 比较了阿尔及利亚的 20 个地方品种豇豆品种。单独的 RAPD 标记与用于聚类种质的形态数据不相关，但当与 ISSR 数据结合时，发现了显着的相关性。马尔维亚等人。(2012) [ 22] 使用 18 组 RAPD 引物产生 148 个多态性条带，分析了 10 个印度豇豆品种的遗传多样性。检测到的相对较窄的遗传基础被认为是由于在该作物的起源中发生的单一驯化事件。作者还得出结论，种子保护实践仅导致整个印度的种质交换有限，也没有将来自外国的基因型整合到当地的育种计划中。

Poczai 等人还使用 RAPD 和形态学标记研究了属于 Solanum 部分的 12 个种质的遗传变异和系统发育关系。（2010 年）[ 5 ]。通过 210 个多态性 RAPD 标记和形态学标记将种质聚类到相似的组中，然而，在一些 S. scabrum var. 中观察到了形态学差异。scabrum 种质与各自的分子数据无关。在蜘蛛植物（C. gynandra）中，K'Opondo 等人。(2009) [ 23 ] 基于 31 个多态性 RAPD 条带研究了从肯尼亚小农或野生植物中收集的四种形态类型（由茎和叶柄的颜色定义），并且可以分离所有四种形态类型。

2.3. 扩增片段长度多态性 (AFLP)

AFLP 技术 [ 24] 已被公认为目前可用的最有效的标记之一。它能够同时筛选在整个基因组中随机分布的代表性 DNA 区域。它结合了 RFLP 的优势和基于 PCR 技术的灵活性，通过将带有引物识别序列的接头盒连接到限制性 DNA 上，并使用一组有限的引物对限制性片段进行选择性 PCR 扩增。AFLP 生成任何 DNA 的指纹，并且不需要事先了解 DNA 序列。AFLP 标记的重现性也很高。缺点包括需要纯的高分子量 DNA，需要对这种标记类型进行显性评分，以及属于不同基因座的共迁移片段可能存在非同源性 [ 8] . 此外，由于每个引物组合的条带数量多且强度不同，因此需要采用某些严格但主观确定的标准来接受分析中的条带。AFLP 片段的检测是在变性聚丙烯酰胺凝胶上进行的，主要使用自动测序仪或自动毛细管测序仪，但银染凝胶也可以目测评估。

AFLPs 已被用于研究几种非洲叶菜的遗传多样性。在茄属植物中，Jacoby 等人。（2003 年）[ 25 ] 比较了 14 种基因型的遗传关系，其中大部分是由形态学标记建立的 S. nigrum 复合体与 AFLP 分析中获得的基因型，包括 222 个多态性标记。两种方法都将不同的基因型分开并将它们聚集到相似的组中。德默和哈默 (2004) [ 26] 使用两种 AFLP 引物组合来表征德国 Gatersleben 基因库中 44 份 S. nigrum L. 复合体中存在的遗传多样性。他们能够对分类学上未知的材料进行分类，并将所检查的种质的聚类与其地理来源相关联。此外，在四个已确定的组中检测到不同水平的遗传多样性，其在 S.美洲 内的种下变异高于其余物种的种间变异。为了获得对分类困难的 S. nigrum 复合体的新见解，Olet 等人。(2011) [ 27] 使用 AFLP 评估了代表 8 个茄属植物的 107 个种质（90 个在乌干达收集，17 个来自基因库）之间的遗传关系。尽管在 510 个 AFLP 条带中只有 31 个是多态的，但 Olet 等人。(2011) [ 27 ] 能够得出结论，所分析的种质仅代表五个物种，并且大多数物种必须被引入乌干达。

几项使用 AFLP 的研究也检查了豇豆遗传多样性。库利巴利等人。(2002) [ 28 ] 评估了总共 117 个豇豆种质内的遗传关系，包括来自东非和西非的驯化和野生形式。他们发现 AFLP 优于在早期研究中应用的等位酶。观察到野生种质的遗传多样性高于栽培种质，来自东非的野生材料的更高多样性支持了该物种起源于东非的观点。此外，AFLP 数据与北非提出的独特驯化事件一致 [ 28] . 通过三个 AFLP 引物组合，总共产生 253 个条带，由于种质内明显的变异性，无法完全解析 V. unguiculata 的不同亚种 [ 29 ]。方等人。(2007) [ 30 ] 还通过对总共 382 个 AFLP 条带（207 个多态性）进行评分，检查了来自不同育种计划的 60 个豇豆高级育种系和 27 个不同来源的地方品种种质之间的遗传关系。尽管分析的材料来源不同，但观察到了非常高的遗传相似性。由于根据育种计划清楚地收集了材料，因此作者建议交换材料，特别是与西非育种计划。

基于 AFLP（和 ISSR）分析的 30 个苋属植物种质和栽培品种的树状图显示所有分类群都明确分配到不同的簇群中，由于 ITS（内部转录间隔区）中的低序列变异，这通过序列比较是不可能的地区 [ 31 ]。

2.4. 简单序列重复 (SSR)

SSRs 标记，也称为微卫星或短串联重复，是非常短的（1 到 5 个）核苷酸基序重复，在所有真核基因组中作为散布的重复元件出现 [ 32 ]。Schlotterer 和 Tautz (1992) [ 33 ] 建议 DNA 复制过程中的链滑移会导致串联重复单元数量的变化，因为重复允许通过切除或添加重复进行匹配。SSR 使用未标记的引物对或一种放射性或荧光标记的引物。使用聚丙烯酰胺或有时使用琼脂糖凝胶分析未标记的 SSR-PCR 产物。自动测序仪的激光检测使荧光标记的微卫星引物能够高效、高通量地应用 [ 34]，但另一方面，这使得 SSR 技术与其他标记相比成本相对较高 [ 6 ]。SSR 引物的开发和测试也很耗时，特别是对于那些必须重新设计引物序列或对于未研究的群体来说不足的物种。然而，这些标记具有许多优点，例如等位基因的共显性、高重现性、不需要高质量的少量所需模板 DNA、真核生物中的高基因组丰度以及整个基因组中的随机分布 [ 6 ] .

最近，SSR 已被用于非洲叶菜的大多数遗传多样性研究：Van Biljon 等人。(2010) [ 35 ] 研究了 S. nigrum 复合体及其后代的 SSR 引物，这些引物部分从其他经济重要的茄属植物中转移而来。他们发现了种质之间的密切关系，因此证实了 S. nigrum 复合体在分类学上难以解决的事实。

通过 27 个多态性 SSR 标记中的 5 个，Li 等人。(2001) [ 36 ] 区分了 90 个豇豆育种系中的 88 个。对于完整的 27 条引物，每个引物检测到 2 到 7 个等位基因，但引物的 PIC（多态信息含量）差异很大，介于 0.02 和 0.73 之间（平均值：0.45）[ 36 ]。使用相同的引物组，Diouf 和 Hilu (2005) [ 37 ] 发现 SSR 标记是比 RAPD 更强大的工具，可以阐明豇豆本地品种和塞内加尔育种系之间的关系。后来，Asare 等人。(2010) [ 38] 设计了来自序列读数的引物，用于研究来自加纳 9 个地理位置的 141 个豇豆种质的多样性。他们发现 PIC 范围为 0.07 到 0.66，平均为 0.38，平均杂合度为 0.19。加入物聚集成五个主要分支，但仅观察到与地理起源的松散相关性。使用 16 种 SSR 引物组合研究了 16 种豇豆基因型之间的系统发育关系和遗传多样性，这些基因型用于布基纳法索的 Striga gesnerioides 抗性育种计划 [ 39] . 发现独脚金抗性品种的 SSR 谱非常相似，只有极少数引物组合显示出可以区分抗性品种和易感品种的多态性。SSR 还被用于评估在塞内加尔采集的 22 个当地豇豆品种和自交系之间的遗传多样性 [ 40 ]。与早期研究相比，从表达的序列标签推导出的 44 个多态性引物组合的 PIC 范围较低，为 0.08 至 0.33，并且栽培品种聚集在具有某些形态特征特征的组中。

2.5. 简单序列重复间 (ISSR)

ISSR 是长度约为 100 - 3000 bp 的 DNA 片段，位于两侧的微卫星区域之间。ISSR 技术 [ 41 ] 涉及扩增存在于两个相同微卫星区域之间的 DNA 片段，这些微卫星区域彼此相反。通过单个微卫星引物，不同大小的 ISSR 在针对多个基因组位点的 PCR 反应中被扩增。因此，一次产生几个基因座的片段，通过凝胶电泳分离并评分存在或不存在。ISSRs 主要是显性标记，尽管偶尔它们中的一些表现出共显性遗传。ISSR 与 AFLP 和 RAPD 相似，因为它们不需要序列数据来构建引物 [ 42] . 它们还需要少量的 DNA 模板进行 PCR，并且随机分布在整个基因组中。此外，它们简单、快速且不需要使用放射性。尽管有这些优点，ISSR 在可重复性方面可能存在问题，并且它们的显性遗传和共迁移扩增产物的同源性会导致与 RAPD 类似的问题。根据小岛等人的说法。(1998) [ 43 ] ISSR 显示出高水平的多态性，但这取决于所使用的检测方法。聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 与放射性标记的引物组合显示最敏感，其次是 PAGE 和 AgNO 3染色，然后是琼脂糖凝胶，通过溴化乙锭染色进行检测。

ISSR 与RAPDs 和SSRs 结合用于评估31 个苋属植物的遗传多样性[ 44 ]。所有标记将种质分开，但导致不同的簇结构，需要进一步分析。另一项研究 [ 45 ] 使用 ISSR 对属于 3 个物种的 56 个苋属种质进行多样性分析，并基于 11 个 ISSR 引物分离苋属物种，只有少数例外。

在 Vigna Ajibade 等人的属中。(2000) [ 46 ] 应用 ISSR 调查该属内的 62 个分类群，重点是 V. unguiculata。在测试的 19 种引物中，15 种非常有效，产生了 63 个 DNA 片段。可以在物种水平及以下区分分类群，然而，ISSRs 不适合在豇豆内明确区分亚属。加尔米等人。(2010) [ 21 ] 用 12 个 ISSR 引物对阿尔及利亚 20 个地方品种豇豆种质进行了表征，发现遗传数据与地理分布存在相关性。Vila-Nova 等人。(2014) [ 47] 研究了 27 个豇豆品种的遗传变异性和象鼻虫抗性。十个 ISSR 引物揭示了大的遗传变异性和足够的多态性来区分所有 27 个豇豆品种。然而，遗传变异性与所测试品种的抗性无关。

Poczai 和 Hyvönen (2011) [ 48 ] 应用 ISSR 标记结合起始密码子靶向多态性 (SCoT) 和叶绿体序列数据以及形态学特征分析了龙葵复合体的二倍体、四倍体和六倍体茄种之间的遗传关系。他们发现二倍体物种的所有种质与所有多倍体物种共享一个簇，并得出结论，多倍体物种起源于遗传分化的二倍体的少数组合。

2.6. 单核苷酸多态性 (SNP)

SNP 是两个或多个个体基因组中的单碱基对位置，在这些位置上，群体中出现不同的序列替代（等位基因）。SNP 通常很丰富，但它们的密度在基因组的不同区域之间在任何物种的基因型之间存在显着差异，在物种之间更是如此。例如，Sachidanandam 等人。(2001) [ 49 ] 报道说，人类基因组中 SNP 的平均密度估计约为 1 in 1000 bp，但在某些基因组区域（例如非编码人类白细胞抗原 (HLA) 区域 [ 50 ] ）要大得多。在迄今为止分析的植物物种中，通常每 200 到 500 bp 大约存在一个 SNP，不同植物物种之间存在很大差异。例如，玉米每 60 - 120 bp 有 1 个 SNP [ 51] . SNP技术结合了两个要素，即等位基因特异性产物的产生和产物的分析。SNP 的检测方法可以是直接杂交技术，也可以是那些涉及等位基因特异性产物的产生和分离的技术 [ 52] . 通过对大量基因型进行比较测序来开发 SNP 标记的高成本是在经济重要性有限的植物中使用 SNP 的限制。SNP 因其每个基因组的总数、相对较低的突变率、在整个基因组中的分布以及相对易于检测而脱颖而出。高通量基因分型方法（如 DNA 芯片）的适用性使 SNP 作为遗传标记引人注目。SNP 的自动化也是可能的，例如用于识别基因型和构建高密度遗传图谱 [ 53] . 直到最近，SNP 在非洲叶菜遗传多样性研究中的首次应用才出现，旨在使用 1200 个 SNP [ 54 ] 对全球范围内的地方品种和非洲祖先野生豇豆进行基因分型，这与早期的陈述相反，揭示了两个主要基因的存在。池（东非和西非）和非洲栽培豇豆的不同驯化事件。下一代测序成本的进一步降低将使低成本的 SNP 检测和 GBS（通过测序进行基因分型）或相关技术在不久的将来甚至可用于经济重要性较小的作物。

三、结论

本次审查的 33 项研究（发表于 1998 年至 2015 年）表明，RAPD 已在大多数（25% 的研究）中使用，而 SNP 仅在 3% 中使用，等位酶在 12% 中，AFLP 在 22% 中，以及19% 的研究中的每个 SSR 和 ISSR。RAPDs 已特别用于调查来自不同地理区域的单个物种的种质之间的遗传关系和物种之间的系统发育关系。Allozymes、AFLPs、SSRs 和 ISSRs 已在种间和种内水平上使用。大多数研究涵盖豇豆 (58%)、茄属 (24%) 和苋菜 (15%)，而在涉及遗传多样性研究时，C. gynandra 几乎没有受到研究关注（仅占所有研究的 3%）。分子工具将越来越重要，使这些和其他非洲叶菜的遗传研究能够解决有关进化起源、多样性中心、驯化、种群遗传结构、种质表征和建立重要农艺性状标记的问题。用于此的标记技术将随着技术发展的进一步进步而改变。如果比较基于 PCR 的标记，RAPD 已被频繁使用，因为它们价格便宜，既不需要序列信息也不需要高质量的 DNA。然而，ALFP 和 SSR 以及可能的 SNP 在未来的研究中被推荐，因为它们具有更好的可重复性和更高的信息量。

致谢

作者非常感谢德国联邦教育和研究部 (BMBF) 和德国联邦经济合作与发展部 (BMZ) 在 GlobE-全球粮食安全计划框架内为 HORTINLEA 项目提供的资金。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

参考

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