香薰中常用的一些精油的遗传毒性

时间：2022-11-17　|　作者：admin

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摘要：

Drosophila melanogaster 体细胞突变研究了从Artemisia dracunculus（龙蒿）、Ocimum basilicum（罗勒）、Cinnamomum loureirii（肉桂）、Laurus nobilis（月桂树）、Satureja montana（咸味）和Rosmarinus officinallis （迷迭香）中提取的精油的遗传毒性和重组测试 (SMART)。使用与高细胞色素 P450 依赖性生物活性能力交叉的高生物活性。该测定主要基于合适的隐性标记的多翼毛 ( mwh ) 和 flare-3 ( flr 3 ) 的杂合性丢失) 这会导致幼虫细胞突变克隆的形成，然后在成年果蝇的翅膀上表现为斑点。三龄幼虫用溶解在 Tween-80 中的不同浓度的精油以 0.2% 或 2% 处理 48 小时。对新兴成虫的翅膀进行了分析，以确定是否存在不同类型的突变点。观察到阴性对照和处理系列之间的斑点频率没有统计学上的显着差异。这些结果表明，测试浓度下的六种精油对黑腹果蝇的体细胞没有遗传毒性。

关键词

精油,遗传毒性,体细胞突变,有丝分裂重组,黑腹果蝇

一、简介

精油是存在于多种植物特有香味中的天然挥发性物质。它们是植物次生代谢的产物，通常是由复杂混合物组成的芳香挥发性物质，其中最常见的成分是单萜烃、含氧单萜、倍半萜烃、含氧倍半萜、苯衍生物和非异戊二烯组分，包括醇类、醛类和酮类。香料、香草和叶类蔬菜中赋予香味的精油含量很重要，占其新鲜质量的 5% 以上 [ 1 ]。精油通常可以通过蒸馏法从植物的几个部分中分离出来。

精油已广泛用于传统医药、食品添加剂或食品防腐剂以及芳香疗法以及香水和化妆品行业。在过去的几年里，人们对精油的使用越来越感兴趣，因为已经对其中的大量精油进行了生物活性研究。事实上，500 多份报告中描述了精油及其成分对某些细菌和真菌的抗菌特性 [ 2 ]。此外，已在实验动物身上观察到精油的消炎、止咳和解痉作用 [ 3 ]。此外，精油还可以作为抗氧化剂 [ 4 ] 、杀虫剂 [ 5 ] 发挥重要作用] 抗炎镇痛 [ 6 ] 。此外，还揭示了特定精油的保肝 [ 7 ] 和抗癌活性 [ 8 ]。然而，只有少数论文包含有关其毒性的数据，而有关其致畸、致癌和致突变等慢性毒性的数据则更少。不过，必须指出的是，关于精油各个成分的遗传毒性研究要丰富得多，已经对大约 30 种精油成分（主要是单萜和烯基苯）进行了遗传毒性测试。其中约三分之一在一项或多项遗传毒性试验中显示出遗传毒性作用 [ 9 ] 。

基于这些初步信息，并在我们对评估我们的天然香精 [ 10 ] - [ 12 ] 遗传毒性特征的一贯兴趣的引导下，本研究的目的是调查芳香疗法中经常使用的六种精油的遗传毒性果蝇中的体细胞突变和重组试验 (SMART)。

遗传毒性试验的开发是为了检测遗传毒性物质并评估化学品对人类的遗传危害。黑腹果蝇的测试具有毋庸置疑的优势：它们是一个体内系统，使用真核生物，其代谢机制与哺乳动物细胞中的机制相似 [ 13 ]，并且基因组测序表明，一半已识别的蛋白质序列与哺乳动物蛋白质 [ 14 ] 。另一方面，与原核或单细胞体外试验相比，这些试验的特点还在于它们的快速性 [ 15 ]。

SMART 是一种用于检测体细胞突变和有丝分裂重组的灵敏短期检测方法 [ 13 ]。它已被广泛用于基于眼睛或翅膀标记的两个版本中[ 16 ] [ 17 ]。在这两种情况下，杂合性的丢失都会导致隐性标记基因在幼虫成虫盘细胞中的暴露和表达。SMART 测定已得到广泛验证，自该测定开发以来，已分析了数百种化合物和复杂混合物 [ 18 ]。

使用翅膀组织的 SMART 系统基于标记 mwh（多翼毛）和 flr（耀斑），并利用了暴露和分析大量细胞的可能性：一个翅膀中大约有 25,000 个细胞 [ 19 ]。如果在幼虫中发生遗传改变，这种改变将形成突变细胞的克隆，可以作为成年果蝇体表上的突变细胞斑点被检测到 [ 19 ]。单点（mwh 或 flr）可由体细胞点突变或缺失产生，也可能由非整倍体或染色体丢失引起 [ 13 ] [ 20 ]] 。单个 mwh 点也来自 mwh 和 flr 基因座之间的重组。由 mwh 和 flr 亚克隆组成的双点完全来源于有丝分裂重组 [ 13 ] [ 20 ]。机翼 SMART 测定法检测到的所有这些突变事件都可以很好地测量所测试的精油可能引起的诱变损伤。

二、材料与方法

2.1. 精油和植物材料

Cinnamomum loureirii（肉桂）、Artemisia dracunculus（龙蒿）、Laurus nobilis（月桂树）、Ocimum basilicum（罗勒）、Rosmarinus officinallis（迷迭香）和 Satureja montana（咸味）的油由比利时 PRANAROM International Company 提供。这些植物采自世界不同的地理区域，并按植物种类、通用名称和使用部位列于表 1中。

2.2. 精油的提取与鉴定

精油是通过蒸汽蒸馏提取的。这是在没有化学物质的低压下进行的

植物学名称

常用名

地点

使用的部分

香樟

肉桂

越南

吠

龙蒿

伊朗

开花的上衣

月桂

桂冠

斯洛文尼亚

叶子

罗勒

马达加斯加

开花的上衣

迷迭香

法国

开花的上衣

Satureja 蒙大拿

咸味的

法国

开花的上衣

表 1。选定的芳香植物物种的植物学名称、位置和部分使用。

除垢剂。使用 Hewlett-Packard GCD 系统通过 GC/MS 进行精油分析。HP-INNOWAX 毛细管柱（60 m × 0.25 mm，0.5 µm 膜厚）使用氦气作为载气，流量为 22 - 25 psi。GC 烘箱温度在 50°C 下保持 6 分钟，然后以 2°C/分钟的速度升至 250°C，然后在此温度下保持 20 分钟。进样器和检测器温度分别为 250°C 和 280°C，以分流模式进样，体积为 1 µl 的 5/100 油己烷溶液。在 MS 中使用通过自动调谐自动校准质量。质量范围从 m/z 30 到 350。使用具有 75,000 个光谱的 NKS 库和人员芳香库的组合进行库搜索。表 2列出了通过气相色谱分析获得的油的主要成分。

2.3. 致突变性试验

对于致突变性测试，精油以 0.2% 或 2% 的浓度溶解在 Tween-80 中，具体取决于精油的溶解度。精油以不同浓度（范围从 0.025% 到 0.3%）施用于果蝇幼虫。溶液总是在使用前立即新鲜配制。溶剂也用作阴性对照。聚氨酯（CAS 登记号：51-79-6）用作阳性对照。

2.3.1. 果蝇原种和杂交

NORR/NORR时采用高生物活性交叉；正常/正常；flr 3 /In (3LR) TM3, ri p p sep l(3)89Aa bx 34e e Bd s (flr 3 /TM3) 雌性与 NORR/NORR 杂交；正常/正常；mwh/mwh 男性。NORR 菌株（新 ORR）具有来自 DDT 抗性的 1 号和 2 号染色体，它们负责细胞色素 P450 的高组成水平 [ 21 ]。mwh 菌株是翼细胞标记多翼毛 (mwh, 3-0.3) 的纯合子。flr 3 /TM3 菌株包含翼细胞标记等位基因 flare3 (flr 3 , 3 - 38.8) 和平衡染色体 TM。Lindsley 和 Zimm 提供了有关遗传标记和描述的更详细信息 [22 ]。

2.3.2. 实验步骤

将来自高生物活性的卵收集在含有活发酵酵母的培养瓶中 8 小时。72 ± 4 小时后，用 20% NaCl 溶液从食物中收集幼虫。将幼虫转移到装有 1.5 g 果蝇速溶培养基（Carolina Biological Supply）的食物的单独小瓶中，这些食物通过 5 ml 溶解在不同浓度的 Tween-80 中的精油水合。幼虫在该培养基上喂食以进行其余发育，这对应于约 48 小时的慢性处理直至化蛹。所有处理均包括阴性溶剂对照。所有实验均在 25˚C 和 65% 相对湿度下进行。

从处理瓶中收集孵化的果蝇，并将反式杂合 (mwh flr + /mwh + flr) 基因型的果蝇储存在 70% 乙醇中。将成年果蝇的翅膀固定在载玻片上，并在 400 倍放大倍数下对显示畸形翼毛的细胞克隆进行评分。这些斑点表现为表达多翼毛 (mwh) 或耀斑 (flr) 表型的单个斑点，或者表现为具有相邻 mwh 和 flr 区域的双斑点。

2.4. 数据评估与统计分析

为了评估记录的遗传毒性作用，将处理系列的每只苍蝇的斑点频率与其同时的阴性对照进行比较。使用卡方检验进行统计分析。

C. loureirii

龙舌兰

L. nobilis

罗勒

罗汉果

蒙大拿州

a-蒎烯

1.19

4.13

0.24

26.48

1.10

莰烯

0.41

6.21

0.69

b-蒎烯

3.48

0.41

2.66

0.42

对薄荷三烯

1.48

桧烯

6.53

0.15

苯丙醛

1.32

b-月桂烯

0.10

0.94

0.20

1.50

0.89

1,8-桉树脑

38.73

4.02

10.71

1.32

柠檬烯

3.04

1.47

0.32

3.61

0.95

顺式罗勒烯

8.49

0.13

0.16

0.35

肉桂醛

81.66

反式罗勒烯

10.05

1.47

0.10

g-松油烯

0.88

0.13

1.35

7.01

对伞花烃

0.53

0.09

1.98

9.85

萜品油烯

0.40

0.73

0.16

a-钴烯

1.55

b-石竹烯

0.66

0.50

0.56

0.32

1.20

香豆素 mw = 146

2.63

乙酸肉桂酯

3.66

樟脑

0.24

2.82

1.28

芳樟醇

7.77

1.89

2.84

2.42

乙酸冰片烯

0.53

0.45

13.19

0.49

香芹酚甲醚

4.88

萜品烯-4-醇

3.49

0.60

1.18

0.91

甲基香芹酚

75.23

0.08

77.41

0.13

α-松油醇

3.21

0.20

1.32

1.88

醋酸萜烯酯

12.34

冰片

0.12

0.10

4.45

3.41

马鞭草酮

7.27

香芹酮

0.11

0.83

d-杜松烯

0.89

0.13

0.50

香叶醇

1.33

甲基丁子香酚

0.71

6.79

3.75

0.11

0.54

丁香酚

0.31

1.97

0.14

0.19

T-卡地诺

1.66

百里香酚

10.59

香芹酚

36.67

表 2。主要化学成分为肉桂、龙蒿、月桂、罗勒、迷迭香和蒙大拿香茅精油。

因此，我们区分了小单点（一个或两个细胞受影响）、大单点（两个以上细胞受影响）和双点。

3. 结果

在开始遗传毒性实验之前，首先评估毒性以确定翼斑试验中将要测试的浓度。表 3中显示的毒性是通过确定与阴性对照相比发育到成年的幼虫的分数来测量的。所有测试的六种精油在 48 小时的幼虫喂养实验中都不同程度地表现出毒性。在浓度为 0.3% 时，龙蒿、罗勒和肉桂的精油被证明对幼虫有很强的毒性，成年苍蝇都无法存活。来自 Satureja montana 的精油在此浓度下毒性较小。就他们而言，月桂和迷迭香表现出 0.3% 的弱毒性。

六种精油在慢性暴露后的果蝇翅斑试验中获得的遗传毒性研究结果如表 4所示。小单点、大单点、双点点数据

油

剂量 (%)

毒性（%）

龙蒿

0.3

100

0.2

90 - 100

0.1

25 - 50

0.05

5 - 10

罗勒

0.3

100

0.2

90 - 100

0.1

0.05

5 - 10

香樟

0.3

100

0.2

80 - 100

0.1

50 - 75

0.05

25 - 50

Satureja 蒙大拿

0.3

80 - 100

0.2

0.1

10 - 25

0.05

5 - 10

月桂

0.3

0.2

10 - 20

0.1

5 - 10

迷迭香

0.3

0.2

10 - 20

0.1

5 - 10

表 3。所测试的精油的毒性以处理过的幼虫的致死率百分比表示。

化合物

专注（％）

数量

翅膀

每翼斑点（斑点数）

小单点

大单点

双点

总名额

香樟

吐温80 0.2%

0.28 (20)

0.06 (04)

0.00 (00)

0.34 (24)

0.025

0.27一(11)

0.00一(00)

0.27一(11)

0.05

0.40一(16)

0.02一(01)

0.00一(00)

0.42一(17)

0.1

0.35一(14)

0.00一(00)

0.35一(14)

龙蒿

吐温80 0.2%

0.28 (20)

0.06 (04)

0.00 (00)

0.34 (24)

0.025

0.35一(14)

0.00一(00)

0.35一(14)

0.05

0.45一(19)

0.10一(04)

0.00一(00)

0.55一(23)

0.1

0.32一(08)

0.20一(05)

0.00一(00)

0.52一(13)

月桂

吐温-80 2%

158

0.52 (82)

0.04 (06)

0.00 (00)

0.56 (88)

0.1

0.43一(17)

0.02一(01)

0.00一(00)

0.45一(18)

0.2

0.34一(11)

0.09一(03)

0.00一(00)

0.43一(14)

0.3

0.41一(16)

0.03一(01)

0.00一(00)

0.44一(17)

罗勒

吐温-80 2%

158

0.52 (82)

0.04 (06)

0.00 (00)

0.56 (88)

0.025

0.32一(13)

0.00一(00)

0.32一(13)

0.05

0.50一(20)

0.05一(02)

0.00一(00)

0.55一(22)

0.1

0.30一(12)

0.02一(01)

0.00一(00)

0.32一(13)

迷迭香

吐温-80 2%

158

0.52 (82)

0.04 (06)

0.00 (00)

0.56 (88)

0.1

0.45一(18)

0.10一(04)

0.00一(00)

0.55一(22)

0.2

0.35一(14)

0.02一(01)

0.00一(00)

0.37一(15)

Satureja 蒙大拿

吐温-80 2%

158

0.52 (82)

0.04 (06)

0.00 (00)

0.56 (88)

0.05

0.68一(25)

0.08一(03)

0.00一(00)

0.76一(28)

0.1

0.45一(15)

0.06一(02)

0.00一(00)

0.51一(17)

聚氨酯

蒸馏水

0.30 (12)

0.03 (01)

0.00 (00)

0.33 (13)

5毫米

2.53天(101)

0.65天(26)

0.27摄氏度（11）

3.45天(138)

表 4。长期接触精油后获得的翼斑数据。

p > 0.05; c p < 0.01；d p < 0.001。

连同斑点总数一起呈现。使用高生物活性杂交的幼虫评估每种化合物的不同浓度。将化合物溶解在 Tween-80 0.2% 或 Tween-80 2% 中。将氨基甲酸酯溶解在蒸馏水中。对于每种精油，将处理过的系列与对应于所用相应溶剂检测到的自发突变汇总结果的阴性对照进行比较。Tween-80 2% (0.56) 中获得的总 Spots 的自发频率高于 Tween-80 0.2% (0.34) 中的值，具有统计学差异。此外，用 Tween-80 0.2% 和水 (0.33) 检测到的突变之间没有显着差异。5 mM 氨基甲酸乙酯显着增加 (p < 0.001) 小单点、大单点和点总数。小尺寸克隆的诱导比大克隆的诱导更重要。此外，在存在该促诱变剂的情况下，双斑点的频率也增加了 (p < 0.01)。

为所有六种精油选择大约和/或低于 LC50 的浓度来进行遗传毒性实验。记录斑点的数量以及它们的类型和大小。在 SMART 测定中可以观察到两种基本类型的斑点，单斑点和双斑点。在我们的治疗中，小的单点占主导地位；大的单斑点很少见，而双斑点则不存在。大多数 mwh 克隆都是小尺寸的；然而，不存在大于 32 个细胞的克隆。在六个不同系列的单个斑点中，仅观察到很少的 flr 斑点；所有其他单个点都显示 mwh 表型，部分原因是检测到的大多数克隆都是小尺寸的，并且 flr+ 的突变事件不会在小于特定尺寸的克隆中表达自身 [ 23 ]。此外，flr 3可能起因于相对罕见的事件，如位点的点突变、间质缺失和可能的双交换 [ 24 ]。双斑点不存在，部分原因是只有发生在 flr 基因座和着丝粒之间的罕见有丝分裂重组事件才会产生这种类型的斑点 [ 13 ]。

来自表4中总结的统计处理数据可以指出的是，所测试的精油不会导致三类斑点中任何一种的频率显着增加。尽管与阴性溶剂对照相比，使用 Satureja montana 和 Artemisia dracunculus 精油观察到突变频率增加；但是这种突变频率的增加并不被认为具有生物学意义，因为没有剂量反应效应的证据。还检测到来自 Cinnamomum loureiriii 的精油有 0.05% 的微弱增加，这在统计学或生物学上仍然不显着。但是，测试的其他精油的频率没有增加。此外，观察到这些油的自发突变率降低，

4。讨论

在黑腹果蝇幼虫暴露于所研究的精油后，观察到显着的毒性作用。许多植物次生产物以其高毒性而著称，它们参与了植物对食草动物和昆虫的防御机制。这是精油的情况，其杀虫作用已经得到证实 [ 5 ] [ 25 ]。此外，SMART 检测中使用的菌株的特点是 P450 水平较高 [ 21 ]，众所周知，P450 在多种杀虫剂和植物毒素的代谢中发挥作用 [ 26 ]。

测试的所有六种精油都没有遗传毒性。这些结果与其他作者先前使用不同测定法显示的结果一致，证明大量精油不存在遗传毒性，并指出只有少数精油具有遗传毒性 [ 10 ] [ 12 ] [ 27 ] - [ 32 ]。但必须指出的是，还发现了证明许多精油具有遗传毒性作用的阳性结果 [ 9 ]] 。报告了我们研究中测试的一些油的正面和负面结果；用枯草芽孢杆菌 Rec-assay 和沙门氏菌/微粒体回复试验研究了龙蒿和蒙大拿 Satureja 精油的遗传毒性；只有龙蒿油在 Rec 检测中有活性，但在沙门氏菌检测中没有 [ 29] 。关于我们的结果，龙蒿精油在果蝇翅斑试验中未证实其遗传毒性潜力，即使在用这种精油处理时检测到的斑点频率略有增加，但没有统计学意义。肉桂皮油在 Ames 沙门氏菌逆转试验、不含 S9 的枯草芽孢杆菌 DNA 修复试验（Rec 试验）和大肠杆菌 WP2 uvrA 逆转试验中进行了研究，并在 3 种微生物试验系统中显示阴性结果 [ 27 ] . 在我们的研究中，SMART 分析证实了肉桂精油的这种负面影响。然而，罗勒精油在体外大鼠肝细胞和大鼠肝脏中的体内试验证明了罗勒精油的遗传毒性潜力 [ 33] 但根据我们的结果，不能使用 SMART 分析。

另一方面，精油的主要成分已通过一系列遗传毒性试验测试其致突变性，并产生了相互矛盾的结果。在埃姆斯沙门氏菌逆转试验和大肠杆菌 WP2 uvrA 逆转试验中发现了可以证实我们结果的负突变效应，甲基胡椒酚在龙蒿精油和罗勒精油中的含量分别为 75.23% 和 77.41%。 %, 并与肉桂醛, 肉桂精油的主要化合物 (81.66%) [ 27 ] [ 34 ] . 在 SOS 染色测试中，肉桂醛未造成任何 DNA 损伤 [ 35 ]。然而，该化合物在小鼠肝脏 S9 的 TA100 沙门氏菌菌株中表现出微弱的诱变反应 [ 36]，并在大肠杆菌DNA修复试验中给出阳性反应[ 35 ]。据报道，肉桂醛在果蝇性连锁隐性致死突变试验和中国仓鼠成纤维细胞染色体畸变试验中呈阳性 [ 37 ]。在使用肉桂醛和甲基胡椒酚进行的枯草芽孢杆菌 DNA 修复试验（Rec-assay）中也检测到阳性效果 [ 27 ]。1,8-桉叶素是一种在月桂油中发现的重要分子，在迷迭香精油中含量更高，沙门氏菌试验未显示任何诱变作用 [ 32 ]。使用相同的测试筛选百里酚的诱变活性；这种重要的咸味油化合物未检测到任何影响 [ 34] 。百里酚还在体外对人牙髓成纤维细胞进行了测试，未发现任何遗传毒性作用 [ 38 ]。然而，在用百里酚和香芹酚（香精油的主要成分）进行的 DNA 修复试验中观察到微弱的显着遗传毒性作用 [ 35 ]。在 SOS 染色测试中，香芹酚和百里酚均未呈阳性 [ 35 ]。

d-柠檬烯的遗传毒性试验呈阴性，它以不同的比例存在于所有精油中 [ 39 ]。此外，使用大鼠骨髓细胞遗传学体内测定 [ 40 ] 没有观察到月桂烯诱导染色体断裂的证据，并且没有检测到冰片对鼠伤寒沙门氏菌的致突变作用 [ 34 ]。然而，在不添加和添加 S9 混合物的情况下，许多测试的精油中存在的萜品醇导致 TA102 沙门氏菌测试菌株的 his + 回复体数量略有但与剂量相关的增加 [ 32 ]。就它们而言，甲基丁香酚和丁香酚在 Ames 试验和大肠杆菌 WP2 uvrA 逆转试验中未显示致突变性 [ 27 ][ 34 ]] 。在体外的人牙髓成纤维细胞中，丁香酚未显示出任何遗传毒性作用 [ 38 ]。但使用小鼠骨髓微核试验，丁香酚在 400 和 600 mg/kg 剂量下显示出显着的微核诱导作用 [ 41 ]。丁子香酚的诱变能力也通过小鼠体内真核试验得到证实 [ 42 ]。

因此，对精油成分的遗传毒性的评估显示的数据可能因生物体和所用的遗传毒性测定而异。此外，本研究中获得的阴性结果表明，所研究的测试浓度的精油在黑腹果蝇中没有遗传毒性。这并不总是与其某些选民的数据一致。这可以用当一些抗诱变化合物可以存在于测试的油中并对抗精油混合物中其他成分的诱变作用时的拮抗现象来解释。建议进行进一步的实验来评估这些油或其某些成分可能的抗原毒性特性。

致谢

这项工作得到了 PRANAROM 国际公司和比利时瓦隆地区部的支持（Direction générale des technologies, de la recherche et de l'énergie, Promotion de l'innovation technique, Jambe-Namur）。

缩略语

SMART：体细胞突变重组检测

C. loureirii：Cinnamomum loureirii

A. dracunculus：龙蒿

L. nobilis: Laurus nobilis

O. basilicum：Ocimum basilicum

R. officinallis：迷迭香

S. montan：Satureja montana

GC/MS：气相色谱/质谱

笔记

*通讯作者。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

参考

[ 1 ] Achinewhu, SC、Ogbonna, CC 和 Hart, AD (1995) 用作食物的本地野生草本植物、香料、坚果和叶类蔬菜的化学成分。人类营养植物食品，48, 341-348。

[ 2 ] Kalemba, D. 和 Kunicka, A. (2003) 精油的抗菌和抗真菌特性。当前药物化学，10, 813-829。

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